關于基因診斷與基因治療2024/4/252主要內容第一部分基因診斷第二部分基因治療第2頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/253概念：

基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定DNA序列。基因的改變，會導致各種表型的改變，進而引起疾病的發生。

將基因或其組成部分發生異常的疾病統稱為基因病。第3頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/254基因病分為三大類：一、單基因病：由單個基因突變引起的一類疾病。如：血友病、地中海貧血等。二、多基因病：由多個基因突變綜合作用引起的疾病。如：惡性腫瘤、高血壓、動脈硬化、糖尿病、先天畸形等。三、獲得性基因病：指外源基因（DNA）侵入，在機體產生疾病，一旦將其清除便可痊愈。如：艾滋病及各種微生物感染病。第4頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/255第一部分基因診斷（DNAdiagnosis）一、基因診斷的概念和基本概況臨床診斷生化學診斷免疫學診斷臨床疾病診斷四種方式：以疾病表型改變為依據。（細胞形態結構變化、代謝產物異常、特定蛋白分子識別差異等）基因診斷對患者基因直接分析第5頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/256基因診斷基因蛋白質性狀生化診斷基因診斷臨床診斷第6頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/257基因診斷定義（概念）：

基因診斷是利用現代分子生物學和分子遺傳學的技術方法，直接檢測患者體內基因結構及其表達水平是否正常，從而對疾病作出診斷或輔助診斷的方法。基因診斷是在DNA/RNA水平檢測分析基因的存在、結構變異和表達狀態，與傳統診斷方法比較有其特點：第7頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/258基因診斷的特點：1、病因診斷：直接瞄準病理基因，不僅對表型出現的疾病作出診斷，還可能發現潛在的致病因素，如:確定有遺傳家族史的人攜帶致病基因。2、特異性強、靈敏度高：選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴增PCR技術。3、穩定性高4、診斷范圍廣，適應性強目的基因是否處于活化狀態均可。樣品可長期保存。可檢測正在生長的病原體或潛在病原體。（與以疾病表型改變為依據的診斷技術相比）第8頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/259基因診斷的基本概況：伴隨分子生物學理論技術的發展而建立和發展。DNA雙螺旋遺傳密碼破譯DNA重組癌基因與抑癌基因研究地中海貧血病基因治療和逆轉錄病毒載體開發

PCR、分子雜交等一系列技術發展第9頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2510二、基因診斷的對象1、病原生物的侵入病原體：病毒、支原體、細菌、寄生蟲檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學方法、基因診斷等。尤其是當無抗體時，基因診斷成為唯一手段。2、先天遺傳性疾病遺傳性疾病:發病的原因為特定基因的突變。第10頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2511腫瘤的發生：

發病機理尚不清。

初步認為是個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3、后天基因突變引起的疾病

（1）用核心順序的串聯重復序列組成探針進行雜交研究，可同時檢出具有高度多態性位點。（2）用southern雜交得到DNA指紋圖譜個體識別、親子鑒定、法醫物證4、其他遺傳穩定，個體特異，因而用于法醫和親子鑒定。第11頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2512基因診斷的基本策略：1、檢測已知的能產生某種特定功能蛋白的基因

這些基因根據其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測定，致病時的基因改變亦較清楚。如：已被克隆的病毒、細菌、霉菌和寄生蟲的基因、與致病有關的癌基因、抗癌基因、

