微生物學研究與應用技術一、PCR技術1、PCR原理：PCR技術是以DNA雙鏈的復制和變性、復性為原理，在人工調控的溫度下，提供DNA復制所需的引物、模板、dNTPs、聚合酶等條件，從而使得DNA可周而復始的進行復制擴增。2、PCR循環（步驟）：變性（denaturation）—退火（annealing）—延伸（extension）；變性：高溫下，模板DNA發生熱變性，雙鏈解開成兩條單鏈；退火：反應體系降溫，使引物與模板DNA兩端的堿基配對；延伸：DNA聚合酶使引物3’端向前延伸合成新鏈；新合成的單鏈又可作為下一輪循環的模板進行復制，并不斷重復上述的3個步驟，使得DNA片段呈指數增長，在1h內可重復25~30次，DNA的擴增量可達106~107倍。3、PCR常用的耐熱聚合酶：（1）TaqDNA聚合酶，耐高溫但缺乏校正功能，使用最為廣泛；（2）PfuDNA聚合酶、VentDNA聚合酶，既耐高溫又具有校正功能的聚合酶；（3）TthDNA聚合酶，具有逆轉錄活性的聚合酶，可使RT-PCR在同一體系中進行，即使僅有極少量的RNA也可被擴增，可用于研究細胞RNA和RNA病毒。4、PCR的應用：（1）可用于基因的擴增和制備DNA探針，如已知目的基因兩端的序列，利用PCR便可將其擴增出來，也可用于定位誘變和DNA測序；（2）可用于臨床醫學上檢測傳染病、診斷遺傳病和分析癌基因；（3）在法醫上可用于進行親子鑒定、個體鑒定等。5、PCR定位誘變技術（最常用）：任何基因只需要知道兩端及需要的變異部位的序列即可進行PCR定位誘變。PCR誘變有兩種方法：（1）基因末端誘變：5‘端或3‘端引物含有變異堿基，便可使PCR產物的末端引入變異。（2）基因中部誘變：在需要誘變的位置合成一對含有變異堿基的互補引物，然后分別于5’端引物和3’端引物進行PCR，這樣便可得到兩個含變異堿基的PCR產物，由于二者中間有一段序列彼此互補重疊，在重疊部位經重組PCR就能得到變異的PCR產物。圖P273二、革蘭氏染色法基本原理方法：通過結晶紫初染和碘液媒染后，在細胞膜內形成了不溶于水的結晶紫與碘的復合物（CVI）。革蘭氏陽性菌由于其細胞壁較厚，肽聚糖網層次多和交聯緊密，故遇乙醇處理時不會溶出縫隙，因此能把結晶紫與碘的復合物牢牢地留在壁內，是其保持紫色。反之，革蘭氏陰性菌因為細胞壁薄，外膜層的脂類含量高、肽聚糖層薄和交聯度差，所以在遇脫色劑后，以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網不能截留結晶紫-碘復合物的溶出，因此，通過乙醇脫色后細胞退為無色。這時再經過沙黃等紅色染料進行復染，只有革蘭氏陰性菌會被染成紅色。常用基因工程載體克隆載體：是指負責將外源基因運送到宿主細胞內進行復制與擴增的運輸工具。作為克隆載體的要求：（1）載體應為一個獨立的復制子，含有復制起始點且可在細胞內自主復制；（2）含有多克隆位點，即含有若干限制酶單一切點，以便插入外源基因；（3）含有選擇標記，便于對陽性克隆的篩選和鑒定；（4）具有一定的安全性，在胞內不發生重組和轉移，在胞外也不能自由擴散。基因工程常用的5大載體：質粒載體、?噬菌體載體與黏粒載體、M13噬菌體載體與噬菌粒載體、真核生物克隆載體、人工染色體。主要克隆載體及其主要用途：細菌質粒載體—外源基因的克隆與表達，<15kb；噬菌體載體—構建基因文庫及cDNA文庫，<23kb；黏粒載體（柯斯質粒載體）—構建基因文庫，<49kb；M13噬菌體載體—單鏈DNA制備和測序、定位誘變、噬菌體展示，300~400bp；噬菌粒載體—外源基因的克隆與表達，<10kb；酵母質粒載體—真核基因的克隆與表達，<15kb；Ti質粒載體—植物基因工程載體，<20kb；酵母人工染色體（YAC）—大基因簇相關功能基因研究、實現人類基因組計劃和人類疾病相關基因研究、構建真核生物大片段基因文庫，100~2000kb；細菌人工染色體（BAC）—同上，120~300kb；載體對表達宿主的基本要求：（1）能夠高效吸收外源DNA；（2）不具有限制修飾系統，不降解導入的未經修飾的外源DNA；（3）不具有DNA重組系統，常用重組缺陷型（recA-）菌株；（4）根據載體類型選擇相應宿主：如用?噬菌體或黏粒作為載體，須選擇?噬菌體敏感的宿主（E.coli-K12）；選用M13時，則應選擇含有F因子的雄性大腸桿菌為宿主；（5）根據載體的標記選擇合適的宿主，例如載體攜帶氨芐青霉素抗性基因作為選擇標記，則應選擇氨芐青霉素敏感菌株為宿主；（6）具有安全性，宿主細胞應該對人、畜、農作物無害。6、各種常見載體的特點特性：（1）質粒載體：含有復制起點；含有多種限制酶的單一識別位點；含有抗生素抗性基因的選擇標記；高拷貝，每個細胞含有10~200個拷貝的松弛型質粒；具有較小的相對分子質量，易于DNA的分離和操作；可通過轉化或電穿孔法極易導入宿主細胞。（2）?噬菌體載體：由兩種類型，插入型（只含有一個單一限制位點，用于插入外源基因）和取代型（具有成對的限制酶切位點，外源基因可取代限制位點之間的DNA）；優點有：可克隆大約23kb的外源基因，克隆能力大于質粒；感染宿主效率高達100%；不足之處在于，插入的外源基因的長度有限（需控制在野生型?DNA片段的78~105%），因為噬菌體頭部可容納的DNA量有限。（3）黏粒載體：由?噬菌體的COS位點和質粒DNA共同構建的；特點：克隆能力遠超過質粒和噬菌體（本身5~7kb，克隆35~48kb）；在宿主細胞內以質粒形式進行復制；由于可以搭載更大的DNA片段，所以可用于構建基因文庫。（4）M13噬菌體載體：M13是大腸桿菌的絲狀噬菌體，其基因組中除了基因間隔區（GI）外，其他均為復制和裝配所需要的基因；所以其特點是：后期篩選陽性克隆便利（1、在IG中插入一段可以編碼β-半乳糖苷酶的α肽基因，使其可與LacZ基因突變缺陷型的大腸桿菌互補生成具有活性的β-半乳糖苷酶。然后將M13和大腸桿菌涂布在含有IPTG和呈色物質X-gal的平板上，就會形成藍色噬菌斑；2、如果在α肽編碼區內插入限制酶切位點，當外源基因插入時，便會破壞α肽的互補作用，從而重組噬菌體就會形成白色噬菌斑。）；由于M13一般只能克隆300~400bp的片段，所以常用于制備測序用的單鏈DNA、單鏈DNA探針和定位誘變模板，也可用于噬菌體展示（phagedisplay：將編碼多肽的外源DNA片段與噬菌體表面蛋白的編碼基因融合后，以融合蛋白的形式呈現在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對的空間結構和生物活性，展示在噬菌體的表面）。（5）噬菌粒載體：由M13的基因間隔區（含復制起始位點）和質粒DNA共同構建的載體。其優點是：1、載體本身分子小（約3kb），易于遺傳操作；2、可克隆10kb的外源基因片段，克隆能力高于M13；3、可用于制備單鏈或雙鏈DNA。（真核生物克隆載體）（6）酵母質粒載體：多為為穿梭載體，可在酵母細胞中復制也可在細菌中復制；主要有3種類型：1、附加體質粒（可在酵母中復制，高拷貝）2、復制質粒（可在酵母中復制，中等拷貝）3、整合質粒（能整合到酵母染色體，不能自主復制，但可在細菌中自主復制）。（7）Ti質粒載體：為植物基因工程中的理想載體。（8）病毒載體：1、哺乳動物病毒載體（高效識別宿主并將基因整合到宿主細胞中；高拷貝，強啟動子）；2、昆蟲動物病毒（優點：可克隆片段長可達100kb；高表達；安全性高）；3、植物病毒載體（植物基因工程載體）。（人工染色體）—大批量攜帶DNA的載體（9）酵母人工染色體（YAC）：一類目前能夠攜帶最大量外源基因的載體；結構上有三個必備元件：著絲粒、端粒、自主復制序列（一般染色體所必需的）；本身只有10kb，但能攜帶100~2000kb外源DNA片段。因此既保證所插入的外源基因片段結構完整，有可大大減小基因庫所要求的克隆數。（10）細菌人工染色體（BAC）：可攜帶120~300kb外源片段；特點：通常僅保留F因子的緊密型控制的復制子，同時還含有多克隆位點和遺傳標記；電穿孔法即可將其倒入宿主細菌中；不易發生重組，遺傳性穩定，重組DNA也易于分離。