3.2基因工程的基本操作程序1.轉化指目的基因進入受體細胞內，并在受體細胞內穩定維持和表達的過程，此處“轉化”與肺炎鏈球菌轉化實驗中的“轉化”含義相同，實質都是基因重組。2.轉化的受體細胞受體細胞將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農桿菌轉化法花粉管通道法——顯微注射法——Ca2+處理法03將目的基因導入受體細胞①用______________將________________________直接注入_______中。微量注射器含目的基因的DNA溶液子房②在植物受粉后的一定時間內，剪去______，將____________滴加在_________上，使目的基因借助________________進入_______。柱頭DNA溶液花柱切面花粉管通道胚囊子房花粉柱頭花粉管精子卵細胞胚囊（1）將目的基因導入植物細胞--花粉管通道法我國科學家獨創的將Bt基因導入棉花細胞的方法花粉管通道法是我國科學家周光宇在1987年獨創的。將重組DNA滴加到植物受粉后形成的花粉管通道內，進入卵細胞、合子或早期胚胎細胞中。此方法直接、簡便且經濟，已應用于水稻、小麥、棉花、大豆等多種植物中。03將目的基因導入受體細胞冠癭瘤農桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物和裸子植物的受傷部位，并誘導產生冠癭瘤等。（1）將目的基因導入植物細胞農桿菌轉化法03將目的基因導入受體細胞②農桿菌特點：a.能在自然條件下侵染_____________和___________，而對大多數____________沒有侵染能力。雙子葉植物裸子植物單子葉植物b.農桿菌細胞內含有______，當它侵染植物細胞后，能將______上的______（____________）轉移到被侵染的細胞，并且將其________________________Ti質粒Ti質粒T-DNA可轉移的DNA整合到該細胞的染色體DNA上將目的基因插入__________________中，通過農桿菌的________作用，就可以使目的基因__________________并整合到受體細胞的染色體DNA上，使目的基因能夠維持穩定和表達。③利用農桿菌進行轉化的思路：Ti質粒的T-DNA轉化進入植物細胞（1）將目的基因導入植物細胞--農桿菌轉化法隨著轉化方法的突破，農桿菌侵染水稻、玉米等多種單子葉植物也取得了成功。載體：農桿菌Ti質粒（T-DNA)03將目的基因導入受體細胞閱讀P81資料卡，完成以下填空表現出新性狀的植株植物組織培養第一次導入第二次導入第一次拼接第二次拼接將目的基因拼接到Ti質粒的T-DNA上。(非人工操作)是指含目的基因的T-DNA被拼接到受體細胞的染色體DNA上。(非人工操作)含目的基因的T-DNA導入受體細胞。將含目的基因的Ti質粒重新導入農桿菌。Ti質粒T—DNA目的基因構建基因表達載體重組Ti質粒轉入農桿菌導入植物細胞農桿菌轉化法示意圖轉化的具體方法：a.可以將新鮮的從葉片上取下的圓形小片__________________，然后________________，并_____________。受體細胞為_______與農桿菌共培養篩選轉化細胞再生成植株體細胞b.可以將_______直接浸沒在___________________中一段時間，然后培養植株并獲得_______，再進行________、_________等。受體細胞為_______花序含有農桿菌的溶液種子篩選鑒定受精卵（1）將目的基因導入植物細胞--農桿菌轉化法03將目的基因導入受體細胞03將目的基因導入受體細胞操作程序：（2）將目的基因導入動物細胞--顯微注射法構建基因表達載體并提純利用顯微注射將基因表達載體注入動物的受精卵中早期胚胎培養胚胎移植（移植到同期發情的母畜子宮內）獲得具有新性狀的動物03將目的基因導入受體細胞拓展：【其他方法】科學家也用病毒DNA

