專題一傳統發酵技術的應用課題一果酒和果醋的制作1、發酵：通過微生物技術的培養來生產大量代謝產物的過程。2、有氧發酵：醋酸發酵谷氨酸發酵·無氧發酵：酒精發酵乳酸發酵3、酵母菌是兼性厭氧菌型微生物真菌·酵母菌的生殖方式：出芽生殖(主要);分裂生殖;孢子生殖.4、在有氧條件下，酵母菌進行有氧呼吸，大量繁殖。C6H12O6＋6O2→6CO2＋6H2O5、在無氧條件下，酵母菌能進行酒精發酵。C6H12O6→2C2H5OH＋2CO26、20℃左右最適宜酵母菌繁殖酒精發酵時一般將溫度控制在18℃-25℃7、在葡萄酒自然發酵的過程中,起主要作用的是附著在葡萄皮表面的野生型酵母菌.在發酵過程中,隨著酒精濃度的提高,紅葡萄皮的色素也進入發酵液,使葡萄酒呈現深紅色.在缺氧、呈酸性的發酵液中，酵母菌可以生長繁殖，而絕大多數其他微生物都因無法適應這一環境而受到制約。8、醋酸菌是單細胞細菌(原核生物),代謝類型是異養需氧型,生殖方式為二分裂。9、當氧氣、糖源都充足時，醋酸菌將葡萄汁中的糖分解成醋酸；當缺少糖源時，醋酸菌將乙醇變為乙醛，再將乙醛變為醋酸。2C2H5OH＋4O2→CH3COOH＋6H2O10、控制發酵條件的作用①醋酸菌對氧氣的含量特別敏感，當進行深層發酵時，即使只是短時間中斷通入氧氣，也會引起醋酸菌死亡。②醋酸菌最適生長溫度為30～35℃，控制好發酵溫度，使發酵時間縮短，又減少雜菌污染的機會。③有兩條途徑生成醋酸：直接氧化和以酒精為底物的氧化。11、實驗流程：挑選葡萄→沖洗→榨汁→酒精發酵→果酒（→醋酸發酵→果醋）12、酒精檢驗：果汁發酵后是否有酒精產生，可以用重鉻酸鉀來檢驗。在酸性條件下，重鉻酸鉀與酒精反應呈現灰綠色。先在試管中加入發酵液2ｍL，再滴入物質的量濃度為3mol/L的H2SO43滴，振蕩混勻，最后滴加常溫下飽和的重鉻酸鉀溶液3滴，振蕩試管，觀察顏色13、充氣口是在醋酸發酵時連接充氣泵進行充氣用的；排氣口是在酒精發酵時用來排出二氧化碳的；出料口是用來取樣的。排氣口要通過一個長而彎曲的膠管與瓶身相連接，其目的是防止空氣中微生物的污染。開口向下的目的是有利于二氧化碳的排出。使用該裝置制酒時，應該關閉充氣口；制醋時，應該充氣口連接氣泵，輸入氧氣。疑難解答（1）你認為應該先沖洗葡萄還是先除去枝梗？為什么？應該先沖洗，然后再除去枝梗，以避免除去枝梗時引起葡萄破損，增加被雜菌污染的機會。（2）你認為應該從哪些方面防止發酵液被污染？如：要先沖洗葡萄，再除去枝梗；榨汁機、發酵裝置要清洗干凈，并進行酒精消毒；每次排氣時只需擰松瓶蓋，不要完全揭開瓶蓋等。（3）制葡萄酒時，為什么要將溫度控制在18～25℃？制葡萄醋時，為什么要將溫度控制在30～35℃？溫度是酵母菌生長和發酵的重要條件。20℃左右最適合酵母菌的繁殖。因此需要將溫度控制在其最適溫度范圍內。而醋酸菌是嗜溫菌，最適生長溫度為30～35℃，因此要將溫度控制在30～35℃。課題二腐乳的制作1、多種微生物參與了豆腐的發酵，如青霉、酵母、曲霉、毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。毛霉是一種絲狀真菌。代謝類型是異養需氧型。生殖方式是孢子生殖。營腐生生活。2、原理：毛霉等微生物產生的蛋白酶能將豆腐中的蛋白質分解成小分子的肽和氨基酸；脂肪酶可將脂肪水解為甘油和脂肪酸。3、實驗流程：讓豆腐上長出毛霉→加鹽腌制→加鹵湯裝瓶→密封腌制4、釀造腐乳的主要生產工序是將豆腐進行前期發酵和后期發酵。前期發酵的主要作用：1.創造條件讓毛霉生長。2.使毛酶形成菌膜包住豆腐使腐乳成型。后期發酵主要是酶與微生物協同參與生化反應的過程。通過各種輔料與酶的緩解作用，生成腐乳的香氣。5、將豆腐切成3cm×3cm×1cm的若干塊。所用豆腐的含水量為70％左右，水分過多則腐乳不易成形。