熒光定量實驗設計及優化PCR的建立與優化核酸純化與逆轉錄PCR試劑體系引物、探針的設計第2頁,共29頁，2024年2月25日，星期天3長度 16-24bases（引物）序列 不能有以下情況：任意2個引物或探針之間的序列互補引物或探針本身有二級結構連續的>GGG，引物的5’端有G引物3’端最后5個堿基有2個以上的G或C引物3’端最后1個堿基為AGC含量 40-60%GC

GC/AT分布大致均衡,C含量>G探針復性溫度 65－70°C引物復性溫度60－65°CPCR引物與探針第3頁,共29頁，2024年2月25日，星期天標記

淬滅基團采用無熒光背景的如BHQ,不要用tamraPCR產物長度 50－150bpDesign primerdesignsoftware，選擇序列保守區域如果保守區域太短，可以在引物中考慮引入LNA提高Tm

探針可以考慮引入LNA或改用MGB或自淬滅taqman探針簡并引物或探針需要同時考慮多種情況下的Tm高低純化與否 PAGE/HPLC

PCR引物與探針第4頁,共29頁，2024年2月25日，星期天SNP的Taqman雙色檢測中，突變探針一般Fam標記相對定量分析中內參基因一般Hex標記(例如Roche的UPL相對定量解決方案)

對檢測要求更高的建議Fam標記(靈敏度或者定量vs定性)

擴增效率較差的建議Fam標記

PCR引物與探針第5頁,共29頁，2024年2月25日，星期天ReactionConditions

PrimersandProbesConcentrationRange(finalcon.)Primers: 0.1μM–1.0μMeachProbes: 0.1μM–0.5μMStandardConcentrations(finalconc.)Primers: 0.5μMeachProbes: 0.2μMExample:UniversalProbeLibraryassayHigherprimers/probeconcentrationsgivebettersignaltonoiseratio(higherfluorescencesignalintensitiy)OnlyminorinfluenceonCpwhenusedinmediumconcentrationranges第6頁,共29頁，2024年2月25日，星期天PCR的建立與優化核酸純化與逆轉錄PCR試劑體系引物、探針的設計第7頁,共29頁，2024年2月25日，星期天建立新的PCR體系:

GeneralHints模板 -DNA或cDNA為模板對照-NTC(notemplatecontrol)每個探針引物組合 -陽性對照(如果可能)分析 -擴增:sensitivityandefficiencyofPCR(crossingpoints)-熔解曲線分析(SYBRGreenIformat):檢測引物二聚體或其它非特異性擴增凝膠電泳:驗證非特異性擴增meltingcurve(雜交探針等模式):突變檢測或亞型分析第8頁,共29頁，2024年2月25日，星期天StandardConditionsinPCRMgCl2Concentration:2-5mM第9頁,共29頁，2024年2月25日，星期天BasicOptimizationinPCRUseanytemplatenucleicacid(NA)suitableforPCR,sufficientlypurifiedandfreeofPCRinhibitorsTemplateConcentration: 建議測試多個稀釋度

(最少2個梯度,10^2)genomicDNA 50ng-5pgplasmidDNA approx.106copies

RNA ≤500ngtotalRNAor100ngmRNAcDNA ≤50ngequivalentoftotalRNA，RTproductundiluted,1:10and1:100dilutionsNAStorageStorenucleicacidsinhighconcentrationsandaliquotsForlowtemplateconcentrations,usesiliconizedtubesandadd

carrierNA(10ng/μl),e.g.MS2RNA第10頁,共29頁，2024年2月25日，星期天BasicOptimization:

MgCl2Titration

MgCl2Titration:2-5mMFormat:SYBRGreenILCFastStartDNAMaster第11頁,共29頁，2024年2月25日，星期天BasicOptimization:

TemplateConcentration

模板濃度過高會抑制PCR

TemplateDNA

undilutedand1:10dilutionFormatSYBRGreenILIghtCycler?DNAMasterNTCsample1originalsample11:10sample2originalsample21:10第12頁,共29頁，2024年2月25日，星期天SYBRGreenIFormat

PCRAnalysisExample

模板拷貝數越低，越容易出現引物二聚體QuantificationMeltingCurveAnalysis第13頁,共29頁，2024年2月25日，星期天Optimization:

InfluenceofPCRInhibitors

PCR抑制物可通過適當稀釋樣品降低對其對PCR的影響NTCcDNAoriginalcDNA1:2cDNA1:4cDNA1:20TemplatecDNA

undiluted,1:2,1:4,1:20dilutionsFormatSYBRGreenILightCycler?DNAMaster第14頁,共29頁，2024年2月25日，星期天FurtherOptimizationinPCR檢測靈敏度和信號強度可以通過調整下列參數得以改進第15頁,共29頁，2024年2月25日，星期天PCR的建立與優化核酸純化與逆轉錄PCR試劑體系引物、探針的設計第16頁,共29頁，2024年2月25日，星期天AAAAAAAAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同豐度組織名稱樣品量總RNA含量高豐度肝臟1mg2-4μg脾臟1mg心臟1mg中豐度大腦1mg0.05-2μg胚胎1mg腎臟1mg肺1mg低豐度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高豐度成纖細胞1050.5-1μg人白細胞105細胞中RNA的種類和含量第17頁,共29頁，2024年2月25日，星期天“chaotropicsalts”inbindingbufferRoche手工提取RNA的試劑盒細胞和組織HighPureRNAIsolationKitHighPureRNATissueKitTriPureIsolationReagent甲醛固定石蠟包埋組織和石蠟包埋組織HighPureFFPERNAMicroKitHighPureRNAParaffinKit提取mRNAmRNAIsolationKitmRNACaptureKitHighPuremiRNAIsolationKit病毒RNAHighPureViralRNAKit*HighPureViralNucleicAcidKit第18頁,共29頁，2024年2月25日，星期天RNA操作注意事項RNA酶（Rnase）是導致RNA降解最主要的物質。此酶非常穩定，在一些極端的條件下只可暫時失活，但限制因素去除后又迅速恢復活性。常規高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的Rnase完全失活。1.Rnase廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時必須戴手套2.

