丘腦網狀核內部亞核團在丙泊酚全麻過程中的作用及機制研究研究背景及目的:經美國FDA批準,全身麻醉藥丙泊酚于1989年正式上市,是具有里程碑意義的事件。自此丙泊酚憑借其起效快、無蓄積、恢復迅速等優勢,在臨床上廣泛應用。目前世界范圍內每年有上千萬例外科手術在丙泊酚麻醉下進行。丙泊酚已成為臨床應用最為廣泛且不可或缺的全身靜脈麻醉藥物。然而和其他全麻藥一樣,丙泊酚的麻醉作用機制至今仍然不清楚。揭示全麻機理是神經科學和麻醉學的夢想。2005年《Science》雜志主編DonaldKennedy將全麻機理列為學術界今后100年面臨的125個世紀難題之一[1],攻破該堡壘亦將成為神經科學和麻醉學領域里程碑式的飛躍。全麻引起的可逆性意識消失作為大腦的特殊非生理狀態,與學習記憶、睡眠覺醒等大腦高級功能息息相關[2]。近年來越來越多的研究結果支持全麻藥物的作用機制并非以往認為的——麻醉藥物對大腦整體的非特異性廣泛抑制,而是由各解剖位置、功能特點不同的神經回路構成的復雜網絡協同參與麻醉藥物引起的大腦功能可逆性改變[3-4],即麻醉藥物通過作用于特定大腦區域,阻斷不同腦區的功能聯系,打破信息在高級中樞的正、負反饋平衡而發揮麻醉作用。Ying的研究提示丘腦網狀核(thalamicreticularnucleus,TRN)在丙泊酚的全麻機理中發揮了重要作用[5]。然而,丙泊酚是否以及如何作用于TRN并產生麻醉作用仍然不清楚。TRN在大腦信息調控中的地位極其特殊。它由GABA能抑制性神經元組成,調控丘腦-皮層環路,是網狀上行激動系統的一部分。自2011年起,陸續有文獻報道通過光遺傳、電生理等技術發現TRN內部存在不同的功能性子網,即TRN各個亞核團的GABA能神經元投射至丘腦及皮層的不同區域并發揮不同的生理作用[6]。由于TRN特殊的解剖位置、生理功能,并且和睡眠、覺醒、意識等大腦功能密切相關,啟發并促使我們探索它在麻醉這個無知覺、無意識、類似而有別于睡眠的特殊非生理狀態中所起的作用。本課題致力于探索TRN內部亞核團參與丙泊酚發揮麻醉作用的具體分子、細胞、網絡及行為機制,為丙泊酚中樞麻醉的網絡學說及相關核團定位提供新的依據和方向。研究方法:(1)使用鵝膏蕈氨酸分別對TRN各亞核團進行化學性毀損,檢測核團毀損后大鼠對丙泊酚麻醉的反應及敏感性改變。(2)利用即刻表達基因C-Fos和GAD-67免疫熒光共標檢測TRN頭端(anteriorthalamicreticularnucleus,aTRN)和TRN尾端(posteriorthalamicreticularnucleus,pTRN)的GABA能神經元在清醒、丙泊酚麻醉、麻醉復蘇三個階段的功能狀態。(3)通過分子免疫學方法驗證丙泊酚的主要分子靶點GABAa受體β3亞基(GABAareceptor-β3subunit,GABAaR-β3)在TRN各亞核團中的存在和分布。(4)在大鼠雙側aTRN處注射GABAa受體競爭性拮抗劑荷包牡丹堿(bicuculline,BIC)阻斷該受體,觀察其行為改變。待大鼠狀態平穩后,檢測其對丙泊酚麻醉的反應及敏感性改變。(5)制備針對GABAaR-β3的小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)病毒,下調aTRN處GABAaR-β3的表達。