地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因。第12頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25132、檢測與某種遺傳標志連鎖的致病基因遺傳連鎖－－同一染色體相鄰的二個或二個以上的基因或限制性酶切位點，由于位置十分靠近，在遺傳時分離幾率很低，常一起遺傳稱連鎖。染色體遺傳連鎖圖－－用限制性內切酶酶切位點作遺傳標志，定位與之相連鎖的正常基因與致病基因，建立相應的遺傳連鎖圖譜。定位性克隆－－根據遺傳連鎖圖進行定位性克隆，比較正常和異常基因的差別，可找出導致遺傳病的分子缺陷。定位性克隆策略是當前基因診斷的重要基礎。第13頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25143、檢測表型克隆基因針對多基因病（如：重度肥胖、哮喘、高血壓、癲癇、精神病、多種自身免疫性疾病）。表型克隆技術－－是將有關表型與基因結構結合，直接分離該表型的相關基因，并對疾病相關的一組基因進行克隆，然后用作多種探針，來診斷多基因遺傳病。該策略既不需預先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受基因數目及其相互作用方式的影響。方法：1、DD-RT-PCR：分析正常和異常基因組尋找兩者之間的差異序列2、基因組錯配篩選技術：尋找兩者的全同序列，分離、鑒定與疾病相關的基因，確定導致疾病的分子缺陷第14頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2515基因診斷的基本步驟：1、獲得待檢樣品：提取核酸（PCR提高靈敏度)2、制備和標記核酸探針3、基因檢測分析第15頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2516三、基因診斷的常用技術核酸分子雜交聚合酶鏈反應（PCR）限制性片段長度多態性（RFLP）擴增片段長度多態性（AFLP）等位基因特異的寡核苷酸（ASO）單鏈構象多態性（SSCP）基因芯片第16頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25171、核酸分子雜交原理：利用核酸的變性、復性及堿基互補的性質，用已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組DNA/RNA雜交，檢測核酸樣品中是否存在與探針互補的同源核酸序列，進行DNA或RNA定性定量分析。基因檢驗的兩個必要條件：1、必需的特異探針（標記的）2、必需的基因組DNA第17頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2518核酸分子雜交－－核酸印跡雜交DNA印跡雜交（Southernblot）RNA印跡雜交（Northernblot）斑點印跡雜交（Dot-blot）原位雜交(situhybridization)第18頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25192.核酸分子雜交（固相雜交）操作程序制備待測核酸樣品分離、變性、轉移、固化DNA片段雜交加入標記核酸探針檢測雜交信號標記核酸探針預雜交制備核酸探針漂洗去除未參與雜交的標記探針第19頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2520核酸印跡雜交基本過程：提取DNA或RNA→酶切→凝膠電泳→膠變

性處理（DNA）→轉印核酸片段到NC膜上。

（RNA可直接用變性膠電泳，轉膜）（1）制備樣品：第20頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2521核酸印跡雜交基本過程：（2）制備探針：探針：一段能和待檢測核酸分子按堿基互補配對原則而結合的核酸分子片段。探針需要標記可直接檢測的元素或分子。

如：同位素、熒光、生物素等第21頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2522核酸印跡雜交基本過程：核酸印跡雜交可檢測pg水平的靶分子（4）檢測：方法依標記的探針而不同*放射性同位素*生物素*地高辛*熒光素（3）雜交：預雜交－－封閉非特異性結合位點雜交－－探針與核酸分子結合第22頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2523（1）Southern印跡雜交法第23頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2524（2）Northern印跡雜交法（Northernblotting）

（其基本過程類似于上述Southern法）

提取RNA樣本→RNA變性→瓊脂糖凝膠電泳分離→轉移至膜→探針（標記DNA或RNA）與之雜交→顯影或顯色→檢測信號。

Northern法可用于檢測組織細胞中總RNA或mRNA

第24頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2525（3）斑點雜交或狹縫雜交法：

基本過程：

將變性的DNA或RNA直接點到固相支持濾膜上→用標記探針與之雜交→自顯影或顯色反應→檢測雜交信號→分析結果。

優點：

簡便、快速、靈敏、樣本用量少；

缺點：

特異性不高，有一定比例的假陽性。

第25頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2526第26頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2527（4）菌落雜交（colonyhybridization）該法可從大量細菌中篩選含特異的DNA序列及基因工程重組體。第27頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2528（5）原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）

將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而檢測特異的DNA或RNA序列。

細胞原位雜交

組織切片原位雜交

DNA-DNARNA-DNA

三類雜交

RNA-RNA

該法優點：不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態。有第28頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2529第29頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2530第30頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25312、聚合酶鏈反應（PCR)原理：以待擴增DNA為模板，在互補模板兩端序列的寡核苷酸引物介導下，通過耐高溫DNA聚合酶催化下，按半保留復制機制沿模板鏈延伸，快速、特異地擴增特定的DNA。一種體外模擬自然DNA復制過程的核酸擴增技術。（無細胞分子克隆技術）。第31頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2532耐高溫DNA聚合酶－－－Taq酶寡核苷酸引物：設計引物和確定退火溫度是PCR