*水分測定方法如下：精確稱取經研缽研磨成糊狀的樣品5～10g(精確到0.02mg)，置于已知重量的蒸發皿中，均勻攤平后，在100～105℃電熱干燥箱內干燥4h，取出后置于干燥器內冷卻至室溫后稱重，然后再烘30min，直至所稱重量不變為止。樣品水分含量（%）計算公式如下：(烘干前容器和樣品質量-烘干后容器和樣品質量)/烘干前樣品質量·毛霉的生長：條件：將豆腐塊平放在籠屜內，將籠屜中的控制在15～18℃，并保持一定的溫度。來源：1.來自空氣中的毛霉孢子，2.直接接種優良毛霉菌種 時間：5天·加鹽腌制：將長滿毛霉的豆腐塊分層整齊地擺放在瓶中，同時逐層加鹽，隨著層數的加高而增加鹽量，接近瓶口表面的鹽要鋪厚一些。加鹽腌制的時間約為8天左右。·用鹽腌制時，注意控制鹽的用量：鹽的濃度過低，不足以抑制微生物的生長，可能導致豆腐腐敗變質；鹽的濃度過高會影響腐乳的口味·食鹽的作用：1.抑制微生物的生長，避免腐敗變質2.析出水分，是豆腐變硬，在后期制作過程中不易酥爛3.調味作用，給腐乳以必要的咸味4.浸提毛酶菌絲上的蛋白酶。·配制鹵湯：鹵湯直接關系到腐乳的色、香、味。鹵湯是由酒及各種香辛料配制而成的。鹵湯中酒的含量一般控制在12%左右。·酒的作用：1.防止雜菌污染以防腐2.與有機酸結合形成酯，賦予腐乳風味3.酒精含量的高低與腐乳后期發酵時間的長短有很大關系，酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，使腐乳成熟期延長；酒精含量過低，蛋白酶的活性高，加快蛋白質的水解，雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難以成塊。·香辛料的作用：1.調味作用2.殺菌防腐作用3.參與并促進發酵過程·防止雜菌污染：①用來腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干凈后要用沸水消毒。②裝瓶時，操作要迅速小心。整齊地擺放好豆腐、加入鹵湯后，要用膠條將瓶口密封。封瓶時，最好將瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶口被污染。疑難解答（1）利用所學的生物學知識，解釋豆腐長白毛是怎么一回事？豆腐生長的白毛是毛霉的白色菌絲。嚴格地說是直立菌絲，在豆腐中還有匍匐菌絲。（2）為什么要撒許多鹽，將長毛的豆腐腌起來？鹽能防止雜菌污染，避免豆腐腐敗。（3）我們平常吃的豆腐，哪種適合用來做腐乳？含水量為70%左右的豆腐適于作腐乳。用含水量高的豆腐制作腐乳，不易成形。（4）吃腐乳時，你會發現腐乳外部有一層致密的“皮”。這層“皮”是怎樣形成的呢？它對人體有害嗎？它的作用是什么？“皮”是前期發酵時在豆腐表面上生長的菌絲（匍匐菌絲），對人體無害。它能形成腐乳的“體”，使腐乳成形。課題三制作泡菜·制作泡菜所用微生物是乳酸菌，其代謝類型是異養厭氧型。在無氧條件下，降糖分解為乳酸。分裂方式是二分裂。反應式為：C6H12O62C3H6O3+能量含抗生素牛奶不能生產酸奶的原因是抗生素殺死乳酸菌。常見的乳酸菌有乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。乳酸桿菌常用于生產酸奶。·亞硝酸鹽為白色粉末，易溶于水，在食品生產中用作食品添加劑。·膳食中的亞硝酸鹽一般不會危害人體健康，國家規定肉制品中不超過30mg/kg，醬腌菜中不超過20mg/kg，嬰兒奶粉中不超過2mg/kg。亞硝酸鹽被吸收后隨尿液排出體外，但在適宜pH、溫度和一定微生物作用下形成致癌物質亞硝胺。亞硝酸鹽含量發酵時間（d）·亞硝酸鹽含量發酵時間（d）*測定亞硝酸鹽含量的原理是在鹽酸酸化條件下，亞硝酸鹽與對氨基苯磺酸發生重氮化反應后，與N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽結合形成玫瑰紅色染料，與已知濃度的標準顯色液目測比較，估算泡菜中亞硝酸鹽含量。