Rnase可存在于取液器中，因此設置RNA專用pipettor,或者采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內部和外部，可基本達到要求。3.塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

a.盡量已標明RNase-free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必處理，

處理步驟：在浸泡塑料制品的容器中，加入終濃度為0.05%~0.1%的DEPC-H2O，室溫放置過夜，第二天將DEPC-H2O倒出，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。b.玻璃和金屬物品250℃烘烤3小時以上或者180℃烘烤8小時以上第19頁,共29頁，2024年2月25日，星期天RNA操作注意事項

選擇新鮮血液，不得超過4小時

選擇新鮮、生長旺盛的組織

選擇處于生長旺盛時期的細胞可將新鮮血液先進行紅細胞裂解，得到白細胞，然后加入一定量的細胞裂解液/TRNzol，-70℃保存較長時間

推薦使用專門的RNA樣品儲存液進行儲存

去掉培養基，加入一定量RNA提取試劑，-70℃保存較長時間RNA應分裝后凍存于-70冰箱，樣品不能反復凍融長期保持：RNA提取步驟進行到在70%乙醇洗滌時，停止實驗，讓RNA保存于70%乙醇中第20頁,共29頁，2024年2月25日，星期天RNA的評價與鑒定純度（OD260/OD280

）：OD260/OD280<1.9說明有蛋白污染OD260/OD280＝1.9～2.1說明純度很好OD260/OD280>2.1說明有部分降解得率（OD260）Yield＝OD260×稀釋倍數×40ng/ul紫外分光光度計檢測第21頁,共29頁，2024年2月25日，星期天1％瓊脂糖，6V/cm，15min，上樣1～3ul

電泳檢測M12M12DNA殘留蛋白殘留RNA的評價與鑒定第22頁,共29頁，2024年2月25日，星期天RT反應主要組成成分ReverseTranscriptase

AMVReverseTranscriptase(AvianMyeloblastosisVirus)48–55°C

M-MuLVReverseTranscriptase(MoloneyMurineLeukaemia)37–42°CTranscriptorReverseTranscriptase(recombinant,E.coli.)upto65°C引物（OligodTorRandomPrimersorGeneSpecificPrimers)Sequence-specificprimersRandomHexamerPrimersandanchoredoligo(dT)NRNA模板第23頁,共29頁，2024年2月25日，星期天TranscriptorReverseTranscriptaseTranscriptorreversetranscriptaseAbilitytosynthesizefragmentsupto14kb(fulllengthcDNA)Reversetranscriptionofdifficulttemplates(e.g.,GC-richRNAtemplates)duetothermostabilityupto65°CRNaseHactivity:degradesRNAinRNA:DNAhybridTranscriptorRTInvitrogenSuperscriptIIInvitrogenSuperscriptIIIMaxProductsize14kb12.3kb12.3kbReactiontime30mins50mins30-60minReactiontemperature42-65℃42℃50-55℃Sensitivity50pgtotalRNA1ngtotalRNA10pgRNAGC-richtemplateYESNoinfoNoinfoRNaseHactivityYESReducedReduced第24頁,共29頁，2024年2月25日，星期天一步法RT-PCR

VS.二步法RT-PCR2-stepRT-PCRreversetranscriptionandPCR-amplificationseparately1-stepRT-PCRreversetranscriptionandPCR-amplificationinonereaction

everythingforreversetranscriptioneverythingforPCR108copiesofthesequenceofinteresteverythingforreversetranscriptionNewlysynthesizedcDNAcDNAtogetherwitheverythingforPCR108copiesofthesequenceofinterest第25頁,共29頁，2024年2月25日，星期天一步法和二步法RT-PCR優點比較一步法RT-PCR的優點二步法RT-PCR的優點降低污染的風險SingletubeReactionNotransfer/openingrequiredAutomationispossible可以分別優化RT和PCR反應條件Efficientandaccurateamplification增加了靈敏度和特異性Sequence-specificprimersEntirecDNAsampleaspCRtemplate更加靈活AllowschoiceofprimerscDNAfromasingleRTcanbeusedinseveralPCRsWidechoiceofRTandPCRenzymes減少反應時間FewerpipettingstepsReducedtotaltimeofRT-PCR可以最大擴增到14kbAmplifyRNAsequencesupto14kb第26頁,共29頁，2024年2月25日，星期天TranscriptorHiFicDNASynthesisKitFeaturesBlendofTranscriptorenzymeandaproofreadingproteinAchieve7-foldhigherfidelitycomparedtonormalreversetranscriptasesObtainfull-lengthcDNAsynthesisinonly10minDetectaslowas10pgtemplateRNAApplicationsSequencingtranscriptomesQuantitativeRT-PCRapplicationsRNAsplicinganalysisCloninggenesofinterestGeneratingcDNAlibrari