[21]。基于去乙酰毛花苷生產過程中使用到的生產設備、起始原料、物料和直接接觸包裝材料的元素雜質含量分析，基于ICHQ3D指導原則，去乙酰毛花苷中元素雜質含量不足以對制劑構成風險。早期毛花毛地黃苷C提取和精制時引入的殘留溶劑可通過有關物質中毛花毛地黃苷C的檢查進行控制。綜上，本次研究課題主要分析的雜質來源為：一是提取分離過程殘留的糖苷和各種糖苷的降解產物地高辛、吉妥辛、洋地黃毒苷等，此類雜質采用液相色譜法進行有關物質測定；二是去乙酰毛花苷重結晶時引入的殘留溶劑，主要為甲醇和二氯甲烷，采用氣相色譜法進行殘留溶劑測定。2.1實驗儀器和試劑2.1.1實驗儀器表2-1儀器名稱及廠家儀器名稱儀器廠家Agilent1260高效液相色譜儀，紫外檢測器美國安捷倫科技有限公司XPE56微量分析天平梅特勒7890A氣相色譜儀，火焰離子化檢測器美國安捷倫科技有限公司XS105DualRange電子天平梅特勒7890A氣相色譜儀，電子捕獲檢測器美國安捷倫科技有限公司2.1.2實驗耗材表2-2實驗耗材及廠家實驗耗材耗材廠家十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（4.6mm×250mm，5μm）Kromasil6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細管柱（30m×0.53mm，膜厚3.0μm）Phenomenex2.1.3實驗試劑表2-2實驗試劑及廠家實驗試劑試劑廠家純化水廣州市藥檢所超純水儀乙腈康科德科技有限公司甲醇康科德科技有限公司去乙酰毛花苷對照品企業提供毛花毛地黃甘C企業提供甲醇對照品中國食品藥品檢定研究院二氯甲烷對照品中國食品藥品檢定研究院三氯甲烷對照品中國食品藥品檢定研究院二甲亞砜默克2.2實驗方法2.2.1HPLC法測定去乙酰毛花苷有關物質采用高效液相色譜法測定去乙酰毛花苷有關物質，梯度洗脫，毛花毛地黃苷C和未知雜質計算采用不加校正因子的主成分自身對照法計算。精密稱取去乙酰毛花苷200mg，加甲醇10ml，超聲使溶解，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀釋至100ml，搖勻，作為有關物質供試品溶液。精密量取有關物質供試品溶液1ml，置100ml量瓶中，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀釋至刻度，搖勻，作為有關物質對照溶液。精密量取對照溶液1ml，置20ml量瓶中，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀釋至刻度，搖勻，作為靈敏度溶液。精密稱取毛花毛地黃苷C20mg，置100ml量瓶中，加甲醇10ml，超聲使溶解，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀釋至刻度，精密量取1ml，置10ml量瓶中，用乙腈-甲醇-水（232：148：620）稀釋至刻度，搖勻，作為毛花毛地黃苷C對照品溶液。色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（4.6mm×250mm，5μm）；以水為流動相A；以乙腈-甲醇（22：14）為流動相B；按下表進行梯度洗脫，流速為每分鐘1.0ml；檢測波長為220nm；進樣體積20μl。表2-4梯度洗脫條件時間（分鐘）流動相A（%）流動相B（%）02021454651626248486262383852523838精密量取供試品溶液、對照溶液、靈敏度溶液和毛花毛地黃苷C對照品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。2.2.2GC法測定去乙酰毛花苷中甲醇采用氣相色譜法，Agilent7890A氣相色譜儀，火焰離子化檢測器，AgilentG1888頂空進樣器，程序升溫，頂空進樣，按外標法計算甲醇殘留量。精密稱取去乙酰毛花苷100mg，置頂空瓶中，精密加入二甲亞砜2.5ml使溶解，密封，作為殘留溶劑供試品溶液。