專題五ＤＮＡ和蛋白質技術課題一ＤＮＡ的粗提取與鑒定一、提取DNA的溶解性原理包括哪些方面？1.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精。①DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度有何特點？要使DNA溶解，需要使用什么濃度？要使DNA析出，又需要使用什么濃度？在0.14mol/L時溶解度最小；較高濃度可使DNA溶解；0.14mol/L可使DNA析出。②在溶解細胞中的DNA時，人們通常選用2mol/LNaCl溶液；將DNA分子析出的方法是向溶有DNA的NaCl溶液中緩慢注入蒸餾水，以稀釋NaCl溶液。酒精是一種常用有機溶劑，但DNA卻不能溶于酒精（特別是95％冷卻酒精），但細胞中蛋白質可溶于酒精。2.從理論上分析，預冷的乙醇溶液具有以下優點。一是抑制核酸水解酶活性，防止DNA降解；二是降低分子運動，易于形成沉淀析出；三是低溫有利于增加DNA分子柔韌性，減少斷裂。3.采用DNA不溶于酒精的原理，可以達到什么目的？將DNA和蛋白質進一步分離。 4.提取DNA還可以利用DNA對酶、高溫和洗滌劑的耐受性原理。利用該原理時，應選用怎樣的酶和怎樣的溫度值？蛋白酶，因為酶具有專一性，蛋白酶只水解蛋白質而不會對DNA產生影響。溫度值為60～80℃，因為該溫度值蛋白質變性沉淀，而DNA不會變性。補充：DNA的變性是指DNA分子在高溫下解螺旋，其溫度在80℃以上，如在PCR技術中DNA變性溫度在95℃。5.洗滌劑在提取DNA中有何作用？洗滌劑將細胞膜上的蛋白質，從而瓦解細胞膜。6.當鑒定提取出的物質是否是DNA時，需要使用什么指示劑進行鑒定？在沸水浴條件下，DNA遇二苯胺呈現藍色。 原理總結：通過利用不同濃度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以從細胞中提取和提純DNA；再利用酒精進一步將DNA與蛋白質分離開來，達到提純的目的；最后利用二苯胺試劑鑒定提取的物質是否是DNA。二、實驗材料的選取不同生物的組織中DNA含量不同。在選取材料時，應本著DNA含量高、材料易得、便于提取的原則。本實驗用雞血細胞做實驗材料有兩個原因。一是因為雞血細胞核的DNA含量豐富，材料易得；二是雞血細胞極易吸水脹破，而用動物肝臟細胞作實驗材料常常需要勻漿和離心，對設備要求較高，操作繁瑣，歷時較長。雞血細胞破碎以后釋放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，所以在提取過程中為了減少DNA的損失，最好使用塑料的燒杯和試管盛放雞血細胞液。三、破碎細胞，獲取含DNA的濾液1、若選用雞血和洋蔥作實驗材料，則怎樣獲取含DNA的濾液？在雞血細胞液中加入一定量蒸餾水并用玻棒攪拌，過濾后收集濾液；切碎洋蔥，加入一定量洗滌劑和食鹽，攪拌研磨，過濾后收集濾液。2.為什么加入蒸餾水能使雞血細胞破裂？答：蒸餾水對于雞血細胞來說是一種低滲液體，水分可以大量進入血細胞內，使血細胞脹裂，再加上攪拌的機械作用，就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂)，從而釋放出DNA。3．在以上實驗中，加入蒸餾水、洗滌劑和食鹽的作用分別是什么？過濾時應當選用（濾紙、尼龍布）。血細胞在蒸餾水中大量吸水而張裂；洗滌劑瓦解細胞膜；食鹽溶解DNA物質；選用尼龍布進行過濾。4.在處理植物組織時需要進行研磨，其目的是什么？研磨不充分產生什么結果？破碎細胞壁，使核物質容易溶解在NaCl溶液中；研磨不充分會使DNA的提取量減少，影響實驗結果，導致看不到絲狀沉淀物、用二苯胺鑒定不顯示藍色等。具體做法。10mL雞血＋20mL蒸餾水→同方向攪拌→3層尼龍布過濾→濾液三、去除濾液中的雜質1.為什么反復地溶解與析出DNA，能夠去除雜質？