純培養獲取技術whatisculture（培養物）：指在微生物學中在人為規定的條件下培養、繁殖獲得的微生物群體；而只有一種微生物的培養物，稱為純培養物（pureculture）。主要可分為四類：（1）固體培養基獲取法：以固化的培養基為微生物生長的承載體，然后通過：涂布平板法（將已熔化的培養基倒入無菌培養皿內制成無菌平板，待凝固后，將一定量的某一稀釋度的樣品的懸液滴加在平板表面，再用無菌涂布棒使菌液均勻地分散在平板表面，經培養后即可挑取到單個菌落。）；平板劃線法（用無菌接種環以無菌操作蘸取少量的分離材料（一般為涂布后培養所得），在無菌平板表面進行平行劃線等連續劃線形式，使接種環上微生物細胞數隨著劃線次數增加而減少，并逐步分散，如果劃線適宜的話經培養后，可直接在平板上得到單一菌落。）；稀釋到平板法（先將待分離的材料逐級進行10倍稀釋，然后分別取不同稀釋液少許與已熔化（約50℃）的瓊脂培養基混勻，后倒入無菌培養皿，凝固后即可得含菌瓊脂平板，培養后可得到菌落。缺點：易使熱敏感細菌死亡，也會阻礙一些嚴格好氧菌的生長）；稀釋搖管法（用于分離嚴格厭氧菌株的稀釋倒平板法；先將一系列盛有無菌瓊脂培養基的試管加熱，是瓊脂熔化后保持50℃左右，將待分離的材料用這些試管梯度稀釋后，迅速搖勻，冷凝后，在瓊脂表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，隔絕空氣。）（2）液體培養基獲取法：通常采用的液體培養基分離純化法是稀釋法—接種物在液體培養基中進行順序稀釋（較多平行稀釋試管），已得到高度稀釋效果，是一支試管分配不到一個微生物，如稀釋后的試管中沒有微生物生長，那么有微生物生長的試管得到的培養物可能就是純培養物，其中得到純培養物的稀釋度的大多試管（95%）應是物微生物生長。缺點：只能分離出混雜微生物群體中的優勢種群。（3）單細胞（孢子）分離法：材料經過一定稀釋后在顯微鏡下用毛細管、顯微針（環、鉤）挑取單個細胞或孢子。（4）選擇培養法：主要是根據目標微生物的生長代謝特點等，制備或可抑制其他微生物的生長或極有利于該微生物生長的環境，從而經一段時間培養后使該微生物數量上升，最后再采取涂布、劃線的方法再進一步分離純化。其方法有兩種：選擇平板培養基和富集培養（利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定環境條件，使僅適應于該條件的微生物旺盛生長，使人們更容易在自然界中分離到該微生物）。五、基因的轉移1、外源基因的導入方法（基因工程轉基因方法）：（1）原核細胞的導入：通常可以通過轉化、轉染或感染等方式將外源基因導入原核細胞。轉化：如果外源基因以重組質粒形式存在，可通過轉化方式導入；轉化基本程序：將一定濃度冰冷的CaCl2溶液處理對數期的大腸桿菌，然后加入外源DNA并在42℃下熱休克處理90s，使感受態細胞吸收外源DNA。轉染：外源基因以被構建成重組噬菌體DNA或重組噬菌粒，則以轉染方式進入宿主細胞；（PS：無論轉染還是轉化，都要先使宿主細胞轉變成感受態細胞，以便吸收外源基因）感染：將重組?噬菌體載體或重組黏粒載體，噬菌體各結構蛋白混合，包裝成?噬菌體，然后去感染大腸桿菌。（效率高于轉染）（2）真核細胞的導入：導入方法因宿主細胞不同而不同（酵母、哺乳動物、植物）酵母細胞：通常利用蝸牛酶去除酵母細胞壁，使其形成原生質體；再用氯化鈣和聚乙二醇處理，使重組DNA以轉化方式進入原生質體中；最后將轉化后的原生質體置于再生培養基內培養是原生質體再生出細胞壁形成完整的酵母細胞。哺乳動物細胞：較常用也最有效的方法—電穿孔法：將宿主細胞與重組DNA混合并置于電擊槽中，在高壓脈沖作用下（哺乳動物：250~4000V/cm），使細胞膜瞬時擊穿形成微孔，進而重組DNA從微孔進入宿主細胞。（PS：哺乳動物細胞、植物細胞相對有效）方法二：利用病毒載體導入—如把基因插入逆轉錄病毒載體中，然后將其感染靶細胞，這樣就可以將RNA基因組的DNA拷貝整合到宿主細胞染色體中。植物細胞：除電穿孔法外，還有兩種方法：1、根瘤土壤桿菌轉化法：將含有重組Ti質粒的土壤桿菌與剛再生了細胞壁的植物原生質體共同培養或與植物葉片共同培養（缺點：僅適用雙子葉植物）；2、基因槍法（微彈轟擊法）：利用高壓氣體，將表面吸附有外源DNA的金屬微粒子高速射入植物細胞。（缺點：造價較貴）2、細菌的遺傳轉化：遺傳轉化（genetictransformation）是指同源或異源的游離DNA分子（質粒、染色體DNA）被自然或人工感受態細胞攝取，并得到表達的水平方向的基因轉移過程。自然轉化：是細菌等微生物為適應自然環境，自發啟動感受態化有關基因的表達，從而是自身處于感受態以吸收其他細菌釋放的外源基因，從而增強自身的生存能力的一些列過程。（PS：自然感受態出現過程：細菌生長到一定階段時會分泌一種小分子的蛋白質-感受態因子，這種感受態因子會與細胞表面對應的受體結合并作用，后誘導一些感受態特異蛋白的表達；其中一種為自溶素，它的表達使細胞表面的DNA結合蛋白及核酸酶裸露出來，使其具有與DNA結合的活性。）研究表明，幾乎所有的細菌都可以向環境中主動分泌（或細胞裂解釋放）DNA，這些DNA分子可以與固型物（土粒、砂粒等）結合從而避免DNase的降解，以保持長時間的活性。另一方面，自然感受態作為許多細菌細胞應付不利生活條件的一種調節機制，在自然環境中存在具有普遍性，有實驗表明，有些環境中感受態細胞在其群落中所占的比例可達16%。人工轉化：是指在實驗室中用多種不同的技術完成轉化過程，包括CaCl2處理、電穿孔等。可為一些本身不具有自然轉化能力的細菌（如大腸桿菌）提供了一條獲取外源基因的途徑，也是基因工程的基礎技術之一。（mypoint：具有自然轉化能力意味著有更加頻繁的基因交流，從而不斷改變對環境的適應能力，也就是說具有該能力的細菌多半是生存環境相對多變而不穩定。）有關Ca+誘導法：線性的細菌DNA較難轉化，可能是線性DNA在進入細胞質之前就被周質空間內的DNA酶降解，而缺乏這種DNA酶的大腸桿菌可高效轉化這種DNA。電穿孔法是一種真核、原核都適用的轉化方法。3、轉導（transduction）：是由病毒介導的細胞之間進行遺傳交換的一種方式。具體是指一個細胞的DNA或RNA通過病毒的感染轉移到另一個細胞中。轉導可分為兩種：普遍性轉導和局限性轉導；其中：（1）普遍性轉導，噬菌體可以轉導體染色體的任何部分到受體細胞中；（2）局限性轉導，噬菌體只攜帶特定的片段到受體細胞中，與普遍性轉導的區別在于1、被轉導的基因共價地結合到噬菌體DNA上，2、攜帶特殊的染色體片段并將固定的個別基因導入受體中。溫和噬菌體?是局限性轉導的典型代表。七、藥物致癌性檢測試驗Ames試驗：由加利福尼亞大學的Ames教授首先發明，該試驗是利用鼠沙門氏菌的組氨酸營養缺陷型菌株的回復突變（指突變體失去的野生型性狀，可以通過第二次突變得到回復的現象）性能來決定的。試驗大致為：his-菌株在不含組氨酸的培養基尚不能生長，如果回復突變率因某種化學誘變劑（或待測樣品）的作用而增加，則該藥物可判斷為具有致癌性（回復菌株數量越多則表示該物質誘變能力越強），為了使體外試驗更接近于人體代謝，Ames等采用了在體外加入哺乳動物微粒體酶系統，使待測物活化，從而使準確率可達80%~90%。試驗過程：1、在不含組氨酸的平板上接入組氨酸缺陷型沙門氏菌；2、在平板中心挖一個小孔，然后將待測物質放入小孔中（物質會向四周擴散，形成一個濃度梯度）；3、培養一段時間后，如果該物質有可致突變性，則該平板上會有菌落生長；如果沒有菌落生長，則證明該物質不具致突變性。八、鞭毛檢驗試驗方法一：在半固體（含0.3%~0.4%瓊脂）直立柱中用穿刺法接種某一細菌，經培養后，若刺穿線周圍有呈渾濁的擴散區，則說明該細菌具有運動能力，并可推斷其長有鞭毛；方法二：根據某細菌在平板培養基上的菌落外形來判斷，一般情況下，如果該細菌長出的菌落形狀大、薄且不規則，邊緣極不圓整，說明該細菌運動能力強；反之，若菌落外形圓整，邊緣光滑、厚度較大，則說明該細菌為無鞭毛的細菌。