成功的關鍵。PCR的基本過程：（循環程序）變性（95℃）→退火（55℃－65℃）→延伸（72℃）3～5分40’’～1分100bp/1分源自水棲高溫菌，最適反應溫度為72℃，且經90℃以上加溫后仍可在溫度恢復后復性。第32頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2533（1）DNA模板的變性

將待擴增DNA加熱到950C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈（即：使模板DNA或延伸后的雙鏈DNA發生熱變性

），并游離于反應體系中作為模板；（2）模板與引物的結合（退火或復性）

將體系溫度降至合適溫度（550C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補結合。（由于加入的引物量遠多于模板量，所以引物與模板的結合比例遠大于模板自身的復性）；第33頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2534（3）引物延伸

將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP按堿基互補原則連接在DNA引物3ˊ端，使引物延伸，形成兩條與模板互補的新鏈。

以上為一次PCR循環（變性、復性和延伸）

（新合成的鏈可作為下一輪循環的模板）按照上述步驟重復操作，PCR產物呈指數擴增。模板DNA擴增倍數T=2n(n:循環次數)。第34頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2535

PCR技術原理示意圖第35頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2536

2.PCR各要素及其作用（1）模板

PCR模板可以是DNA或RNA。以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102

105個拷貝；

RNA作為模板時，需要：

RNAcDNAPCR,稱此為RT-PCR.

（2）耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)

是從耐熱細菌體內提取的一種DNA聚合酶，可在95℃穩定30分鐘。從而保證PCR在[94℃變性→55℃退火→71℃延伸]循環30次過程中不變性失活。在PCR中，TaqDNA聚合酶應用最廣泛。

逆轉錄第36頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2537（3）引物

引物是根據已知序列的模板DNA待擴增區兩端而設計的一對寡核苷酸小片斷，長度一般為1530個堿基。引物是保證PCR擴增產物的大小和特異性的關鍵因素，其設計與合成對PCR的成功至關重要。引物設計原則如下：第37頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2538

引物設計應符合以下基本原則：

①長度適宜，一般為1530個堿基；②G+C含量，一般為40％

60％；③4種堿基應隨機性分布；④引物自身不應存在互補序列；⑤兩個引物之間不應有多于4個堿基的互補；⑥引物3ˊ端不應有任何修飾；⑦引物5ˊ可以修飾。第38頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2539（4）緩沖溶液與Mg2+

PCR技術常用1050mmol/LTris-HCl、pH8.38.88偏堿緩沖液；并含有一定量的Mg2+濃度；（5）dNTP濃度

PCR一般用50200μmol/L的dNTP；并且4種dNTP濃度應相等；第39頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2540（6）參數變性溫度與時間

一般選擇：940C，30秒退火溫度與時間

取決于引物長度、濃度和G+C含量，一般選擇：Tm-5℃

延伸溫度與時間

一般選擇：70℃

75℃循環次數

取決于模板濃度，一般循環：30次第40頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2541

PCR操作

各種PCR反應的操作基本相同，只是根據引物與靶序列不同，選擇不同的反應體系和循環參數。

將PCR反應管置于DNA自動化熱循環儀上，輸入各種循環參數，使DNA擴增在熱循環儀上很方便地完成。

PCR技術優點特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時，對樣本質量要求不高，能快速、特異地擴增任何DNA片斷。

PCR缺點

由于高靈敏度，使易出現假陰性或假陽性結果。

第41頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2542

3.PCR產物分析（1）凝膠電泳分析法

可用瓊脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝膠電泳檢測PCR擴增產物的大小。同時應以標準DNA分子量作平行對照，凝膠中加入溴化乙錠，電泳后，紫外檢測儀下觀察結果并拍照。

（在待檢靶序列拷貝數多、且僅擴增出一條帶時，用此法即可滿足檢測要求。）第42頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2543（2）點雜交分析法