精密稱取甲醇對照品125mg，置50ml量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5ml，置頂空瓶中，密封，作為甲醇對照品溶液。色譜條件：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細管柱為色譜柱（30m×0.53mm，膜厚3.0μm）；起始溫度為35℃，維持10分鐘，以每分鐘10℃的速率升溫至150℃，再以每分鐘60℃的速率升溫至230℃，維持10分鐘；進樣口溫度為250℃；檢測器為氫離子火焰檢測器，溫度為300℃；頂空瓶平衡溫度為60℃，平衡時間20分鐘；載氣為氮氣，流速為每秒25cm，分流比為4：1。進樣體積為1ml。取殘留溶劑供試品溶液和甲醇對照品溶液分別頂空進樣，記錄色譜圖。2.2.3GC法測定去乙酰毛花苷中二氯甲烷采用氣相色譜法，Agilent7890A氣相色譜儀，電子捕獲檢測器，AgilentG1888頂空進樣器，程序升溫，頂空進樣，按外標法計算二氯甲烷殘留量。精密稱取去乙酰毛花苷100mg，置頂空瓶中，精密加入二甲亞砜2.5ml使溶解，密封，作為殘留溶劑供試品溶液。精密稱取二氯甲烷對照品160mg，置100ml量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，精密量取1ml，置100ml量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5ml，置頂空瓶中，密封，作為二氯甲烷對照品溶液。精密稱取三氯甲烷對照品250mg，置100ml量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，精密量取5ml，置100ml量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，作為三氯甲烷儲備溶液。精密量取二氯甲烷對照品溶液10ml和三氯甲烷儲備液1ml，置100ml量瓶中，加二甲亞砜稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.5ml，置頂空瓶中，密封，作為系統適用性溶液。色譜條件：以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷為固定液的毛細管柱為色譜柱（30m×0.53mm，膜厚3.0μm）；起始溫度為35℃，維持10分鐘，以每分鐘10℃的速率升溫至150℃，再以每分鐘60℃的速率升溫至230℃，維持10分鐘；進樣口溫度為250℃；檢測器為離子捕獲檢測器，溫度為300℃；頂空瓶平衡溫度為60℃，平衡時間20分鐘；載氣為氮氣，流速為每秒25cm，分流比為4：1。進樣體積為1ml。取殘留溶劑供試品溶液、二氯甲烷對照品溶液和系統適用性溶液分別頂空進樣，記錄色譜圖。3結果與討論3.1HPLC法測定去乙酰毛花苷有關物質結果與方法學驗證3.1.1專屬性考察按2.2.1色譜條件，依次記錄供試品溶液、空白、對照溶液和毛花毛地黃苷C對照品溶液液相色譜圖，溶劑對去乙酰毛花苷、毛花毛地黃苷C和其他雜質均無干擾，且供試品溶液中主峰和雜質之間均能有效分離。供試品溶液中各雜質峰名稱見表3-1，色譜圖見圖3-1、圖3-2、圖3-3和圖3-4。表3-1供試品溶液中雜質峰名稱名稱保留時間（min）相對保留時間分離度未知雜質12.4520.23--地高辛配基5.5090.5313.4未知雜質26.3650.613.8未知雜質37.7450.745.1未知雜質49.5340.914.4去乙酰毛花苷10.4611.001.9未知雜質511.6611.112.8未知雜質613.1431.262.5未知雜質721.7252.0811.2地高辛23.8852.283.9未知雜質824.7832.373.6未知雜質925.1962.412.1洋地黃毒苷配基27.8502.6610.6吉妥辛37.6853.6021.3圖3-1供試品溶液色譜圖圖3-2空白溶液色譜圖圖3-3對照溶液色譜圖去乙酰毛花苷：10.512min圖3-4毛花毛地黃苷C對照品溶液色譜圖毛花毛地黃苷C：22.581min3.1.2線性范圍與校正因子以濃度C（μg/ml）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，分別進行去乙酰毛花苷、毛花毛地黃苷C、地高辛和吉妥辛的回歸分析，四個成分線性圖見圖3-5，線性回歸方程和相對校正因子見表3-2。