九、無菌操作技術無菌技術（aseptictechnique）：在分離、轉接及培養純培養物時防止其被其他微生物污染，且自身也不污染操作環境的技術。其中無菌技術可大致分成三個部分：（1）微生物培養常用器具無菌化（滅菌）：主要是將試管、玻璃燒瓶、培養皿等常用培養器具以及微生物培養基（可單獨處理后加到無菌器具也可加到器具后一同處理）在使用前先行滅菌處理。常用的滅菌方式是高壓蒸汽滅菌，一些玻璃、金屬器具也可以用高溫干熱滅菌；此外，為了防止空氣中的雜菌污染，應在試管、燒瓶等加上可容空氣流動但不能通過其他微生物的塞子（如硅膠塞、棉花塞等）；（2）無菌環境的建立：酒精燈火焰附近、無菌操作臺（使用前先開啟通風系統，并同時開啟紫外線燈滅菌）、無菌室（主要通過無菌空氣維持無菌狀態，操作員進入前預處理）；（3）無菌操作：在動手進入無菌環境操作前，先用酒精消毒雙手；然后如果是用接菌環轉移微生物，則接菌前先將接菌環在酒精燈外炎灼燒，待冷卻后后再操作；如果是轉移液體培養物，則可利用無菌移液槍進行。（PS：培養基滅菌：一般培養基采用0.1013MPa，121.3℃,15~30min；含糖類的培養基常在0.56Kg/cm2,112.6℃,15~30min;對于含糖類要求較高的培養基，可先將糖進行濾菌或間接除菌，再與其他已滅菌成分混合）（PS2：大多數實驗室中稱一個樣品無菌，就是指在樣品中找到活菌體的可能性不大于百萬分之一）十、消毒與滅菌-微生物生長繁殖的控制消毒（disinfection），較大程度上減少物體表面或材料內部病原微生物的數量，使其無法引起疾病。滅菌（sterilization）殺死或除去材料中或物品上所有的微生物。微生物生長控制三規律：（1）微生物死亡呈對數速度，即在一定時間間隔內微生物以一定比例死亡；（2）微生物數量越少，滅菌所需的時間越短（盡可能做好滅菌前的預處理）；（3）不同微生物對不同抗微生物劑敏感度不同。根據消毒滅菌原理不同可分為兩大類：（1）化學物質控制法：1、抗微生物劑（antimicrobialagent），一類能夠殺死或抑制微生物的化學物質，可以使天然產物也可是人工合成產物。一方面，根據抗微生物的特性可分為3類：1、抑菌劑：能抑制，但不能殺死細菌；2、殺菌劑：能殺死微生物，但不能使細胞溶解；3、溶菌劑：通過誘導細胞裂解來殺死微生物；另一方面，根據作用效果和作用范圍可分為2類：1、消毒劑：通常用于非生物材料上微生物的殺滅（如儀器設備、墻壁地板、家具，水池等；空氣常用甲醛、石碳酸、高錳酸鉀等進行熏蒸）；2、防腐劑：具有殺死或抑制微生物生長的能力，但一般對于動物或人體組織無毒害作用（如0.1—1%硝酸銀用于防止新生兒眼部因淋病奈琴氏菌感染的致盲）。 2、抗代謝物（antimetabolite），一類能夠干擾微生物正常代謝從而使微生物生長受抑制的生長因子機構類似物（如磺胺類藥物，是葉酸組成部分對氨基苯甲酸（PAB）的結構類似物，磺胺類藥物被微生物吸收后取代對氨基苯甲酸，干擾葉酸形成，抑制轉甲基反應，從而導致微生物代謝絮亂。） 3、抗生素（antibiotic），由某些生物合成的或半合成的一類次級代謝物或衍生物，具有抑制或殺死微生物的能力（主要通過抑制細菌細胞壁合成、破壞細胞膜、作用于呼吸鏈以及干擾氧化磷酸化或抑制蛋白、核酸的合成來抑制或殺死微生物。）（2）物理因素控制法： 1、高溫滅菌法：包括高壓蒸汽滅菌、煮沸滅菌、間歇滅菌法滅菌、干熱滅菌、灼燒等。（PS：衡量滅菌效果的指標：1、十倍減少時間（decimalreductiontime），即在一定的溫度條件下殺死某一樣品中90%微生物或孢子及芽孢所需的時間；2、熱致死時間（thermaldeathtime），即在一定溫度下殺死液體中所有微生物所需的時間。）高壓蒸汽滅菌，一般實驗室最常用的滅菌方法，常用采用0.1013MPa，121.3℃,滅菌15~30min；煮沸滅菌，將待消毒的材料置于水中煮沸15min或以上，如果在水中加入1%碳酸鈉或2%~5%石碳酸則殺菌效果更好；間歇滅菌法：即通過流通蒸汽或蒸煮反復滅菌，基本操作：第一次蒸煮后殺死微生物的營養體，冷卻過夜后，殘留的芽孢會萌發；第二次蒸煮，便可將芽孢萌發后產生的營養體全部殺滅。—這樣反復2~3次，可以完全殺死樣品中含有的芽孢，也可以保持某些營養物質不被破壞；干熱滅菌：主要針對一些玻璃、金屬器皿等耐熱物品，但所需時間要比濕熱滅菌長（如：170℃需要1h，160℃需要2h，121℃需要16h）（PS2：巴斯德消毒法：1、瞬時法，71.6℃—至少15s（現在常用超高溫瞬時法：140℃—5s）2、維持法：62.9℃，維持30min，可殺滅大部分微生物。） 2、輻射滅菌法（radiationsterilization）：利用電輻射產生的電磁波來殺死微生物。如微波，通過熱效應殺滅細菌；UV、X-ray、γ-ray等通過干擾或直接破壞大生物分子來達到殺滅微生物的效果。 3、過濾法除菌：該方法主要針對空氣和不耐熱液體培養基等設計的方法，有三種類型：1、（最原始的）在一個容器的兩層濾板間填充棉花、玻璃纖維。石棉等；2、膜濾器，由醋酸纖維素或硝酸纖維素制成的帶微孔（0.22~0.45μm）的膜；3、核孔濾器，由核輻射處理的薄聚碳酸膠片（厚度10μm）再經過化學蝕刻而成（主要用于科學研究）。 4、高滲作用：微生物生長對環境的滲透壓也有一定要求，當外界滲透壓高于或低于微生物胞內滲透壓時，都會阻礙微生物的正常代謝甚至死亡，所以利用改變外界環境的滲透壓也可達到控制微生物的效果（如食品腌制）。 5、干燥作用：水是微生物細胞的重要組成部分（占活細胞90%以上），降低物質的含水量直至干燥就可有效抑制微生物生長，防止腐敗霉變等。 6、超聲波作用：超聲波可產生的空穴效應，可將進入空穴區的微生物細胞裂解破碎。十一、營養缺陷型菌株分離營養缺陷型（auxotroph），是一種缺乏合成其生存所必需的營養物質的突變型，只有從環境或培養基中獲得這些營養物質或前體物才能生長。影印平板分離法（replicaplating）：（1）將待分離突變株的原始菌株以合適的稀釋度涂布到野生型和突變型菌株都能生長的主平板a（完全培養基）上，經過培養后形成單菌落；（2）通過一個消毒的“印章”（直徑略小于培養皿底，表面包有絲絨布）將a平板的菌落分別原位轉移（或印跡）到平板c（與a平板相同營養成分）和平板d（選擇培養基，突變型無法生長）；（3）經過培養后對照觀察平板c和d上形成的單菌落，如果在c上生長而d上不生長，則為所需的分離的突變型；（4）在c平板上挑取d平板上不能生長的相應位置的單菌落，并進一步在完全培養基上劃線純化。十二、病原體驗證試驗1、科赫定理4原則：（要證明某種微生物是引起某種疾病的致病因子所必須滿足的4條原則）（1）在每一個病例中必須找到特異的病原體；（2）病原體必須能從患病宿主中分離得到，且能純培養；（3）將純培養的病原體接種到健康的易感宿主，能夠引起同樣的病癥；（4）從接種后患病的實驗宿主中必須能分離到與原始病原體相同的病原體。（PS:科赫定理可以驗證多數但不是所有的病原，因為有些病原體如梅毒密螺旋體很難培養，直到現在也未能人工培養；又有些除了人以外無其他宿主的微生物，除非有志愿者，否則無法接種易感宿主。）2、驗證方法之科赫定理驗證法：（a）從感染動物體內分離疑似病原體微生物，然后進行純培養；（b）將分離并純培養后的微生物注射到易感健康的實驗宿主體內；（c）如果動物患病（可能死亡），分離其體內的疑似病原微生物，并純培養；（d）比對兩次分離得到的純培養物，如果相同則證明所提取的微生物為該疾病的病原體。十三、菌株鑒定常規鑒定大致的步驟（以細菌為例）：（1）首先要掌握菌株的一些基本特征，如細胞的形態、革蘭氏染色結果、以及其他突出的形態學特征；（2）了解其營養類型、需氧性等突出生理生化特征；（3）在前邊的基礎上查閱分類（鑒定）手冊或有關資料，確定該菌株屬于哪一大類，然后利用資料中有關該類群的分類檢索表或特征比較表格等資料中所提供的鑒別特征進行進一步的特征測定；（4）在根據測定結果查對檢索表或有關特征描述，逐步縮小菌株的歸屬范圍，初步確定菌株所歸屬的科、屬；（5）如果要鑒定到種，則需要進一步查閱相關屬的分種檢索表或相關分種的鑒別特征資料。進一步地鑒定，最后初步確定其歸屬的種。