該法有2種：

①將擴增產物直接固定在膜上，每一個探針制備一張膜，然后用不同的特異探針進行雜交；②將不同的探針固定在膜上，再用有標記的PCR產物與之雜交。

本法有助于檢測突變DNA類型，用于人類遺傳病診斷合某些基因的分析。

(當擴增產物時多條帶時，用此法更合適。)第43頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2544（呈2n擴增速度）PCR基本過程和原理特點：特異性強靈敏度高樣品可以是：毛發、血痕單細胞、病原體、腫瘤殘留物、犯罪現場遺留物第44頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2545基因診斷中常用的PCR技術：（1）、DNAPCR：（2）、RT-PCR：以DNA為模板，擴增特定核苷酸序列。用于檢測特定基因片段的存在，分析鑒定基因突變。以總RNA或mRNA為模板，逆轉錄為cDNA后擴增。用于檢測特定基因表達水平的主要方法之一。（3）、PCR-SSCP：檢測基因未知突變的常用技術。簡單、快捷、靈敏。第45頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2546（4）、多重PCR：指在一次PCR反應中加入多對引物，同時擴增DNA序列上不同序列片段的一種PCR技術。用于一些“超大”基因中大片段缺失分析。（5）、原位PCR：直接用組織切片和細胞進行PCR或RT-PCR，在組織、細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特點基因序列。（6）、實時定量PCR：借助特異性結合DNA的熒光染料，實時動態檢測PCR擴增的DNA量的變化。第46頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2547其他重要的PCR衍生技術反向PCR（IPCR）標記引物PCR（labelledprimersPCR）錨定PCR（anchoredPCR）差異展示PCR（DD-PCR）第47頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25483、限制性片段長度多態性（RFLP）檢出方法：Southern印跡概念：用同一限制性內切酶完全切割同一物種的不同個體的基因組DNA，出現分子質量不同的同源片段，這種由限制性內切酶酶切位點變化導致的DNA片段差異，稱限制性片段長度多態性（RFLP）。人類基因組中由中性突變導致個體間核苷酸的差異稱－－DNA多態性第48頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2549RFLP類型：2、由于鏈內發生較大片段的缺失、重復、插入和重排導致DNA順序的變化，因而酶切片段改變－－－序列多態性。1、單個堿基的突變引起酶切位點的變化－－－點多態性致病基因附近或內部一般存在RFLP，可用于連鎖分析的基因診斷。第49頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25504、擴增片段長度多態性（AFLP）

應用于基因突變性質不明的連鎖分析。AFLP－－串聯重復的短片段的長度多態性通過PCR擴增,經限制性內切酶酶切后電泳,產生顯示擴增片段多態性。第50頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2551AFLP原理：

首先利用可產生粘性末端的限制性內切酶酶切研究對象的基因組序列，產生不同長度的酶切片段。然后，將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭連接，形成模板。為達到選擇性擴增的目的，再在模板末端添加具有選擇性核苷酸（1～3個）的不同引物，然后PCR擴增，結果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對的酶切片段被擴增。最后將被擴增的片段在高分辨率的測序凝膠上電泳，這樣其多態性即根據擴增片段的長度與數量的不同而被分開。PCR擴增產物即等位片段之間差別只有幾個bp。第51頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25525、等位基因特異的寡核苷酸（ASO）方法：1、合成兩種探針：①已知突變位點的核苷酸序列（M）

②正常基因堿基序列（N）2、雜交實驗結果：M+N-受檢者是突變基因的純合子M-N+受檢者是不存在突變基因M-N-受檢者的缺陷基因可能是一種新的突變類型M+N+受檢者是突變基因的雜合子原理：

已知基因突變部位和性質，合成基因特異的核苷酸探針（20bp），標記后與受檢者DNA雜交診斷。（可與PCR聯用：PCR-ASO）第52頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25536、單鏈構象多態性（SSCP）日本Orita等研究發現，單鏈DNA片段呈復雜的空間折疊構象，當有一個堿基發生改變時，會或多或少地影響其空間構象，使構象發生改變，空間構象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺凝膠中受排阻大小不同。因此，通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子分離開。

PCR-SSCP第53頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2554PCR-SSCP基本過程①PCR擴增靶DNA；②將特異的PCR擴增產物變性后快速復性；③將單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳；④通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結果。若發現單鏈DNA帶遷移率與正常對照的相比發生改變，就可以判定該鏈構象發生改變，進而推斷該DNA片段中有堿基突變。