圖3-5四個組分線性圖表3-2四個組分的線性回歸方程組分線性范圍（μg/ml）線性方程相關系數R相對校正因子去乙酰毛花苷4.9～49A=19091C+20740.99991.00毛花毛地黃苷C4.6～46A=18143C-25900.99990.95地高辛4.9～49A=19253C-49130.99971.01吉妥辛5.0～50A=19827C+56690.99991.04注：表3-6中相對校正因子為組分線性方程的斜率與去乙酰毛花苷線性方程斜率的比值。由上述結果可得出結論，毛花毛地黃苷C、地高辛和吉妥辛相對去乙酰毛花苷的校正因子在0.95～1.05之間，進行三個雜質的定量計算時，可不加校正因子計算去乙酰毛花苷峰面積計算。3.1.3其他方法學考察為確認擬定有關物質檢查方法，能夠檢出雜質的最低濃度，本次課題同時驗證了檢出限和定量限，同時為擬定方法靈敏度溶液的制備方法提供依據。檢出限和定量限結果見表3-3。表3-3去乙酰毛花苷檢出限和定量限檢查項目去乙酰毛花苷檢出限S/N=30.02μg/ml0.001%定量限S/N=100.07μg/ml0.003%取供試品溶液，置20℃陰涼處保存，分別在0、1、2、4、8、12和24小時注入液相色譜儀，記錄色譜圖，各雜質峰分離度良好，檢出數量和檢出雜質的含量均無明顯變化。供試品溶液（20℃保存）24小時內穩定。表3-4有關物質供試品溶液穩定性雜質0h1h2h4h8h12h24h雜質14776463046824693430942484417雜質23919404342364316432444814598雜質310563104931044310443105321057010526雜質49708955992069179911091899141雜質55107497751544867501646504769雜質64320454745454476450645414526雜質77944677967476928703762267081雜質89852979398709893975399349933雜質96206624764786662639368896713雜質10739833961922926759981雜質1111510891239038901889087138581雜質1239303717400o3802389937863841雜質13159241614616044166901571315764160243.1.4有關物質結果三批樣品的有關物質結果見表3-5。表3-5有關物質結果批號毛花毛地黃苷C地高辛（%）吉妥辛（%）其他最大單個雜質（%）雜質總量（%）1未檢出0.020.040.030.242未檢出0.010.040.030.223未檢出0.010.040.050.243.2GC法測定去乙酰毛花苷中甲醇和二氯甲烷結果與方法學驗證本次研究中，除甲醇采用氫離子火焰檢測器，二氯甲烷同時用氫離子火焰檢測器和電子捕獲檢測器考察擬定方法外，均采用同一色譜條件，程序升溫，頂空進樣，測定甲醇和二氯甲烷的殘留量。3.2.1線性回歸方程以濃度C（μg/ml）為橫坐標，峰面積A為縱坐標，分別進行甲醇（氫離子火焰檢測器）、二氯甲烷（氫離子火焰檢測器）和二氯甲烷（電子捕獲檢測器）的回歸分析，線性圖見圖3-6和圖3-7，線性回歸方程見表3-6。表3-6線形回歸方程組分線性范圍（μg/ml）線性方程相關系數R甲醇（FID）6.9～69A=0.5231C-0.13850.9996二氯甲烷（FID）4.4～44A=0.8204C+0.03420.9999二氯甲烷（ECD）4.9～49A=544.03C-209.750.9999圖3-6甲醇（FID）線性圖圖3-7二氯甲烷（FID）與二氯甲烷（ECD）線性圖由上述數據可知，二氯甲烷采用電子捕獲檢測器測定時，二氯甲烷響應值遠高于采用氫離子火焰檢測器記錄時的響應值。