鑒定方案2：（1）對鑒定樣品進行檢查，看是否需要進一步純化；（2）測定該菌株的一些最基本的形態和生理生化特征，然后根據微生物分類鑒定手冊等有關資料，確定該菌株屬于哪一大類；（3）根據待測菌株所屬的類群，進行16rRNA或18SrRNA基因序列測定，從而可以得知該菌株與相關數據庫中已知微生物的相似性，進而初步確定其分類地位；（4）進一步檢測該菌株的表型特征、生理生化特征以及相關化學組分，必要時進行管家基因序列等分析；（5）綜合前邊的檢測結果，確定菌株的分類地位。十四、微生物的保藏技術1、傳代培養保藏（短期）采用傳代培養保藏微生物應注意針對不同菌種選擇適宜的培養基，并在規定時間內進行轉移；在瓊脂斜面上保藏微生物因菌種的不同，保藏的時間也會不同，一般來說通過降低被保藏微生物的代謝水平或防止培養基干燥可以延長傳代保藏保存的時間。（如：在菌株生長良好時，改用橡皮塞密封或在培養基上覆蓋上一層石蠟，并且降低保藏溫度；）（PS：懸液保藏法：將一些菌苔直接刮入蒸餾水或緩沖液中，密封置于4℃保藏。）常用方法：瓊脂斜面、半固體瓊脂柱及液體培養基。缺點：長期傳代操作繁瑣、容易放生污染，菌株容易放生突變而產生衰退。2、冷凍保藏微生物處于冷凍狀態時，其代謝作用也會停止，可達到保藏的目的。注意事項1：進行冷凍時，應適當采用速凍的方法，可避免產生大冰晶從而損傷細胞；同時，升溫時也應采用快速升溫的方式，可避免因升溫而使冰晶增長產生對細胞的傷害；注意事項2：冷凍時的介質也會對細胞產生損傷，因此，像冷凍前加入甘油或二甲亞楓可降低細胞強烈的脫水作用來保護細胞，所以一般冷凍保藏時都需要加入保護劑來提高保藏物的存活率。注意事項3：一般推薦（加了甘油保護劑）在-70℃低溫冰箱保存，如條件不足，在-20~-30℃普通冰箱保存是應注意避免因冰箱溫度變化引起的培養物的反復凍融而造成的細胞損傷。3、干燥保藏法（最普遍、有效） 常見的干燥保藏技術：沙土管保存和冷凍真空保藏。沙土管保存，主要適用于產孢子的微生物，如芽孢桿菌、放線菌等；一般過程：（1）將菌種接種到斜面，培養至長出大量孢子；（2）洗下孢子制成孢子懸液；（3）然后加入無菌的沙土管中，減壓干燥直至將水分抽干；（4）最后用石蠟、膠塞等封閉管口，置于冰箱。冷凍真空保藏，是將加有保護劑的細胞樣品預先冷凍，使其凍結后，在真空狀態下通過冰的升華作用去除水分；干燥后的樣品可以在真空或惰性氣體的密閉環境中低溫保存，從而使微生物處于干燥、缺氧、低溫的狀態下進入休眠，進而可長時間地進行保藏。十五、培養基（culturemedium）1、配制原則：①選擇適合的營養物質：一般而言，培養基都應含有碳源、氮源、無機鹽、生長因子、水和能源。但由于微生物營養類型復雜，對營養物質要求也不一樣，因此配制培養基時，應首先針對所培養的微生物的營養類型來配制針對性強的培養基。一般常用的3種培養基：（1）牛肉膏蛋白胨培養基，常用于培養細菌；（2）高氏一號培養基，用于培養放線菌；（3）查氏培養基，用于培養霉菌；（PS：酵母菌常用麥芽汁培養基）；②適宜的營養濃度及配比：培養基中營養物質濃度合適時微生物才能良好生長，濃度過低不能滿足微生物正常代謝生長，過高則會抑制生長。另外培養基中各營養物質的之間濃度配比也會影響微生物的生長代謝，其中尤其是碳氮比。③PH控制：一般而言，細菌和放線菌適于PH7~7.5范圍內生長；酵母菌和霉菌適合在PH4.5~6范圍內生長；然而由于微生物在生長繁殖過程中的新陳代謝會使的培養基的PH產生變化，所以通常會在培養基中加入磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀混合而成的緩沖劑，以控制PH。④控制氧化還原電位：不同微生物生長對氧化還原電位的要求不一樣，一般好氧菌Φ值在0.1V以上能正常生長（0.3~0.4V為宜），厭氧菌只能在低于0.1V條件下生長，兼性厭氧菌在Φ值為0.1V可進行有氧呼吸，0.1V以下進行發酵；控制方法：在PH值穩定情況下，提高氧分或加入氧化劑可增加Φ值；在培養基中加入抗壞血酸、半胱氨酸等還原性物質可降低Φ值。⑤原料選擇：盡可能利用廉價且易于獲得的原料作為培養基成分，特別是在發酵工業中。⑥滅菌處理：要獲得純培養物，就必須避免雜菌污染，因此需要對使用器材、工作場所和配制好的培養基進行消毒滅菌。培養基常用高溫高壓滅菌處理，工作場所常定期使用福爾馬林進行熏蒸。2、幾種培養基：（1）基礎培養基：含有一般微生物生長繁殖所需要的基本營養物質的培養基；可滿足大部分微生物的最基本生長需求（如：牛肉膏蛋白胨培養基）；（2）加富培養基，也稱營養培養基即在基礎培養基中加入某些特殊的營養物質制成的類營養豐富的培養基（特殊營養物質：如血液、血清、酵母浸粉、動物組織液等），常用于培養營養要求嚴苛的異養微生物（如百日咳德氏菌）；（PS：加富培養基與選擇培養基區別：加富培養基是用來增加所要分離的微生物的數量，使其形成生長優勢從而得到分離；而選擇培養基一般是抑制不需要的微生物的生長，從而使所需要的微生物增殖。）（3）鑒別培養基，用于鑒別不同類型微生物的培養基。原理：通過加入某種特殊的化學物質，從而使目標微生物在培養基生長后能產生某種代謝物，而這種代謝物可以與培養基中的特殊化學物質發生特殊的化學反應，產生明顯的特征性變化，進而就可將該微生物與其他微生物區分開來。（PS：主要用于快速分類鑒定以及分離和篩選菌種）（4）選擇培養基，用來將特定的微生物從混雜的微生物群體中分離出來的培養基；其原理是在培養基中加入特定的化學物質或特殊營養物質，抑制不需要的微生物生長，來增加所需微生物的生長繁殖。（5）其他幾種培養基：a.分析培養基，常用來分析某些化學物質的濃度也可用于分析微生物的營養需求；b.還原性培養基，專門用來培養厭氧型微生物；c.組織培養物培養基，含有動植物細胞，用來培養病毒、衣原體、立克次氏體等專性活細胞寄生的微生物。3、培養技術的突破與發展：進展一、在培養基中加入一些非傳統的生長底物促進新型微生物的生長，并發現一些新生理型的微生物。（如從海底沉積物中分離出一種以有毒亞磷酸作為電子供體，硫酸作為受體的新型化學能無機自養微生物—Desulfotignum）；進展二、采用營養成分缺乏的培養基—營養濃度是正常的1%（如以補充磷酸鹽、銨鹽和有機碳源的海水為培養基，研究發現了北美西海岸的浮游細菌（SAR11）的生態分布和確定其進化的分類地位）；進展三、采用新穎的培養方法，模擬天然環境，以流動式供應營養液，使不同微生物細胞間可以進行細胞交流，實現細胞互喂（cross-feeding），促進菌落形成。方法有：細胞微囊法和擴散小室法。十六、顯微鏡與顯微技術根據顯微鏡的成像原理可將當前所使用的顯微鏡分為3類：光學顯微鏡、電子顯微鏡和探針掃面顯微鏡。（1）光學顯微鏡。1、明視野顯微鏡，原理：光纖投射照明，物象處于亮背景中。2、暗視野顯微鏡，通過特殊的聚光器實現斜射照明，亮物象形成于暗背景中。（應用：不易被染色或染色易破壞樣本結構的觀察-如梅毒密螺旋體；觀察活細胞運動）3、相差顯微鏡，通過特殊的聚光器和物鏡將通過樣品不同部位產生的光波相位差轉變為振幅差（明暗差異），以提高樣品不同部位間的反差。（應用于活細胞及其內部結構的觀察）4、熒光顯微鏡，經過熒光染料染色或熒光抗體處理的樣品在紫外線等短波長光照射下激發出長波光的可見光，在暗背景中形成明亮的彩色物象。5、激光共聚焦顯微鏡，以激光作為光源，每次照明樣品的一個點，連續掃描后經計算機處理獲得樣品二維或三維圖像，對工作環境和技術操作要求較高。（應用：對完整細胞的細微立體結構進行觀察和分析）（2）電子顯微鏡。1、透射電鏡，用電子束作為“光源”聚焦成像，分辨率較光學顯微鏡大大提高，但設備龐大、造價高昂，樣品觀察需要真空環境。（用于觀察病毒等顆粒微小的樣品的形態特征或通過超薄切片觀察細胞內部結構）2、掃描電鏡，電子束在樣品表面進行掃描，收集樣品表面被激發形成的二次電子形成的物象。（一般用于觀察樣品表面的立體結構）（3）探針掃描顯微鏡。（此類顯微鏡相比電子顯微鏡，能提供更高分辨率，且可在生理狀態下對生物大分子或細胞結構進行觀察，對觀察環境要求相對較低，且儀器體積小，價格也相對便宜）1、隧道掃描顯微鏡，用細小的探針在樣品表面進行掃描，通過記錄針尖和樣品間隧道效應電流的變化形成物象。