短串聯重復序列等位基因階梯的制備技術的制作方法專利名稱：短串聯重復序列等位基因階梯的制備技術的制作方法技術領域：本發明屬于基因工程，具體地說涉及一種短串聯重復序列等位基因階梯的制備技術，該技術可應用于法醫學、考古學、遺傳學和腫瘤學等領域的個體識別、親權鑒定以及遺傳和腫瘤病的診斷等方面。人類基因組DNA有3×109bp，其中10％是串聯重復序列，被稱為衛星DNA。按重復單位的長短，又可分為大衛星、中衛星、小衛星和微衛星。其中重復單位僅由2-7bp組成的叫微衛星，所以又稱為短串聯重復序列(Shorttandemrepeat，SIR)。不同人體基因組的衛星DNA重復單位的數目是可變的，因此形成了極其復雜的等位基因片段長度多態性。根據這一規律，近幾年在法醫學、考古學、遺傳學和腫瘤學等領域建立了一種嶄新的對人體進行個體識別、親權鑒定以及對遺傳和腫瘤病進行診斷的STR-PCR(短串聯重復序列聚合酶鏈反應)技術，從而給這些領域的發展帶來了新的革命性變化。在這一技術中，為了準確地給各等位基因進行定位和識別，必須設置與各等位基因相對應的等位基因階梯(AlleleLadder)為標準參照物(Markers)。因等位基因階梯中的每一基因片段的長度均是已知的，將它與各待測樣品的擴增產物在相同電泳條件下的相鄰泳道上進行電泳分離，染色后進行對比，就很容易判斷待測樣品的基因型，所以，等位基因階梯在STR-PCR的結果判斷中至關重要。目前國內制備各STR位點等位基因階梯的方法有兩種一種是從人基因組的每個位點上篩選能代表各等位基因片段的幾種擴增產物，混合后直接用于AlleleLadder；另一種方法是將能代表某位點上所有等位基因的擴增產物混合物，稀釋后再次擴增，將再次擴增的產物用作等位基因階梯。按上述方法制備的等位基因階梯有很多不足之處(1)、直接選擇人基因組作為擴增模板時，往往出現有些帶是重復擴增，而有些帶確很難找到相應的的擴增模板，由此制備的等位基因階梯的各條帶的顏色深淺不一，甚至出現缺帶現象。(2)、要批量生產，必須要經常去挑選和制備能代表所有等位基因片段的模板，不但工作量大，而且每次用的同一模板的純度及含量等均有出入，使其擴增條件難以標準化。(3)、人基因組DNA的分子量太大，結構極其復雜，難以線性化和解鏈，所以擴增產物的產量較低，而且非特異擴增較嚴重，對產物的純化較困難，不適合批量生產。(4)、若用人基因DNA的擴增產物混合后再次進行擴增，其非特異擴增更加嚴重，擴增產物中各條帶的顏色更不均一，此法更不適合批量生產。(5)、將擴增產物的混合物直接用于等位基因階梯時，在短時間內可能出現降解，使其各條帶模糊不清，或者構型有所改變，使其電泳遷移率發生變化。由于這些原因引起的質量變化均不能作為標準參照物使用。由于上述原因，至今尚無任何單位可以批量生產一種穩定的STR等位基因階梯供給有關部門使用。本發明的目的就是為了提供一種短串聯重復序列等位基因階梯的制備技術，該技術能批量生產穩定性好的(即在常溫以下至少在一年之內不出現降解和構型改變，在各種濃度的變性或非變性膠中均保持與擴增產物的電泳遷移率一致)，既可用于銀染法，也可用于熒光法的等位基因階梯試劑。一種短串聯重復序列等位基因階梯的制備技術，其特征在于包括以下生產順序步驟1、從人的有核細胞中提取DN/A取抗凝血20μl，加紅細胞裂解液D.5ml左右，充分混勻后，5000rpm離心5分鐘，再用紅細胞裂解液洗兩遍，沉淀加20μl白細胞裂解液，混勻后，100℃煮10分鐘，取1μl進行STR-PCR擴增；2、按國內外公開發表的各STR位點PCR方法進行擴增，以尋找各位點的等位基因型；3、按德國QIAGEN公司生產的QIAquickGelExtractionKit(或其它公司的同類產品)說明書，快速純化PCR產物；4、按Promega公司生產的pGEM-TVectorSystems(或其它公司的同類產品)說明書將純化的PCR產物連接到T載體上；5、按《分子克隆》第二版中文版第19頁的方法提取質粒DNA，并進行純度和定量測試；6、用STR-PCR技術分別制備各等位基因片段，然后對擴增產物進行純化和定量測定；7、將各位點的等位基因片段進行序列分析，以測定各片段的bp數及串聯重復單位數；8、將各片段等量混合后，加入穩定劑，并按適當量分裝；9、出廠前再次進行電泳檢測。本發明有如下的特點1、用于擴增各等位基因的模板是通過分子克隆技術制備的，該模板的DNA序列與人基因組DNA上同一位點的序列完全相同，因此用這兩種不同模板得到的擴增產物的DNA序列及構型完全一致，從而確保了這兩種擴增產物的電泳遷移率保持不變。2、通過分子克隆技術得到的模板的長度遠小于人基因組DNA的長度，容易線性化和解鏈，在相同條件下，得到的擴增產物遠高于用人基因組DNA擴增的量，而且非特異性擴增產物也遠少于人基因組DNA的擴增產物，所以容易批量生產。3、各等位基因片段是一條一條的制備，然后分別測定其含量，再等量混合后制成等位基因階梯，這樣就確保了每條帶顏色的深淺是均一的。