免疫印跡法驗證病毒干擾效果。待病毒起效后檢測大鼠對丙泊酚麻醉的反應及敏感性改變。研究結果:(1)TRN各亞核團被化學性毀損后,僅aTRN毀損組大鼠對丙泊酚的敏感性有明顯且持續的提高(1)aTRN毀損組大鼠相較于對照組大鼠在接受丙泊酚靜脈泵注后翻正反射消失(lostofrightingreflex,LORR)的時間縮短并維持該狀態,即aTRN毀損組大鼠對丙泊酚的敏感性有明顯且持續的提高;aTRN毀損組大鼠對性質不同的靜脈麻醉藥物(右美托咪定)的敏感性無明顯變化。(2)pTRN毀損組大鼠相較于對照組大鼠接受丙泊酚及右美托咪定靜脈泵注后LORR時間均無明顯變化。(2)aTRN與pTRN的GABA能神經元在清醒、麻醉和復蘇三個階段呈現相反的功能狀態(1)aTRN的GABA能神經元在清醒時活躍,而在丙泊酚麻醉后處于相對抑制狀態。(2)pTRN的GABA能神經元在丙泊酚麻醉后被明顯激活,而撤藥蘇醒后則處于相對抑制狀態。(3)aTRN和pTRN均表達丙泊酚作用靶點GABAaR-β3且aTRN的表達量較pTRN更為豐富且密集(1)采用免疫印跡法驗證抗GABAaR-β3抗體的特異性并使用該抗體檢測GABAaR-β3在aTRN、pTRN、丘腦、海馬、皮層等腦組織的表達。結果顯示aTRN和pTRN區域均存在GABAaR-β3的蛋白表達。(2)免疫熒光檢測結果顯示,GABAaR-β3在aTRN和pTRN均有一定分布;在相同視野下,GABAaR-β3在aTRN的表達量較pTRN更為豐富且密集。(4)拮抗aTRN的GABAaR及下調aTRN處GABAaR-β3的表達使大鼠對丙泊酚敏感性下降(1)大鼠雙側aTRN處注射GABAa受體拮抗劑BIC阻斷該受體,動物即刻行為活躍,活動度明顯增加。(2)BIC注射組大鼠相較于對照組大鼠在接受丙泊酚靜脈泵注后LORR時間明顯延長,即BIC注射組大鼠對丙泊酚敏感性下降。(3)針對GABAaR-β3的siRNA病毒下調aTRN處該蛋白的表達,病毒干擾組大鼠較對照組大鼠在接受丙泊酚靜脈泵注后LORR時間明顯延長,即病毒干擾組大鼠對丙泊酚敏感性下降。結論:aTRN的神經元被化學性毀損后,動物對丙泊酚的敏感性有顯著且持續的提高,而毀損其它部位則無類似變化。這提示aTRN極有可能參與丙泊酚對中樞神經系統發揮麻醉作用的過程。C-Fos和GAD-67免疫熒光共標發現aTRN與pTRN的GABA能神經元在清醒、麻醉、復蘇三個階段顯示出相反的功能狀態,表明TRN各亞核團在丙泊酚麻醉過程中發生了不同的功能變化。BIC阻斷aTRN的GABAaR后動物即刻表現出亢奮狀態,即aTRN的GABA能神經元興奮性升高使動物呈現與麻醉相反的行為學表現。BIC注射組相較于對照組,大鼠對丙泊酚敏感性下降。推測一方面aTRN處的GABAaR可能是丙泊酚的作用靶點,其被拮抗劑阻斷后使丙泊酚麻醉效能降低;另一方面aTRN的GABA能神經元興奮性升高可能對抗丙泊酚的麻醉作用。免疫熒光結果顯示GABAaR-β3在aTRN處相較于pTRN有著更為豐富且密集的表達,在形態學角度支持aTRN作為丙泊酚麻醉神經網絡相關核團的特殊性。利用siRNA病毒下調GABAaR-β3的表達,病毒干擾組大鼠相較于對照組大鼠對丙泊酚敏感性下降。進一步證明aTRN處的GABAaR-β3對丙泊酚發揮麻醉作用至關重要。綜上所述,我們推測丙泊酚極有