2、原子力顯微鏡，利用細小探針對樣品表面進行恒定高度掃描，同時通過一個激光裝置來監測探針隨樣品表面的升降變化來獲得樣品表面形貌信息。十八、同步培養技術(synchronousculture)同步培養，是一種使微生物群體中不同步的細胞轉變成能同時進行生長或分裂的群體細胞的培養方法；同步生長，以同步培養方法使群體細胞能處于同一生長階段，并同時進行分裂的生長方式。同步培養主要可歸納為兩大類：機械法和環境條件控制技術。 1、機械法：常用的有三種：（1）離心法（質量），將不同步的細胞懸浮在不被這種細菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液中，通過密度梯度離心將不同細胞分布呈不同細胞帶，每一細胞帶大致都是出于同一生長階段，分別將其取出進行培養便可獲得同步細胞；（2）過濾分離法（大小）：將不同步的細胞培養物通過孔徑大小不同的微孔過濾器，從而將大小不同的細胞分開，然后分別將濾液中的細胞取出進行培養，就可獲得同步細胞；（3）硝酸纖維素濾膜法（粘附性），其原理是根據細菌能緊緊地結合到硝酸纖維素濾膜上的特點，將細菌懸液通過墊有硝酸纖維素濾膜的過濾器，然后將濾膜顛倒過來，在讓培養基流過濾器，以洗去未結合的細菌，這時新分裂的細菌被洗下來，分步收集并通過培養即可獲得同步細胞。 2、環境條件控制法：這類技術是根據細菌生長與分裂對環境因子要求不同的原理設計的一類同步細胞的方法。主要有：（1）溫度控制法：通過適宜與不適宜的溫度來回交替處理后，通過培養便可獲得同步細胞；（2）培養基成分控制法：培養基中的碳、氮源或生長因子不足時，可導致細菌緩慢生長直至停止。因此，方法一（饑餓法）：將不同步的細菌在營養不足條件下培養一段時間，然后再轉移到營養豐富的培養基中培養；方法二（抑制法）：將不同步細胞轉接到含有一定濃度的，能抑制蛋白質等生物大分子合成的化學物質（如抗生素等）的培養基中培養一段時間，再轉接到完全培養基里培養。十九、微生物生長測定技術微生物生長測定，可以用來客觀評價培養條件、營養物質等對微生物生長的影響，或評價不同的抗菌物質對微生物產的作用效果，或客觀反映微生物的生長規律。測定方法有：計數法、重量法和生理指標法等。 1、計數法，此類方法通常用來測定樣品中所含細菌、孢子、酵母菌等單細胞微生物的數量。其中又可分為：（1）直接計數法，利用特定的血球計數板或細菌計數板，在顯微鏡下計算一定容積里樣品中的微生物數量；缺點：不能區分活、死細胞；計算公式：每毫升原液細菌數=每小格平均細菌數*400*1000*稀釋倍數。（2）間接計數法，又稱活菌計數法，原理：每個活細菌在適宜的培養條件下可以通過生長形成單一的菌落；常用方法：將待測樣品經一系列10倍稀釋，然后選擇3個稀釋度的菌液，分別取0.2ml放入無菌培養皿中，在倒入適量的已熔化并降溫至45℃左右的培養基，混勻、冷卻凝固后放入是以環境中培養，長出菌落后計數；公式：每毫升原液活菌數=同一稀釋度3個以上重復培養皿菌落平均數*稀釋倍數*5；缺點：易于因人為失誤而造成污染或結果不穩定和測定絲狀體微生物。（3）比濁法，原理：在一定范圍內，細菌的懸液中細胞濃度和渾濁度呈正比，即細菌數量越多，光密度越大。方法：借助于分光光度計，在一定波長下測定菌懸液的光密度（opticaldensity-OD）表示菌量。 2、重量法，是根據每個細胞都有一定的重量而設計的，用于單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長的測定。方法（鮮干重）：將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經過洗滌，再離心后直接稱重，求出濕重（如果是絲狀微生物，過濾后用濾紙吸干是水分再稱重）；然后將樣品裝入已知重量的培養皿等容器中，在105℃下烘干至恒重，后在干燥器中冷卻，稱量干重。（PS：如果測定長在培養基上的絲狀真菌、放線菌，可將培養基緩慢加熱到50℃熔化瓊脂，再過濾得到菌絲體，然后用生理鹽水洗滌）；（PS2：凱氏定氮法—總含氮量與蛋白質總量間的關系換算公式：蛋白質總量=含氮量*6.25；細胞總量=蛋白質總量/65%約等于總蛋白質量*1.54） 3、生理指標法，生理指標包括微生物的呼吸強度、耗氧量、酶活性、生物熱等，樣品中生物數量越多或生長越旺盛，這些指標越明顯，因此借助特定儀器如瓦勃氏呼吸儀、微量量熱計等來測定。（主要用來分析微生物的生理活動）二十、病毒研究的基本方法主要有：病毒的分離與純化、病毒定量測定、病毒的鑒定三大類。1、病毒的分離與純化：（1）分離病毒的分離是將疑有病毒而待分離的標本經過處理后，接種于敏感宿主、雞胚或細胞中培養，經過一段時間孵育后，通過檢查病毒特異性感染表現或用其他方法來肯定病毒存在的研究方法。主要過程：（a）標本采集與處理：原則，應確保用于分離的樣本應含有足夠量的活病毒；所以采集策略：根據所需采集標本的種類，確定采集時間和標本處理方法；此外，一方面為了避免細菌污染，標本一般都應該加入抗生素除菌（或用過濾、離心），另一方面，為了使病毒充分釋放且保持活性，在研磨或超聲波處理后應該立即接種（若需保存或運送，數小時內可置于50%中性甘油內4℃保存，較長時間則需-20℃或干冰保存）；（b）標本接種與感染表現：接種策略，標本接種于何種實驗宿主（雞胚、細菌、動物細胞等），以及選擇何種接種途徑主要取決于病毒宿主的范圍和組織嗜性，同時應該考慮操作簡單、易于培養、所產生的感染結果容易判斷等要求。（例如：噬菌體—細菌培養物，液體培養基-渾濁變清澈，瓊脂平板-噬菌斑；嗜神經病毒—腦內接種；嗜呼吸道病毒—鼻腔接種、雞胚尿囊等）（PS：由于組織培養生長的細胞對病毒敏感性較體內成熟細胞高，同時體外也沒有免疫系統干擾，操作相對簡便，所以目前多數動物病毒都利用離體細胞來培養）。感染表現：顯微鏡觀察現象—大多數動物病毒感染敏感細胞培養物都能引起細胞產生病變效應（cytopathiceffect，CPE），如細胞聚集成團、腫大、圓縮或形成合胞體、出現包涵體，乃至細胞裂解等現象；所以接種于細胞培養的標本主要以細胞病變作為病毒感染指標。肉眼觀察現象—標本進過適當稀釋在進行接種并輔以染色處理，病毒便可在單層細胞上形成肉眼可見的局部病損區域，即蝕斑（Plaque）。 （2）病毒純化制備純凈的病毒材料而盡可能除去其他雜質的過程。1、兩大純化標準：（a）純化的病毒制備物必須保持病毒原有的感染性；（b）純化病毒制備物的毒力大小、形態、密度、化學組成及抗原特性應當具有均一性表現，并可利用超速離心、電泳、電鏡或免疫學技術進行檢查。2、常用純化方法：第一，利用蛋白質提純的方法來純化病毒（病毒的主要成分是蛋白質）故可以使用鹽析、等電點沉淀、有機溶劑沉淀、凝膠層析及離子交換層析等；第二，超速離心純化，因為病毒顆粒有一定的大小、形狀和密度，，一般可以在10000~100000g的離心場中沉淀1~2小時。（廣泛用于病毒純化）2、病毒感染性測定（assayofinfectivity）病毒的感染性測定，是指對有感染性病毒顆粒數量的測定；感染性測定所測得的都不是感染性病毒顆粒的絕對數量，而是能引起宿主或細胞一定特異性反應的病毒最小劑量，即感染單位（IU）；病毒的效價（滴度）：每毫升病毒懸液所含的感染單位數目（IU/ml）。測定方法：（a）蝕斑測定法（最先是為測定噬菌體感染性所建立的）：原理：病毒感染細胞后，由于固體介質的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細胞向周邊擴展。經過幾個增殖周期，便形成一個局限性病變細胞區，此即病毒蝕斑。從理論上講，一個蝕斑是由最初感染細胞的一個病毒顆粒形成的，因而該項技術常用于病毒顆粒計數和分離病毒克隆。噬菌體檢測：一般采用瓊脂疊層法，即以一定量的經過系列稀釋的噬菌體懸液分別于高濃度的敏感細菌懸液以及半固體營養瓊脂均勻混合后，涂布在已鋪有較高濃度的營養瓊脂平板上，經過孵育后在延伸成片的菌苔上可出現分散的單個噬菌斑。