第54頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25557、基因芯片（生物集成模片、DNA陣列、或寡核苷酸微芯片）基本原理：指將大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測根據雜交分子和未雜交分子信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數量。第55頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2556基因芯片技術：第56頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2557目的：檢測外源性基因的侵入目標：1、微生物2、病毒如：HIV（致艾滋病AIDS）3、寄生蟲、4、不易體外培養的病原體（毒性大腸桿菌、麻風分枝桿菌）5、實驗室培養的病原體（克立氏體）四、基因診斷的臨床應用:1、在感染性疾病檢測中應用第57頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2558艾滋病與HIV病毒艾滋病由HIV通過接觸、血液、血制品及母嬰傳播感染所致。HIV特異地侵犯輔助性T細胞（CD4），引起人體細胞免疫嚴重缺陷，導致頑固的機會性感染，惡性腫瘤和神經系統損傷。HIV感染后，95%感染者5個月可檢出抗體（也有3-4年仍不能檢出抗體）。有必要進行PCR技術檢測。第58頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2559艾滋病與HIV病毒檢測技術：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析引物的設計：應在保守區（基因：pol,env,gag,tat)病毒特點：HIV病毒由兩條單鏈RNA組成，9.7k/RNA，主要基因結構和組成形式與其他逆轉錄病毒相同，但較之復雜，故稱復雜反轉錄病毒HIV屬反轉錄病毒－－－即單鏈RNA反轉錄成雙鏈DNA，進入宿主細胞染色體。第59頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2560非典型性肺炎（SARS）由一種新型冠狀病毒（SARS-CoV）引起，多種途徑傳播，傳染性強、高致死率的急性疾病。診斷依靠：流行病學、臨床表現、放射診斷、血清學（熒光免疫、ELISA）PCR作為一種靈敏的早期病原學診斷必不可少（關鍵是引物的合成）第60頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25612、在遺傳病檢測中的應用

產前診斷檢測妊娠8－12周的絨毛DNA或羊水細胞

PCR診斷一系列遺傳疾病

鐮刀狀細胞貧血的診斷方法：－RFLP診斷

MstⅡ酶切識別序列：CCTNAGG

切割正常β鏈序列：CCTGAGG

不切割突變序列：CCTGTGG

－ASO探針診斷第61頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25623、在腫瘤檢測中的應用原癌基因生物正常細胞基因中編碼關鍵性調控蛋白的癌基因抑癌基因

一類抑制細胞增殖的基因，其失活可引起細胞轉化。兩類基因協同調控，使細胞生長處于平衡狀態。第62頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2563癌基因激活變化及檢測：1、基因擴增：即染色體某區段基因拷貝數增加，或癌基因的擴增。檢測方法：Southern雜交定量PCR2、基因的過量表達：包括基因擴增基礎上的過量表達及非

DNA水平的過量表達。檢測方法：Northern雜交RT-PCR3、點突變：檢測方法為各種基于PCR的方法。第63頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2564抑癌基因的檢測：SouthernPCR大片段的缺失和點突變*兩個等位抑癌基因突變才能引起腫瘤，需檢出兩個等位抑癌基因。方法：RFLP結合PCR，進行缺失檢測

點突變主要采用PCR第64頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2565腫瘤標志物：指特征性存在于惡性腫瘤或由惡性腫瘤細胞異常產生的物質或宿主對腫瘤反應而產生的物質。（1）酶類腫瘤標志物（2）激素類標志物（3）胚胎抗原（4）特殊蛋白標志物（5）糖蛋白類抗原（6）血中癌基因蛋白（7）唾液酸和唾液酸酰基轉移酶（8）多胺免疫組化篩選提高檢出率第65頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2566法醫學鑒定針對人類DNA遺傳差異進行的個體識別和親子鑒定。常用技術:DNA指紋分析（VNTR）短串聯重復序列（STR）遺傳特征分析PCR-擴增片段長度多態性（AmP-FLP)PCR-mtDNA技術根據可變串聯重復序列（小衛星DNA）多態性

高度的個體特異性第66頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2567DNA指紋（圖譜）分析：⑴、選擇核心序列作探針，選在核心序列上無切割位點的限制性內切酶，酶解樣品，Southernblot得到DNA指紋圖譜。針對可變串聯重復序列（VNTR）（VNTR是判斷個體的遺傳標志）⑵、針對VNTR側翼保守區序列設計探針，用PCR

對該區擴增，電泳得到個體之間長度不同的條帶圖譜。（VNTR片段較長PCR不易擴增）。第67頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2568所羅門的審判：