3.2.2加樣回收試驗本次課題驗證準確度時采用加樣回收試驗，精密稱取去乙酰毛花苷原料藥50mg，精密加入甲醇（二氯甲烷）對照品溶液2.5ml，作為甲醇（二氯甲烷）的加樣回收試驗溶液。結果見表3-7。表3-7甲醇（FID）回收率試驗結果（n=6）樣品中含量（μg/ml）加入甲醇量（μg/ml）測得甲醇量（μg/ml）回收率（%）12.43222.95724.135105.112.40722.95723.919104.212.42222.95724.144105.212.41222.95723.642103.012.54422.95724.548106.912.34022.95723.720103.3表3-8二氯甲烷（FID）回收率試驗結果（n=6）樣品中含量（μg/ml）加入二氯甲烷量（μg/ml）測得二氯甲烷量（μg/ml）回收率（%）014.53014.25698.1014.53014.703101.2014.53014.544100.1014.53014.43199.3014.53014.968103.0014.53014.52299.9表3-9二氯甲烷（ECD）回收率試驗結果（n=6）樣品中含量（μg/ml）加入二氯甲烷量（μg/ml）測得二氯甲烷量（μg/ml）回收率（%）0.11815.53015.857109.10.11615.53015.704108.10.11615.53015.454106.40.11615.53016.485113.50.11515.53015.795108.70.11515.53016.435113.13.2.3其他方法學驗證本課題同時驗證了檢出限和定量限。檢出限和定量限結果見表3-10。表3-10去乙酰毛花苷殘留溶劑檢出限和定量限檢查項目甲醇（FID）二氯甲烷（FID）二氯甲烷（ECD）檢出限S/N=30.6μg/ml0.0015%0.7μg/ml0.0018%0.03μg/ml0.00008%定量限S/N=102.0μg/ml0.005%2.4μg/ml0.006%0.1μg/ml0.00025%4小結當建立一種新的分析方法時，方法學研究非常重要。本研究對去乙酰毛花苷雜質分析方法展開了系統的方法學研究，主要包括專屬性、線性、檢測限，重復性等方面的驗證。專屬性是指測定物質與其他物質的反應性差異性能，該驗證結果表明本方法能夠有效地檢測出去乙酰毛花苷中潛在的雜質。線性是指測定方法的靈敏度隨樣品中分析物含量增加而增加的能力，該驗證結果表明本方法在一定濃度范圍內具有較好的線性關系。檢測限是指檢測方法能夠可靠地檢測到去乙酰毛花苷有關物質以及殘留溶劑存在的最低濃度，該驗證結果表明本方法具有較低的檢測限。重復性指的是，在同樣的實驗條件下，對同一批去乙酰毛花苷進行多次分析后，得出的結果具有一致性。該驗證結果表明本方法的重復性好，具有較高的準確性和精確度。4.1有關物質測定的小結在分析方法建立過程中，色譜參數的選擇對分析結果有著至關重要的影響。本研究通過多次試驗，確定了相應的色譜參數。具體而言，選擇了C18色譜柱，并采用流動相為甲醇乙腈和水，使用梯度洗脫程序，以保證測定的靈敏度和準確度。在最終的優化方法中，本研究采用了不加校正因子的自身對照法計算已知雜質（毛花毛地黃苷C）和未知雜質的含量。與傳統的校正因子方法相比，該方法具有計算簡單、結果準確的優點。本研究所建立的分析方法，相較于國外藥典采用的薄層色譜法，具有更高的分析效率和準確性，同時對測定環境的要求也更低。因此，本方法可廣泛應用于去乙酰毛花苷中雜質的分析，并有望成為行業標準的參考方法。在今后的研究中，還可將本方法應用于去乙酰毛花苷質量的分析，以實現更加準確和全面的分析結果。綜上，本研究通過優化有關物質測定方法，建立了一種高效、準確的去乙酰毛花苷中雜質的分析方法。本方法在方法學研究、色譜參數優化以及自身對照法計算方法等方面的驗證表明，該方法具有良好的專屬性、線性、檢測限和重復性等驗證項目，可有效地檢出去乙酰毛花苷中的潛在雜質。在今后的應用中，需要進一步考慮方法的應用范圍和實際情況，結合具體的實驗需求和環境條件進行優化和改進。另外，本方法雖然能夠有效檢測出去乙酰毛花苷中的潛在雜質，但并不保證檢測出所有的雜質，因此，在實際應用中需要注意對雜質的篩查和分析。