因為噬菌斑的數目與加入樣品的有感染性的噬菌體顆粒數量呈正比，統計噬菌斑數目后可計算出噬菌體懸液的效價，并以菌落形成單位（PFU）/mL表示；動物病毒檢測：其噬菌斑的測定方法與噬菌體的噬菌斑計數方法類似，不同在于動物病毒是以生長在固定支持物上的單層細胞代替了菌苔，由于動物病毒在單層細胞上所產生的蝕斑表現不同，所以有空斑測定、合胞體計數、轉化灶測定和吸附蝕斑測定等不同方式，但最終的病毒效價都以蝕斑形成單位PFU表示。植物病毒：壞死斑測定（枯斑測定），用金剛砂之類的能破壞植物表皮與細胞壁的粉末狀物質與一定量的植物病毒混合摩擦植物葉片進行接種，以產生的壞死斑的數目來測定病毒效價。（PS：病毒懸液的滴度以每毫升蝕斑形成單位（PFU/ml）來表示。例如，3個細胞瓶的平均蝕斑是58，接種量為0.2ml，病毒的稀釋度為2.5×103，則病毒原液的滴度為：58÷0.2×2.5×103＝7.25×105（PFU/ml））（PS2：技術應用：蝕斑技術可以應用于分離病毒的克隆（無性繁殖純系）、病毒或血清的滴定，也可用蝕斑形態和大小研究病毒的生物學特性。）（b）終點法（針對不能形成蝕斑或或壞死斑的動植物病毒）操作方法：1、取等體積的進過10倍或2倍稀釋的病毒系列稀釋液分別接種同樣的實驗單元；2、經過一致時間孵育后，試驗單元群體中的半數（50%）個體出現某一感染反應所對應的病毒劑量確定為病毒樣品的效價（半數效應劑量），以對應的病毒稀釋度的倒數的對數值表示。半數效應劑量類型：（1）半數致死劑量—LD50；（2）半數感染劑量—ID50；（3）半數組織培養感染劑量—TCID50。3、病毒的鑒定（1）根據病毒感染宿主范圍及感染表現鑒定，大多數病毒都有相當專一的宿主范圍，因而病毒的宿主譜可作為病毒初步鑒定的指標；（2）病毒的理化性質鑒定，利用電鏡技術、超速離心技術等可檢查毒粒大小、形態和結構特征，測定病毒及其組分的沉降系數、浮力密度和相對分子質量，鑒定病毒的核酸類型；以及紫外線、化學藥劑和脂溶劑等理化因子對病毒感染性作用，確定病毒的對不同理化因子的敏感性。（3）血細胞凝集性質鑒定，許多病毒能吸附于一定種類的哺乳動物劇或禽類的血細胞表面產生凝集現象，而且不同的病毒所凝集的血細胞的種類以及發生凝集所要求的溫度、PH條件可能不同，這些性質給病毒鑒定提供了重要的依據。（4）免疫學鑒定，建立在抗原-抗體特異性反應基礎上的免疫學方法是一類常見且重要的病毒鑒定方法，主要技術有：免疫沉淀反應、凝集反應、酶聯免疫反應、血凝抑制實驗、中和實驗、免疫熒光、免疫電32鏡以及單克隆抗體等。PS：利用病毒的性質來檢測抗原-抗體反應的方法：血凝抑制實驗和中和實驗。血凝抑制實驗，是根據特異性的病毒抗體和病毒表面有凝血活性的蛋白質結合，可抑制病毒血細胞凝集反應發生的原理而設計的；中和實驗，是建立在病毒中和作用的基礎上，即某些特異性病毒抗體與病毒顆粒作用，能夠使病毒失去感染能力從而阻止了病毒的繁殖的原理設計的。（5）分子生物學方法，可運用聚丙烯酰氨凝膠電泳、蛋白質肽圖與N端氨基酸分析、核酸的酶切圖譜和寡核苷酸圖譜分析、分子雜交、序列測定及PCR等方法鑒定病毒核酸、蛋白質等組分的性質，在分子水平上闡明病毒性質，可對進行準確分類鑒定提供直接可靠的證據。（例如尚不能在細胞培養中增殖的人乳頭瘤病毒（HPV）的檢測主要是用各種類型的核酸雜交方法，其分型亦是根據基因組的序列同源性，分型界限是50%同源性，超50%同源性則為亞型）二十一、DNA作為遺傳物質的實驗證明DNA作為遺傳物質的第一個實驗：Avery和他的合作者分別用降解DNA、RNA或蛋白質的酶作用于有毒的S型肺炎雙球菌細胞提取物，選擇性地破壞這些細胞成分，然后在于R型細胞混合；觀察結果顯示，只有DNA被酶降解的提取物無轉化作用，從而說明了DNA是格里菲斯實驗中的轉化因子。證明DNA是遺傳物質的第二個實驗：1953年，Alfred和Martha用32P標記T2噬菌體的DNA和用35S標記噬菌體的蛋白質外殼，然后用這兩種不同標記的病毒分別侵染大腸桿菌，后離心分析發現，用含有35S蛋白質的T2噬菌體感染大腸桿菌時，大多數放射性同位素都留在宿主細胞外邊，而用32P標記的T2噬菌體侵染宿主時，則發現32PDNA被注入了宿主細胞，并產生了噬菌體后代。二十四、誘變育種技術誘變育種是指通過各種誘變劑處理微生物細胞，提高基因突變頻率后在通過一定的篩選方法獲得所需的菌株。常用的誘變育種方法：物理誘變—紫外線誘變法：1、誘變處理前，先開紫外線燈預熱20min，使光波穩定；2、將3~5ml細胞懸液置于6cm培養皿中，置于誘變箱內的電磁攪拌器上照射3~5min進行表面殺菌；3、打開培養皿蓋，開啟電磁攪拌器，照射處理一定時間（根據實際情況）；4、處理后，在紅光燈下，吸取一定量的菌液，經過稀釋后，去0.2ml涂平板（或經暗培養一段時間后涂板）。化學誘變—5-溴尿嘧啶（5-BU）誘變法：1、稱取5-BU，加入無菌生理鹽水微熱溶解，使濃度為2mg/ml；2、將細胞培養至對數期并重懸浮于緩沖液或生理鹽水中過夜，使其耗盡自身營養物質；3、將5-UB加入培養基中，濃度10~20ug/ml，混勻后倒平板，涂菌液，使其在生長過程中誘變，然后挑取菌落測定。（PS：1、為了提高誘變效率，常用物理、化學兩種誘變劑交替使用；2、一般選用菌株的對數期效果最好）二十五、誘導原生質體融合技術原生質體融合技術是將遺傳性狀不同的兩種菌融合為一個新細胞的技術。主要步驟包括：原生質體準備、原生質體融合、原生質體再生和融合子選擇。原生質體準備：酶處理，完全消化或部分消化細胞壁，釋放原生質體；原生質體融合和再生：可通過化學因子誘導或電場誘導進行融合，其中化學誘導常用PEG作為誘導劑，加入PEG后再加入鈣離子、鎂離子等陽性離子；電融合技術，是將原生質體置于電場中極化偶極子，并沿電力線方向排列成串，然后施加直流脈沖擊穿原生質體膜，促進其融合。誘導融合結束后，將原生質體置于再生培養基上（高滲培養基），使其細胞壁得以再生。融合子篩選：主要依靠在選擇培養基上的遺傳標記，有兩個遺傳標記互補，就可以確定融合子。其中一樣缺陷標記是常規而準確的選擇方法，另外，還有滅火原生質法—將融合的親株原生質體滅活后融合可獲得具有活性的融合子（可用于沒有遺傳標記的情況）；以及熒光染色法—在雙親原生質體制備過過程中，向酶解液中加入熒光色素使其形成帶有熒光色素的原生質體。二十六、DNAshuffling技術DNAshuffling是一種人工分子進化技術，可模擬生物的分子進化歷程，并可在短的實驗循環中定向篩選出特定基因編碼的酶蛋白活性提高幾百至上萬倍的功能性突變基因。原理：將來源不同但功能相同的一組同源基因，用DNA核酸酶I進行消化產生隨機小片段，由這些隨機小片段組成一個文庫，使之互為引物和模板，進行PCR擴增，當一個基因拷貝片段作為另一個基因拷貝片段的引物時，會引起模板轉換，重組因而產生，導入細胞后，再選擇正突變體作為新一輪的體外重組。優點：篩選效率高，2~3次循環即可獲得突變體。缺點：主要適合于某一基因產物量的提高，而無法處理多種性狀的改變。二十八、原位研究方法（微生物生態）原位研究方法，即在自然或模擬自然條件下觀察微生物的結構與功能的研究方法。主要有：原位觀察、微生境模擬技術原位觀察：激光共聚焦顯微鏡來實現微生物群落的原位觀察；微生境模擬技術：微生境是直接對微生物產生效應的環境，通過控制生境中環境因素可模擬微生境和發生于微生境中理化因子的梯度變化，從而可對微生物的活動進一步了解。此外，原位培養是另一種微生境技術，一般使用瓶子、實驗通等組成圍隔，將要研究的樣品放入原來的位置進行培養。重組病毒載體基因工程基因工程的核心內容：基因重組、克隆和表達。基本操作過程：（1）基因的獲取外源基因可從基因文庫或cDNA文庫中分離，或通過化學合成基因，也可以通過PCR體外擴增基因，甚至可以借助定位誘變獲取改造后基因。（2）外源基因與載體體外重組利用DNA重組技術，將外源基因插入到質粒、病毒或染色體DNA片段構成的載體中，形成具有自主復制起點的“重組DNA分子”（3）重組DNA分子導入宿主細胞通過轉化、轉染、感染等方式將重組DNA導入微生物或動植物細胞中，使其復制，由此可獲得基因克隆。