用高鹽濃度的溶液溶解DNA，能除去在高鹽中不能溶解的雜質；用低鹽濃度使DNA析出，能除去溶解在低鹽溶液中的雜質。因此，通過反復溶解與析出DNA，就能夠除去與DNA溶解度不同的多種雜質。最初獲得的DNA濾液含有蛋白質、脂質等雜質，需要進一步提純DNA。方案一的原理是DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白質，不分解DNA；方案三的原理是蛋白質和DNA的變性溫度不同。方案二與方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解雜質蛋白，從而使提取的DNA與蛋白質分開；方案三利用的是DNA和蛋白質對高溫耐受性的不同，從而使蛋白質變性，與DNA分離。四、析出與鑒定1.在濾液中仍然含有一些雜質，怎樣除去這些雜質呢？得到的DNA呈何顏色？濾液與等體積的冷卻酒精混合均勻，靜置2～3分鐘，析出的白色絲狀物就是DNA。DNA呈白色。2.怎樣鑒定析出的白色絲狀物就是DNA呢？具體做法。試管2支，編號甲乙→各加等量5mLNaCl溶液→甲中放入少量白色絲狀物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均勻→沸水浴5min→觀察顏色變化五、實驗操作制備雞血細胞液…………加檸檬酸鈉，靜置或離心↓破碎細胞，釋放DNA…加蒸餾水，同一方向快速通方向攪拌↓→過濾，除去細胞壁、細胞膜等。溶解核內DNA…………加入NaCl至2mol/L，同一方向緩慢攪拌↓DNA析出………………加蒸餾水至0.14mol/L，過濾，在溶解到2mol/L溶液中↓→除去細胞質中的大部分物質。DNA初步純化…………與等體積95％冷卻酒精混合，析出白色絲狀物↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。DNA鑒定………………二苯胺，沸水浴，呈現藍色注意事項：在雞血中加入檸檬酸鈉防止凝固；雞血靜置或離心以提高細胞懸液濃度；使用塑料燒杯；使用尼龍布過濾；玻棒沿同一方向攪拌；玻棒攪拌要緩慢（細胞破裂快速攪拌）；玻棒不要碰到燒杯壁；二苯胺試劑要現用現配等。課題二多聚酶鏈式反應擴增DNA片段基礎知識PCR技術擴增DNA的過程，與細胞內DNA復制過程類似：1．細胞內DNA復制條件分析：條件組分作用模板DNA的兩條單鏈提供復制的模板原料四種脫氧核苷酸合成DNA子鏈的原料酶解旋酶DNA聚合酶打開DNA雙螺旋催化合成DNA子鏈能量ATP為解螺旋和合成子鏈供能引物RNA為DNA聚合酶提供合成的3’端起點2．細胞內DNA復制過程的解析：解旋：解旋酶、ATP，DNA兩條鏈打開，形成兩條DNA單鏈。引物結合：在DNA單鏈3’端與DNA反向配對結合。DNA聚合酶結合：DNA聚合酶與模板鏈結合，標志著單鏈合成開始。子鏈合成：DNA聚合酶從引物3’端開始，將配對的脫氧核苷酸連接起來。后續加工：DNA聚合酶I將引物切去，并合成空缺處的DNA單鏈，再由DNA連接酶將不連續的DNA子鏈連接起來（半不連續合成。先導鏈，滯后鏈）3．DNA分子復制的人工控制實驗操作步驟照PCR反應體系配方配制反應液；②將PCR反應體系50μL用微量移液器轉移到微量離心管（0.5mL）中；③將微量離心管放到PCR儀中；④設置PCR儀的工作參數。⑤DNA在PCR儀中大量擴增。4．實驗注意事項（1）避免外源DNA污染：所用儀器、緩沖液、蒸餾水等使用前高壓滅菌。（2）緩沖液和酶分裝成小份，－20℃低溫保存。（3）每添加一種反應成分，更換一個移液器的槍頭。（4）混勻后離心處理，使反應液集中在離心管底部。總結、點評多聚酶鏈式反應擴增DNA片段多聚酶鏈式反應擴增DNA片段PCR原理DNA的復制需要酶、原料、能量、引物DNA的變性和復性受溫度影響PCR過程變性復性延伸操作步驟配制PCR反應體系移入離心管放入PCR設置工作參數DNA擴增測定含量稀釋調零測定并讀數計算課題三血紅蛋白的提取和分離一、實驗原理蛋白質的物化理性質：形狀、大小、電荷性質和多少、溶解度、吸附性質、親和力等千差萬別，由此提取和分離各種蛋白質。