與目的基因一起構建的載體，去感染受體動物細胞，也能使目的基因導入動物細胞內。如慢病毒載體、腺病毒載體等。（2）將目的基因導入動物細胞03將目的基因導入受體細胞選講（3）將目的基因導入微生物細胞----Ca2+處理法過程Ca2+處理細胞感受態細胞(細胞膜通透性增強)表達載體與感受態細胞混合感受態細胞吸收DNA分子03將目的基因導入受體細胞Ca2+的作用：使細胞處于一種能吸收周圍環境中DNA分子的生理狀態（感受態細胞）。種類項目植物細胞動物細胞微生物細胞常用方法農桿菌轉化法顯微注射法Ca2＋處理法受體細胞體細胞受精卵原核細胞轉化過程目的基因插入Ti質粒的T-DNA上→導入植物細胞→整合到受體細胞DNA中→表達目的基因表達載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發育→獲得具有新性狀的動物Ca2＋處理細胞→感受態細胞→表達載體與感受態細胞混合→感受態細胞吸DNA分子【小結】03將目的基因導入受體細胞成熟mRNA相應酶去除內含子轉錄翻譯真核基因：編碼區（外顯子+內含子）多肽鏈前體mRNA蛋白質加工如果把一個真核生物的基因導入原核細胞中表達，一定會產生原來的蛋白質嗎？提示：一般不能產生原來的蛋白質原因：①原核生物細胞里沒有相應的酶來去除內含子；②原核生物沒有真核的蛋白質加工系統（如內質網、高爾基體等）03將目的基因導入受體細胞選講將基因表達載體導入受體細胞后，如何判斷導入是否成功？即使導入成功，如何判斷目的基因是否可以正常表達？檢查目的基因進入受體細胞后，是否穩定維持和表達其遺傳特性。思考你認為可以從哪些方面/水平進行檢測？（1）檢測目的基因是否已經導入（檢測DNA）（2）檢測目的基因是否已經轉錄（檢測mRNA）（3）檢測目的基因是否已經表達（檢測蛋白質）（4）檢測目的基因是否已經發揮作用（檢測個體是否獲得某種特性）04目的基因的檢測與鑒定檢測轉基因生物染色體DNA上是否插入了目的基因檢測方法：利用PCR對目的基因擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定檢測內容及方法----分子水平檢測04目的基因的檢測與鑒定例：提取棉花細胞DNA用與Bt基因相關的引物進行PCR擴增對擴增產物進行檢測①制作基因探針；②提取受體細胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養液；③高溫變性處理，使之全部變為單鏈，觀察是否出現雜交DNA片段。探針與受體中的DNA分子雜交出現雜交帶：不出現雜交帶：已插入未插入或PCR擴增后用DNA分子雜交技術檢測DNA分子雜交技術：

DNA分子雜交技術原理（基因探針）變性1、提取目的基因的DNA片段用放射性同位素標記或熒光標記，作為基因探針；2、提取受體細胞全部DNA并用PCR擴增，與基因探針置于同一培養液；3、高溫變性處理，使之全部變為單鏈，觀察是否出現雜交DNA片段。若出現雜交帶，則導入成功。04RT-PCR2.檢測目的基因是否轉錄出了mRNA檢測內容及方法----分子水平檢測04目的基因的檢測與鑒定檢測方法：PCR擴增后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測或分子雜交技術檢測瓊脂糖凝膠電泳過程:提取生物材料RNA逆轉錄成DNA后檢測是否有目的基因。RNA分子雜交技術1、制作基因探針；2、探針和轉基因生物的mRNA雜交,若出現雜交帶,表明轉錄出了mRNA。變性探針15N15N轉基因生物的mRNA雜交分子（可檢測）原理：堿基互補配對原則3.檢測目的基因是否翻譯——通過抗原-抗體雜交檢測從轉基因生物提取出來的蛋白質和相應的抗體進行雜交，如果出現雜交帶，說明目的基因已經翻譯。蘇云金芽孢桿菌提取Bt毒蛋白注射小鼠體內抗體標記抗體提取蛋白抗原抗體雜交脫分化04目的基因的檢測與鑒定檢測目的基因是否表現出相應的性狀檢測抗蟲棉是否具有抗蟲性狀采摘抗蟲棉葉片飼喂棉鈴蟲觀察棉鈴蟲存活情況04目的基因的檢測與鑒定檢測內容及方法----個體水平鑒定轉基因生物鑒定方法成功標志抗蟲植物抗病毒（菌）植物抗鹽植物抗除草劑植物獲取目的基因產物的轉基因生物飼喂害蟲（抗蟲接種實驗）害蟲死亡病毒（菌）接種實驗未染病鹽水澆灌正常生長噴灑除草劑正常生長提取細胞產物與天然產品進行功能活性比較功能、活性正常抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等檢測內容及方法----個體水平鑒定04目的基因的檢測與鑒定類型步驟檢測內容方法分子水平檢測第一步轉基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因PCR或DNA分子雜交技術第二步目的基因是否轉錄出mRNAPCR或分子雜交技術第三步目的基因是否翻譯形成蛋白質抗原-抗體雜交技術個體水平鑒定抗蟲或抗病的接種實驗抗性以及抗性程度