（4）目的克隆的篩選與鑒定通過載體攜帶的遺傳標記等方法篩選出帶有外源基因的陽性克隆，并且在獲得目的克隆基因后還需要進行鑒定和測序。（5）控制外源基因的表達通過控制適當條件，使導入的基因在細胞內得到表達，產生出人們所需要的產物，或使生物體獲得新的性狀。Module2：微生物的生理生化病毒與細菌的生長規律：一、病毒復制（生長）規律：研究方法-一步生長曲線（one-stepgrowthcurve），基本方法是以適量的病毒接種于高濃度的敏感細胞中，待病毒充分吸附后，高倍稀釋病毒-細胞培養物（或以抗病毒血清中和多余未吸附的病毒）以建立同步感染，然后繼續培養，定時取樣測定培養物中的病毒效價，并以感染時間為橫坐標，病毒的效價為縱坐標，從而繪制出病毒特征性的繁殖曲線。由圖可知病毒在整個繁殖周期可分為：吸附期—潛伏期（包含隱蔽期）—裂解期—穩定期。從病毒的一步生長曲線中可以獲得兩個病毒繁殖的兩個特征性數據：潛伏期（latentperiod）—即病毒吸附于細胞到受感染細胞釋放子代病毒顆粒所需的最短時間；裂解量（burstsize）—每個細胞產生的子代病毒顆粒的平均數目（裂解量=潛伏期受感染細胞數/穩定期受感染細胞所釋放的全部子代病毒顆粒數）。PS：隱蔽期（eclipseperiod），病毒在受體細胞內消失到出現新的感染性病毒的時間。復制周期：病毒的復制過程可分為5個階段：吸附-侵入-脫殼-表達與復制-裝配與釋放。病毒的侵入機制：1、完整的病毒通過膜移位方式侵入；2、利用細胞內吞作用侵入，此方法又稱病毒入胞（viropexis）；3、毒粒包膜與細胞膜發生融合；4、以抗體依賴性的增強作用，即病毒與亞中和濃度的抗體結合，形成病毒-抗體免疫復合物通過細胞膜表面的免疫球蛋白受體侵入胞內。病毒復制的時序性：即病毒基因組的轉錄是分期進行的，其中發生于病毒核酸復制前的轉錄為早期轉錄，早期轉錄主要是轉錄參與病毒核酸復制、調節病毒基因表達以及改變宿主生物生物分子合成系統的蛋白質；而核酸開始復制或復制后的轉錄稱為晚轉錄期，主要轉錄產生構成子代病毒顆粒的結構蛋白。PS：現在已知的病毒受體并非為病毒感特異性單獨表達的受體，而多數都為細胞的特定受體，也可能是細胞特定受體外的細胞蛋白。二、細菌生長規律：研究方法：在分批培養（batchculture）中以時間為橫坐標，細菌數量為縱坐標，根據不同時期細菌數量的變化所繪制的可反映整個培養期間細菌數量變化規律的曲線，即為生長曲線。由生長曲線可知細菌群體在整個生長過程中可分為：遲緩期（lagphase）—對數生長期（logphase）—穩定生長期（stationaryphase）—衰亡期（deathphase）。1、遲緩期：是由于細菌在接觸到一個新環境時，暫時缺乏足夠的能量和代謝因子，而造成生長繁殖遲緩的現象。但遲緩期對于菌落的生長也是必需的，因為細胞在分裂復制前也需要時間對各組分進行復制和裝配。所以在工業運用上可采用一下4中方法來縮短遲緩期：（1）通過遺傳學方式改變菌種的遺傳特性是遲緩期縮短；（2）采用處于對數生長期的細胞最為“種子”；（3）盡量保持接種前后的培養基成分一致；（4）適當擴大接種量。2、對數生長期：是細菌數量急劇而相對穩定增加的時期，這時期的細菌代謝活性和酶活性高而穩定，細胞大小一致且生活力強，可作為工業接種的“種子”和實驗研究的理想材料。3、穩定生長期：這個時期由于細菌所處的生長環境逐步不適宜細菌生長，所以在這時期細菌生長速率可降低至0。生長曲線可獲得主要參數：遲緩時間，比生長速率，總生長量。遲緩時間（T）：微生物生長過程中在實際條件下達到對數生長期所需的時間與理想條件（無遲緩期）下達到對數生長期時間的差。—客觀反映細菌生長條件的合適度。總生長量：代表在某一時間內，通過培養所獲得的微生物總量與原來接種微生物量之差值。客觀反映了培養基與生長條件是否適合于細菌的生長。三、細菌生長曲線和病毒生長曲線的異同（生長規律）共同點：1、二者在生長過程中都會經過一段個體數量增長基本為0的時期和個體數量劇增的增長期，以及個體數量增長率再次回歸到0的穩定期；2、由二者的生長曲線都可以獲得研究對象的：①從接種到個體數量開始增加所經歷的時間參數；②個體數量增長的數量和增長的參數。不同在于兩者曲線所描繪的相似的生長時期有著本質上的區別：1、細菌所經歷的遲緩期是由于其尚未適應新生長環境而無法進行分裂增殖，而病毒則是由于已侵入細胞內進行復制增殖的緣故以至于產生出接種早期數量未增加的現象；2、細菌所經歷的個體急劇增長的對數增長期是由于細菌本生的正在進行的分裂增殖所致，而病毒經歷的個體數量急劇增加的時期是由于其裂解宿主細胞釋放已增殖完畢的子代個體的緣故；3、細菌之所以進入穩定期是由于外界營養物質消耗過多而無法再維持其數量繼續增長，而病毒則是沒有可以寄生的宿主而停止增長；4、細菌生長過程中有個體數量減少的衰退期，而病毒沒有。細菌內毒素與外毒素內毒素（endotoxins）是革蘭氏陰性菌細胞壁的脂多糖復合物，一般只有在細菌死亡或裂解時才會大量釋放出來，此外，內毒素隨細菌屬的不同而產生組分的差異，但它們都是相對穩定的分子，無特定組織親和性，所以內毒素常會引起非特異性效應，如發熱和血壓驟降。外毒素（exotoxins）是由一些革蘭氏陽性菌和少量革蘭氏陰性菌產生的分泌性可溶物質質，大部分為多肽，加熱、紫外線照射等處理后即可使之失活。另外有一些外毒素是酶，如溶血素，一種可溶解紅細胞的酶；殺白細胞素、抑白細胞素，殺死或抑制白細胞的酶。相比內毒素，外毒素更多的具有組織特異性，如肉毒素和破傷風毒素等神經毒素，是作用于神經組織引起神經信號傳遞異常的外毒素。微生物的營養類型由于微生物的種類繁多，其營養型也較為復雜，所以在不同層面和側重點上對有多種營養型劃分：如以利用碳源的來源，可分為自養型和異養型；以能源來源，可劃分為光能營養型和化能營養型；以電子供體的不同，可劃分為有機營養型和無機營養型。所以根據碳源、能源和電子供體的性質不同，我們可以將絕大部分微生物劃分為四種營養類型：光能無機自養型、光能有機異養型、化能無機自養型、化能有機異養型。1、光能無機自養型：是以無機化合物作為電子供體、二氧化碳為主要碳源、光能為能源的一類微生物；（如：藍細菌、藻類）2、光能有機異養型：是以有機物作為電子供體和主要碳源，以光能作為能源的一類微生物；（如：紅螺細菌）3、化能無機自養型：是以無機化合物作為電子供體，二氧化碳作為主要碳源，無機物氧化產生的化學能為能源的一類微生物；（如：硫細菌、硝化桿菌屬、甲烷桿菌屬等）4、化能有機異養型：是以有機物為電子供體和主要碳源，有機物的氧化的化學能為能源的一類微生物；（如：芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬）在該類型的微生物中又可根據所利用的有機物的性質的不同分為腐生型（metarophy）和寄生型（paratrophy）兩類。微生物產能代謝中產生ATP的途徑發酵中ATP產生途徑：EMP途徑，經過EMP途徑后一分子的葡萄糖可產生2分子丙酮酸和2分子ATP；ED途徑，經過ED途徑后1分子葡萄糖最后生成2分子丙酮酸、1分子ATP、1分子NADPH和NADH；磷酸解酮酶的HK途徑（明串珠菌異型乳酸發酵），2分子葡萄糖最后生成3分子乙酸，2分子乳酸、5分子ATP；呼吸作用：有氧呼吸：每一次TCA循環可產生15分子ATP。（需氧微生物完全氧化一分子葡萄糖可產生38分子ATP）無氧呼吸自養微生物產能途徑：氨氧化，即硝化細菌將氨氧化成硝酸產生ATP的過程；硫氧化，即硫桿菌氧化多種還原態的硫化合物產生ATP的過程；鐵氧化，即氧化亞鐵硫桿菌將亞鐵氧化成高價鐵產生ATP的過程；氫氧化，氫細菌通過催化氫氣離子化，通過電子傳遞系統傳遞電子的過程中驅動質子跨膜運輸從而推動ATP合成。其他：底物水平磷酸化，是指物質在氧化過程中產生的NADH和FADH2直接將電子傳遞給中間代謝產物從而生成含有高能鍵的化合物，從而直接偶聯ATP產生的途徑。氧化磷酸化，指的是物質在生物氧化過程中形成的NADH和FADH2通過電子傳遞系統將電子傳遞給氧分子會其他氧化物，從而偶聯ATP產生的途徑。