1．凝膠色譜法（分配色譜法）：（1）原理：分子量大的分子通過多孔凝膠顆粒的間隙，路程短，流動快；分子量小的分子穿過多孔凝膠顆粒內部，路程長，流動慢。（2）凝膠材料：多孔性，多糖類化合物，如葡聚糖、瓊脂糖。（3）分離過程：混合物上柱→洗脫→大分子流動快、小分子流動慢→收集大分子→收集小分子洗脫：從色譜柱上端不斷注入緩沖液，促使蛋白質分子的差速流動。（4）作用：分離蛋白質，測定生物大分子分子量，蛋白質的脫鹽等。2．緩沖溶液（1）原理：由弱酸和相應的強堿弱酸鹽組成（如H2CO3－NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等），調節酸和鹽的用量，可配制不同pH的緩沖液。（2）緩沖液作用：抵制外界酸、堿對溶液pH的干擾而保持pH穩定。3．凝膠電泳法：（1）原理：不同蛋白質的帶電性質、電量、形狀和大小不同，在電場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。（2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。（3）分離過程：在一定pH下，使蛋白質基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的SDS，形成“蛋白質－SDS復合物”，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。二、實驗步驟1．樣品處理紅細胞的洗滌洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時采用低速短時間離心分離紅細胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。②血紅蛋白的釋放在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。注：加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。2．粗分離①分離血紅蛋白溶液將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。②透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質，或用于更換樣品的緩沖液。3．純化調節緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝↓膠面平齊，關閉出口。加入蛋白質樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環繞移動加到色譜柱的頂端。加樣后，∣打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等樣品完全滲入凝膠層后，↓關閉出口。調節緩沖液面：加入20mmol/L的磷酸緩沖液到適當高度↓洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進行洗脫。↓收集分裝蛋白質：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集。4.純度鑒定------SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做）三、注意事項電泳技術電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大