抗性檢測，基因工程產品與天然產品的功能活性比較

功能活性。檢測內容及方法總結:03目的基因的檢測與鑒定04目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達載體的構建將目的基因導入受體細胞目的基因的檢測與鑒定前提核心關鍵保證利用PCR獲取和擴增目的基因、啟動子、終止子、標記基因農桿菌轉化法(植物)、顯微注射法(動物)、感受態細胞轉化法(微生物);分子檢測：是否插入、轉錄、翻譯個體水平：是否具有抗性以及抗性強度等。第一步第二步第三步第四步半期復習周末完成3-2大書1.在實際種植過程中，棉鈴蟲是否對轉Bt基因的抗蟲棉產生了嚴重的抗性？證據是什么？

科研人員對長江流域種植的轉基因抗蟲棉進行了監測，2011年的數據顯示，大部分轉基因抗蟲棉品種的抗蟲性屬于中抗及高抗水平。2013年的數據表明，如果棉田周圍存在大量天然庇護所，靶標害蟲棉鈴蟲、紅鈴蟲等并未對轉Bt基因的抗蟲棉產生明顯抗性。在我國、澳大利亞、印度等國的多個實驗室中，通過毒素的連續抗性篩選，已經培育出多個高抗水平的轉基因抗蟲棉品種。

到社會中去2.科研工作者在沒有發現棉鈴蟲出現抗性之前，就應該想辦法應對。他們想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有哪些？這些措施的原理是什么？有效嗎？

科研人員想出的延緩棉鈴蟲對Bt抗蟲蛋白產生抗性的措施有很多，主要可以分為以下幾個方面。（1）基因策略。該策略是在分子水平上提高轉基因抗蟲棉的抗蟲性和抗蟲持久性。包括在棉花中轉入多個殺蟲基因、構建組織特異性表達的啟動子、提高殺蟲基因的表達量等。（2）田間策略。這是在種植時采取的措施，如提供庇護所、與其他作物（非抗品種）輪作或套種等。（3）國家宏觀調控策略。該策略包括實施分區種植管理、加強抗性監測、進行嚴格的安全生評價等。

到社會中去【例5】用PCR方法檢測轉基因植株是否成功導入目的基因時，得到以下電泳圖譜，其中1號為DNA標準樣液(Marker)，10號為蒸餾水。PCR時加入的模板DNA如圖所示。據此做出分析不合理的是(

)A.PCR產物的分子大小在250至500bp之間B.3號樣品為不含目的基因的載體DNAC.9號樣品對應植株不是所需的轉基因植株D.10號的電泳結果能確定反應體系等對實驗結果沒有干擾B選講【例6】下圖為轉基因抗凍番茄培育過程的示意圖（其中ampr為抗氨芐青霉素基因）。下列敘述錯誤的是（）A．④過程中可利用目的基因作為探針對植株進行篩選B．可同時選用限制酶PstI、SmaI對含目的基因的DNA進行剪切C．過程②可采用農桿菌轉化法將含目的基因的表達載體導入受體細胞D．質粒上的抗性基因有利于篩選含目的基因的細胞和促進目的基因的表達D選講【例7】通過引物設計運用PCR技術可以實現目的基因的定點突變.圖1為基因工程中獲取突變基因的過程，其中引物1序列中含有一個堿基T不能與目的基因片段配對，但不影響引物與模板鏈的整體配對，反應體系中引物1和引物2的5'端分別設計增加限制性內切酶a和限制性內切酶b的識別位點.有關敘述正確的是（

）A.兩種引物中設計兩種限制酶識別位點有利于目的基因的定向插入B.在PCR反應體系中還需要加入4種游離核糖核苷酸、解旋酶、Taq酶、ATP等C.第2輪PCR，引物1與圖中②結合并且形成兩條鏈等長的突變基因D.在第3輪PCR結束后，含突變堿基對且兩條鏈等長的DNA占1/8A選講【例9】實時熒光RT-PCR可用于RNA病毒的核酸檢測，其原理是∶在PCR復性過程中探針和引物一起與模板結合，探針兩側分別帶有熒光基團和抑制熒光發出的淬滅基團，新鏈延伸過程中，DNA聚合酶會破壞探針，導致熒光基團與淬滅基團分離而發出熒光。利用RT-PCR進行核酸檢測的相關過程如圖所示。下列說法錯誤的是（

）A．做RT-PCR之前，需要先根據cDNA的核苷酸序列合成引物和探針B．RNA不能作為PCR擴增的模板，故需要將樣本中的RNA反轉錄為DNA后再進行擴增C．若檢測結果有強烈熒光信號發出，說明被檢測者沒有感染病毒D．病毒的檢測還可以