綜上所述，本研究所建立的分析方法能夠可靠、準確地檢測出去乙酰毛花苷中的潛在雜質，具有較高的分析效率和準確性，可作為行業標準的參考方法。隨著科學技術的不斷進步和實驗方法的不斷優化，相信該方法在去乙酰毛花苷的分析和控制方面會有更加廣泛的應用和推廣。4.2殘留溶劑測定的小結國內外藥典中均未制定有機殘留溶劑的測定方法，其合成路線和精制過程均需使用有機溶劑，這些殘留的有機溶劑對人體的危害十分巨大，因此有機溶劑殘留量的測定方法研究更有利于今后去乙酰毛花苷原料藥質量的的控制和提高。本次研究旨在建立一種準確、可靠的方法，用于檢測去乙酰毛花苷中殘留的有機溶劑含量。由于國內外藥典中尚未制定有機殘留溶劑的測定方法，因此該研究的意義十分重大。本次研究采用GC法來測定有機溶劑的含量，驗證了該方法的可行性。在本次研究中，我們通過評估該方法的專屬性、線性、檢測限和回收率等驗證項目，證明了該方法的可靠性和準確性。我們采用氣相色譜法，程序升溫，頂空進樣，并按外標法計算甲醇殘留量。該方法測定含量數據準確且通用，可以用于去乙酰毛花苷原料藥的有機溶劑殘留量的測定。但是，值得注意的是，本次研究僅針對常見的有機溶劑進行了測定，對于其他有機溶劑的檢測還需要進一步的研究。此外，由于不同廠家在合成去乙酰毛花苷時使用的有機溶劑種類和用量可能存在差異，因此需要對不同來源的去乙酰毛花苷進行定制化的檢測方法。綜上所述，本次研究建立了一種準確、可靠的方法，用于檢測去乙酰毛花苷中殘留的有機溶劑含量。該方法可用于去乙酰毛花苷原料藥質量的控制和提高，并有望成為行業標準的參考方法。未來，我們將進一步完善該方法，開展更為廣泛的實驗，以提高該方法的適用性和可靠性。參考文獻李曉.硝普鈉聯合去乙酰毛花苷治療急性左心衰肺水腫的效果觀察[J].臨床醫學,2022,(06):84-86.劉艷輝;范永會;王建文.門冬氨酸鉀鎂聯合去乙酰毛花苷治療重癥心力衰竭的臨床研究[J].現代藥物與臨床,2022,(08):1764-1768.RaoZ,QinH,WeiY,etal.DevelopmentofadynamicmultiplereactionmonitoringmethodfordeterminationofdigoxinandsixactivecomponentsofGinkgobilobaleafextractinratplasma[J].JournalofChromatographyB,2014,959:27-35.KlysM,GrossA.Determinationofdeslanosideinantemortemandpostmortemspecimens.Unusualcasereport[J].Forensicscienceinternational,1990,45(3):231-238.AbadyMM,JeongJS,KwonHJ.Developmentandvalidationofananalyticalmethodusingliquidchromatography-tandemmassspectrometryforthetherapeuticdrugmonitoringofsevencardiovasculardrugsinclinicalusage[J].JournalofChromatographyB,2023,1214:123552.高睿;劉慧穎;王福鑫.頂空氣相色譜法測定氨磷汀的殘留溶劑[J].品牌與標準化,2023,(02):119-121.鄧雙炳;方禮;劉芳芳;徐瀅;王章偉;劉地發.頂空-氣相色譜法測定枳實總黃酮提取物中的樹脂殘留和溶劑殘留[J].理化檢驗-化學分冊,2023,(03):360-363.朱蔚華;呂瑞綿;胡秋;王慕鄒;章觀德.毛花洋地黃栽培群體的類型及其初步選擇[J].中草藥,1980,11(05):223-226.陳小林,王剛,梁屹,楊易可,張帆,占婭鋒,高鵬飛,毛亮.(2022).一種去乙酰毛花苷及雜質的制備方法:中國,201910813524.5.[P].2022-10-04.劉艷輝;范永會;王建文.門冬氨酸鉀鎂聯合去乙酰毛花苷治療重癥心力衰竭的臨床研究[J].現代藥物與臨床,2022,(08):1764-1768.黃浩喜