大家都聽說過所羅門的審判這樣一件故事：兩位婦人都聲稱自己是孩子的母親，于是所羅門就命令一名侍衛把那個孩子帶來，要用劍將其辟成兩半分給他們兩，結果假母親

同意所羅門的判決，而孩子真正的母親卻懇求侍衛饒了孩子的性命，她解釋說：“把孩子給了假母親，總比讓孩子慘死好。”當然，真假

母親也就水落石出了。第68頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2569滴骨驗親法：

以生者的血滴在尸骨上，觀察血能否浸入骨內，浸入的則被認為兩者有血緣關系，在各種古籍中有多種記錄。三國時代（公園220—280年）謝承著《會稽先賢傳》中的《以弟血滴兄骨》可能是記錄此法的最早的史料：陳業的哥哥因海難不幸殞命，當時一同遇難的有五六十人，并且尸體都已嚴重腐敗而無法辨認死者的身份。陳業就用刀刺破自己的手臂將血分別滴在尸骨上，發現其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陳業就這樣確認其兄的尸骨。第69頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2570合血法：

等到了明代，更是采用了“合血法”來識別親權。明末清初的檢驗書籍中都有相同的記載：“親子兄弟或自幼分離，欲相認識。難辨真偽。命各刺出血，滴一器內，真則共凝為一，否則不凝也。”第70頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2571第二部分

基因治療（genetherapy)概念：

將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因缺陷和異常基因引起的疾病，達到治療目的。導入的基因可以與缺陷基因對應、在體內表達具有特異功能的同源基因、也可以是與缺陷基因無關的治療基因。概念的擴展：凡是采用分子生物學方法原理，將某種遺傳物質轉移到患者細胞內，使其在體內發揮作用，達到治療目的的方法，都可稱為基因治療。第71頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2572基因治療策略:總原則：－－直接補替缺陷基因－－抑制非正常基因產物表達－－間接調節機體本身免疫系統的抗病能力。－－利用外源基因對病變細胞造成特異性殺傷第72頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25731、基因矯正－－將致病基因的堿基進行糾正，而正常部分予以保留。2、基因置換－－用正常基因通過體內基因同源重組，原位置換病變細胞內的致病基因，使細胞內的DNA完全恢復正常。3、基因增補－－將目的基因導入病變細胞或其它細胞，不去除異常基因，而是通過目的基因的非定點整合，使其表達產物補償缺陷基因的功能或使原有功能得以加強。4、基因失活－－利用反義技術特異封閉基因表達，抑制有害基因的表達。5、免疫調節－－將抗體、抗原或細胞因子的基因導入病人體內，改變病人免疫狀態，達到預防和治療的目的。基因治療的策略：第73頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/25746、調節性基因治療：導入編碼調控蛋白的基因，治療基因表答異常的疾病。7、化療保護性基因治療：導入單相或多相細胞毒性藥物的抗性基因，使正常細胞耐受化療藥物的能力大大提高。8、特異性細胞殺傷性基因治療：利用DNA重組技術構建特異性殺傷靶細胞為目標的“奇異彈頭”，“彈頭”部分是分子重組的各種生物細胞毒素，它們以酶催化方式發揮抑制蛋白合成作用，造成細胞殺傷。9、生殖細胞基因治療：生殖細胞或胚胎干細胞補償性治療。第74頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2575

美國醫學家W·F·安德森等人對腺甘脫氨酶缺乏癥（ADA缺乏癥）的基因治療，是世界上第一個基因治療成功的范例

1990年9月14日，安德森對一例患ADA缺乏癥的4歲女孩謝德爾進行基因治療。這個4歲女孩由于遺傳基因有缺陷，自身不能生產ADA，先天性免疫功能不全，只能生活在無菌的隔離帳里。他們將含有這個女孩自己的白血球的溶液輸入她左臂的一條靜脈血管中，這種白血球都已經過改造，有缺陷的基因已經被健康的基因所替代。在以后的10個月內她又接受了7次這樣的治療，同時也接受酶治療。經治療后，免疫功能日趨健全，能夠走出隔離帳，過上了正常人的生活。

謝德爾，1999第75頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2576第76頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2577第77頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2578一、基因置換第78頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2579第79頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2580第80頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2581二、基因添加第81頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2582三、基因干預第82頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2583四、自殺基因治療第83頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2584第84頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2585第85頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2586第86頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2587五、基因免疫治療第87頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2588基因治療基本程序:方法：1、體外法（exvivo):2、體內法