光合磷酸化，是指光合微生物光合色素系統和電子傳遞系統通過吸收光量子產生ATP的途徑。微生物的物質運輸微生物物質運輸方式主要有擴散、促進擴散、主動運輸和膜泡運輸四種，其中主動運輸又包含有初級主動運輸、次級主動運輸、ABC轉運系統、Na+，K+-ATP酶系統、基團轉位和鐵載體轉運等。1、擴散：原生質膜是一種半透膜，小分子物質可以通過膜兩側的濃度差實現物質的跨膜運輸，但擴散并不是微生物細胞跨膜運輸的主要方式。2、促進擴散（facilitateddiffusion）：也是一種被動的物質跨膜運輸方式，同擴散一樣也是通過膜內外的物質濃度差來作為運輸推動力，但與擴散不同的是，促進擴散是通過載體分子來時實現物質轉運的，而且每種載體分子都有相應的轉運物質，具有相對較高的專一性。3、主動運輸（activetransport）：是微生物中廣泛存在的一種物質轉運方式，其主要特點是運輸過程中需要消耗能量和能夠進行逆濃度梯度跨膜轉運。（1）初級主動運輸：指的是由電子傳遞系統、ATP酶等介導的質子運輸，從運輸角度講初級主動運輸是一種質子的主動運輸，通過該運輸方式會導致微生物細胞原生質膜內外建立起質子濃度差，從而使膜處于充能狀態即能化膜。（2）次級主動運輸：該運輸方式指的是通過初級運輸建立的能化膜在質子濃度差消失過程中偶聯的其他3種運輸方式：①同向運輸：轉運物質與質子在同一載體中以相同方向運輸；②逆向運輸：運輸物質與質子在同一載體中按不同方向轉運；③單向運輸：指質子濃度消失過程中可促進某一特定物質通過載體以單一方向進出載體，從而造成胞內的陽離子累積或陰離子降低。（3）ATP結合性盒式轉運蛋白系統（ABC）（4）Na+，K+-ATP酶系統：是由Na+，K+-ATP酶通過水解ATP而介導的鈉離子向外運輸和鉀離子向內運送的離子轉運方式。（5）基團轉運（grouptranslocation）：又稱磷酸轉移酶系統（PTS），是厭氧菌或堿性厭氧菌中通過使糖發生磷酸化來進行糖分子運輸的運輸方式。（6）鐵載體運輸：是一種微生物吸收鐵離子的方式，主要通過對外分泌能夠與鐵離子結合的鐵載體，再鐵離子與載體形成復合物后再通過轉運蛋白或ABC轉運系統運輸至胞內。微生物的耐藥性機制一、微生物產生耐藥性的主要機制：（1）改變細胞質膜通透性，如抗四環素的委內瑞拉鏈霉菌改變了質膜的通透性從而阻止了四環素的進入；（2）改變藥物作用靶點，如抗磺胺類藥物的菌株，通過改變了二氫葉酸合成酶的性質，從而合成一種對磺胺類藥物不敏感的二氫葉酸合成酶；又如抗鏈霉素的細菌，通過合成一種與鏈霉素不親和的蛋白來組建30S亞基，來達到抗鏈霉素的作用；（3）合成修飾抗生素的酶，抗性菌株可通過合成如轉乙酰酶、轉磷酸酶等來修飾抗生素從而使抗生素失去抗菌活性；（4）產生遺傳變異，發生變異的菌株導致合成新的多聚體，以取代或部分取代原來的多聚體（如抗青霉素菌株細胞壁中肽聚糖含量降低，但合成了另外的細胞壁多聚體從而避開青霉素的作用。）二、降低藥物耐藥性的方法：1、在治療劑量下，持續使用一種合理的抗生素（抗菌藥物），直到引起疾病的微生物完全消滅；2、使用兩種能發揮協同作用的抗生素或抗菌藥物；3、只在絕對需要的時候才使用抗生素等速效抗菌藥物。噬菌體溶源轉變溶源性轉變（lysogenicconversion）是原噬菌體引起的溶源性細菌出免疫性以外的其他的表型改變，包括溶源性細菌細胞表面性質的改變和致病性的改變。原噬菌體誘發的致病性轉變可能是細菌致病機制的一個重要方向。（有些細菌感染引起的毒性來源于其包含的前噬菌體，如白喉桿狀細菌及肉毒梭菌所攜帶的前噬菌體中具有編碼產生毒素的基因，如果不包含前噬菌體，這些細菌是不會致病的）ABC轉運系統ATP結合性盒式轉運蛋白系統（ATP-bindingcassettetransportersystem，ABC轉運系統），是一種細菌利用ABC轉運蛋白轉運糖類、氨基酸和微生物B12等溶質的物質運輸途徑。ABC轉運蛋白結構特點：由兩個疏水性跨膜蛋白域與位于質膜內表面的兩個核苷酸結合域組成，兩個疏水性跨膜結構域在質膜上形成一個孔，兩個核苷酸結合域可以結合ATP。轉運機制：ABC轉運蛋白可以與結合溶質的結合蛋白結合，當溶質結合蛋白攜帶被轉運物質在質膜外表面與ABC轉運蛋白跨膜結構域結合時，ATP便會與ABC轉運結合蛋白的核苷酸結合域結合，進而發生水解產生能量供予跨膜結構域改變構象，從而使被轉運的溶質進入細胞內。革蘭氏陽性、陰性菌的細胞壁結構比對革蘭氏陽性菌的細胞壁的特點是厚度大，化學組分簡單，一般只含有90%的肽聚糖和不到10%的磷壁酸組成；而革蘭氏陰性菌的細胞壁則相對較薄，化學組分復雜，結構層次多，主要由脂多糖、孔蛋白、磷脂、脂蛋白和肽聚糖共同構成。肽聚糖的化學組成肽聚糖（peptidoglycan）又稱黏肽、胞壁質，是真細菌細胞壁特有成分。革蘭氏陽性菌：肽聚糖分子主要由肽和聚糖兩部分組成，其中肽有四尾肽和橋肽；聚糖有N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺。兩種聚糖通過β-1,4糖苷鍵構成肽聚糖分子的雙糖單位；四尾肽連接在N-乙酰胞壁酸上，是由4種氨基酸分子按L型和D型交替方式連接；肽橋，起著連接前后兩個四尾肽的作用，當前所致的肽聚糖已超過100種，其中彼此間的主要區別在于肽橋的組分上。（金黃色葡萄球菌的肽橋為甘氨酸五肽）革蘭氏陰性菌：結構單體基本與陽性菌相同，但差別在于四尾肽的第三個氨基酸被m-DAP（內消旋二氨基庚二酸）所替代；和沒有特殊肽橋連接，僅靠四尾肽的第四個氨基酸和m-DAP相連接。十一、微生物的致病性及感染和疾病區別細菌致病性：毒力是指病原菌的致病力的強弱（或病原體造成的疾病的嚴重程度）。而侵襲力和毒素則構成了致病菌毒力的物質基礎。其中，侵襲力（invasiveness）是病原菌突破宿主免疫防線并在宿主體內定繁殖生長和擴散的能力；物質基礎有1、病原菌通過具有粘附能力的結構，如革蘭氏陰性菌的菌毛黏附與宿主的呼吸道、消化道等黏膜上皮細胞的相應受體，在局部進行繁殖，積聚毒力或繼續侵入內部。2、通過莢膜或微莢膜來抵抗宿主的免疫清除，從而使病原菌在宿主體內存活；3、產生侵襲性的酶促進感染過程，如致病性葡萄球菌的血漿凝固酶具有的抗吞噬作用等。毒素（toxin），根據其來源、性質和作用不同可分為外毒素和內毒素。①外毒素通產為致病菌分泌的可溶性蛋白，毒性極強，具有很強的免疫原性，能作用于全身組織的特定部位，按作用部位的不同可分為神經毒素、細胞毒素和腸毒素三大類。外毒素中毒時，可以通過及時注射根據其免疫原性制備的抗毒素來降低外毒素造成的傷害作用。②內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁內的脂多糖，只有在菌體死亡或裂解的情況下釋放，該類毒素沒有組織特異性，廣泛作用于多種細胞核體液系統，可引起發熱和血壓驟降的癥狀，相對外毒素而言其毒性較弱。感染和疾病的區別： 感染，是指寄生性生物在宿主體表或體內生長繁殖而引起的病理過程。如果感染破壞了宿主的生理功能，則會引起疾病。疾病是機體正常生理功能發生絮亂時的生理狀態。感染和疾病都是寄生物與宿主相互作用引起的，但與疾病不同的是感染對宿主本身的影響較小。比如，一位醫生在給患者換藥時沒有嚴格采取防護措施，以至于金黃色葡萄球菌從其手上的小傷侵入其手部，不久傷口周圍就開始發紅，但這一現象只持續了一天左右，這種情況極為感染；然而，如果傷口持續紅腫，幾天后發展成癤腫，這時候的情況則可稱為疾病。病毒的致病性： 病毒是專性細胞寄生物，只能在細胞中生長增殖，且其感染是在基因水平的感染。病毒的致病性主要是因為病毒在宿主細胞內增殖，從而影響宿主細胞的正常代謝，其后果可分為3類：（1）殺細胞感染（cytocidalinfection）：指病毒在宿主細胞中復制成熟后，由于子代病毒的大量釋放使宿主細胞裂解死亡，當細胞死亡到達一定數量時就會造成組織明顯損傷，或因裂解產生的毒性物質累積到一定程度，機體就會出現顯性感染癥狀。（2）穩定狀態感染：是指相抵毒力較低的病毒感染宿主后，在相當長的一短時間內與細胞共存并繼續增殖，而這類病毒并不使細胞溶解死亡，而死常在增殖過程中引起宿主