4、用分子克隆技術制備的模板更容易作到定性定量測定，一次標化好的模板可用好幾年，這不但大大地減化了反復從人的有核細胞中去尋找和提取各等位基因模板的煩瑣工作，更主要的是盡可能地避免了因為每批模板質量的差異，給生產的標準化和產品質量的穩定性帶來的負面影響。5、在批量生產等位基因階梯時，所用引物之一的5’端標上熒光素后，便可得到可供熒光檢測的等位基因階梯。6、按本專利制備等位基因階梯不但可批量化、標準化生產，而且產品的穩定性特別好，在常溫以下至少在一年之內產品不存在降解和構型改變等，其質量完全可以達到同類進口試劑的水平。下面詳細說明。本發明包括以下生產順序步驟1、從人的有核細胞中提取DNA取抗凝血20μl，加紅細胞裂解液0.5ml左右，充分混勻后，5000rpm離心5分鐘，再用紅細胞裂解液洗兩遍，沉淀加20μl白細胞裂解液，混勻后，100℃煮10分鐘，取1μl進行STR-PCR擴增。2、按國內外公開發表的各STR位點PCR方法進行擴增，以尋找各位點的等位基因型。以VWA位點為例說明如下引物序列分別為5’-GGGATTTCCCTATGGATTGG-3’和5’-GCGAAAGAATGAGGACTACAT-3’。如果用熒光法進行檢測，需在其中一條引物的5’端標上熒光素。每一擴增樣品包含2-40ng人類基因組DNA，1×Taq緩沖液，1.5mmol/LMgcl，每種核苷酸150μmol/L，1UTaq聚合酶，每種引物0.25μmol/L，反應體積25μl。在熱循環儀中先95℃預變性2分鐘，然后循環30次，每次94℃變性1分鐘，60℃退火1分鐘，72℃延伸2分鐘。用7.5％聚丙烯酰胺進行電泳，然后銀染。通過比較樣品PCR擴增產物與人類VWA位點AlleleLadde的電泳譜帶位置確定VWA基因型。3、按德國QIAGEN公司生產的QIAquickGelExtractionKit(或其它公司的同類產品)說明書，快速純化PCR產物。具體方法如下加5倍體積的PE至1體積的PCR產物中，混合后加到QIAquick柱中，將該柱置于2ml收集管之上，快速離心30-60秒，棄去離心液，用0.75mlBufferPE加到柱中再快速離心30-60秒，棄去離心液，將柱置于新的1.5ml離心管之上，加適量的水到柱中，快速離心1分鐘，收集離心液備用。4、按Promega公司生產的pGEM-TVectorSystems(或其它公司的同類產品)說明書將純化的PCR產物連接到T載體上，即2×T4DNAligasebeffer5μl，pGEM-T1μl，T4DNAliggase1μl，經純化的PCR產物適量，然后加水至10μl4℃連接過夜，再轉化到大腸桿菌中，然后從選擇培養基平板上挑取單菌落，從中挑選所需要的重組菌。5、按《分子克隆》第二版中文版第19頁的方法提取質粒DNA，即將LB液體培養基培養的重組菌轉移到1.5ml離心管中，5000rpm離心5分鐘，棄上清，加100μl預冷的溶液I，劇烈振蕩使其充分懸浮；然后再加200μl新配制的溶液II；蓋緊管口，快速顛倒離心管5次后置于冰上；再加150μl冰冷的溶液III，溫和振蕩10秒鐘后，再置于冰上3-5分鐘，4℃12000rpm離心10分鐘；將上清轉移到另一離心管中，加等體積的酚/氯仿，振蕩均勻后，4℃12000rpm離心2分鐘；將上清轉移到另一離心管中，加2倍體積的乙醇，充分混勻后，室溫下放2分鐘，4℃12000rpm離心5分鐘；再用1ml70％乙醇洗一次質粒DNA，然后去掉上清，在空氣中使其干燥；加適量的無DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE重新溶解質粒DNA。然后用分光光度法測定其純度及含量，并保存在-20℃備用。6、用STR-PCR技術分別制備各等位基因片段，在制備帶熒光基團的等位基因階梯時，需在其中一條引物的5’端先標上熒光素。然后對擴增產物進行純化和定量測定。7、將各位點的等位基因片段進行序列分析，以測定各片段的bp數及串聯重復單位數。8、將各片段等量混合后，加入穩定劑，并按適當量分裝。9、出廠前再次進行電泳檢測。權利要求一種短串聯重復序列等位基因階梯的制備技術，其特征在于包括以下生產順序步驟1、從人的有核細胞中提取DNA取抗凝血20μl，加紅細胞裂解液0.5ml左右，充分混勻后，5000rpm離心5分鐘，再用紅細胞裂解液洗兩遍，沉淀加20μl白細胞裂解液，混勻后，100℃煮10分鐘，取1μl進行STR-PCR擴增；2.按國內外公開發表的各STR位點PCR方法進行擴增，以尋找各位點的等位基因型；3.按德國QIAGEN公司生產的QIAquickGelExtractionKit(或其它公司的同類產品)說明書，快速純化PCR產物；4.按Promega公司生產的pGEM-TVectorSyslems(或其它公司的同類產品)說明書將純化的PCR產物連接到T載體上；5.按《分子克隆》第二版中文版第19頁的方法提取質粒DNA，并進行純度和定量測試；6.用STR-PCR技術分別制備各等位基因片段，然后對擴增產物進行純化和定量測定；7.將各位點的等位基因片段進行序列分析，以測定各片段的bp數及串聯重復單位數；8.將各片段等量混合后，加入穩定劑，并按適當量分裝；9.出廠