(invivo):將受體細胞在體外培養，轉入外源基因，經適當選擇系統，將重組的受體細胞回輸患者體內，以改善癥狀。（普遍采用）直接將外源基因導入體內有關的組織器官,使其進入相應的細胞并轉錄、表達而發揮治療作用。基本程序：選擇目的基因選擇基因載體選擇靶細胞基因轉移外源基因表達及檢測回輸體內第88頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2589治療基因的來源：1、野生型基因：

單基因缺陷遺傳病基因

反義核酸封閉活化的原癌基因

轉入相關的抑癌基因，抑制腫瘤2、重組DNA和分子克隆技術，人工合成特異基因。1、選擇治療的目的基因第89頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2590用于基因治療的基因應滿足以下條件：（1）體內僅少量表達就可顯著改善癥狀。（2）該基因的過量表達不會對機體造成危害、（3）在抗病毒和抗病原體的基因治療中，所選擇的靶基因應在病毒和病原體的生活史中起重要作用，并且該序列是特異的。第90頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2591理想的載體具有以下特征：1、容易生產

商業化生產，廣泛應用，易運輸，易保存2、持續表達

一旦轉入體內，應能在一定時間內持續表達基因產物，或能通過某種方法精細調節其表達。3、弱免疫源

轉入后不應引起免疫反應。4、組織靶向性

定向輸入某種細胞。5、包裝容量載體對轉染基因的大小應沒有限制。6、復制、分裂和整合能力：特異性定位整合，或以游離基因形式存在于細胞核內。7、能感染分裂期細胞和未分裂期細胞2、選擇基因載體：第91頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2592基因載體：非病毒載體（裸DNA、脂質體）

病毒載體

（反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒）分類：優點：大量生產，毒性小，低免疫性缺點：效率低。優點：多數病毒可感染特異細胞，不易降解，

RNA病毒能整合到宿主染色體，表達水平高等。第92頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2593病毒介導的基因轉移1、逆轉錄病毒：正鏈RNA病毒第93頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2594逆轉錄病毒結構:基因組組成：（1）5’－帽子；3’－尾巴；（2）每個單鏈RNA含6個區：

5’-LTR（長末端重復序列）

Ψ+

（組裝所需的非編碼序列）

gag（編碼衣殼結構蛋白基因）

pol（編碼反轉錄酶基因）

env（編碼外殼蛋白基因）

3’-LTR第94頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2595逆轉錄病毒生活周期:1、感染靶細胞2、利用自身編碼的逆反轉錄酶，以RNA為模板合成DNA。3、將病毒DNA轉運至宿主細胞核4、病毒DNA整合到宿主染色體5、以病毒DNA為模板轉錄RNA6、在細胞中翻譯Gag、Pol和Env蛋白7、形成衣殼，RNA單鏈和反轉錄酶一起包裝進衣殼。8、形成病毒顆粒并分泌到胞外。第95頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2596逆轉錄病毒病毒RNA宿主細胞RTRT逆轉錄酶cDNA雙鏈插入基因組DNA逆轉錄病毒感染過程病毒RNA第96頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2597構建逆轉錄病毒載體：（1）構建重組野生性病毒：插入相關外源基因，改造成DNA載體（包括插入選擇性標記），替代病毒的編碼基因。（2）制備輔助細胞（293T細胞），為載體DNA提供其喪失的功能。（3）載體DNA導入輔助細胞，產生病毒載體。（4）用病毒載體感染細胞，外源基因在宿主細胞中表達。第97頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2598逆轉錄病毒載體的缺陷：1、只能轉染處于增殖狀態的細胞2、所攜帶的外源基因不能太大。3、感染依賴靶細胞表面受體的限制4、理論上不擴散其它細胞，但某些情況會造成野生型病毒爆發。5、有致細胞癌變的可能。6、逆轉錄病毒不能耐受純化和濃縮過程。第98頁,共110頁，2024年2月25日，星期天2024/4/2599腺相關病毒(AVV)一種小的、非致病的、單鏈DNA病毒。是從屬病毒，需要其他基因才能復制。結構：rep基因－－編碼病毒的復制、整合功能所需蛋白

cap基因－－編碼病毒結構組分

ITRs序列－－反向末端重復，定義基因的開始和