摘要/Abstract[目的]研究丁酸梭菌的營養條件并優化發酵工藝，為與丁酸梭菌培養發酵相關的實驗室研究及規模化生產工藝優化提供依據。[方法]通過單因素試驗，比較8種常見廉價碳氮源對丁酸梭菌增菌的影響，對高密度發酵培養基和培養條件進行優化。[結果]丁酸梭菌MY-Z發酵最佳營養組分為：葡萄糖30.0g/L、酵母粉5.0g/L、魚粉30.0g/L或肽粉30.0g/L、K2HPO4

1.05g/L、MgSO4·7H2O1.21g/L、NaCl0.3g/L、CaCO3

1.5g/L、MnSO4·H2O0.012g/L、促生長因子0.2g/L；最佳發酵工藝為：37℃恒溫培養30～36h，發酵過程中恒定pH為6.5，并在發酵10h左右進行總量為5%的連續變量補料。丁酸梭菌MY-Z在此發酵工藝下，發酵32h左右，芽孢數可達2.28×109

CFU/mL。[結論]通過優化發酵工藝可有效提高發酵液菌數，從而降低生產成本，對丁酸梭菌的產業化推廣與應用具有重要意義。研究背景丁酸梭狀芽孢桿菌（Clostridiumbutyricum），又名丁酸菌、宮入菌、酪酸菌，在自然界中多分布在腸道、酒窖、奶酪中。1933年，由日本千葉醫科大學宮入近治博士首次發現。丁酸梭菌屬于嚴格厭氧的革蘭氏陽性內生芽孢桿菌，細胞直徑（0.6～1.2）μm×（3.0～7.0）μm；在梭菌增菌培養基（RCM）平板上和高層瓊脂柱內菌落呈奶白色，邊緣不整齊；顯微視野中菌體呈桿狀或梭狀，多數單個，少數呈短鏈，部分菌株在對數生長初期菌體會呈現長絲狀。近幾年來，丁酸梭菌作為微生態制劑被廣泛應用于食品、醫藥、飼料與養殖等領域。2009年7月，原農業部批準了丁酸梭菌為新飼料添加劑。丁酸梭菌作為微生態制劑飼料添加劑，具有較強的抗生素耐受性，對氨芐西林、強力霉素、甲硝唑等抗生素均不敏感，相對于乳酸菌、枯草芽孢桿菌等常規菌劑，與抗生素聯用時受限度較小。因丁酸梭菌是腸道原生有益菌，作為口服的丁酸梭菌制劑較其他益生菌類更能適應腸道生存環境，增強本菌株在腸道中的菌群優勢；同時，其與雙歧桿菌、乳酸菌、糞腸球菌等有益菌不僅共生還可促進增殖，維護腸道良性微生態平衡；其產生的以丁酸、乙酸為主的短鏈脂肪酸可抑制有害菌，大量動物試驗和人體臨床試驗表明，丁酸不僅可以修復腸道黏膜，還是腸道上皮細胞生長的直接能量來源，促進腸道絨毛發育，增強腸道對有害物質的屏障能力，常用于治療腸道疾病，在抑制動物腹瀉、提高動物免疫力等方面具有積極的效果。丁酸梭菌產生的胞外活性酶如淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等，可幫助機體分解多糖、纖維素、脂肪、蛋白質等，利于機體消化吸收。雖然丁酸梭菌是嚴格厭氧菌，因其是產芽孢桿菌，芽孢不僅具有耐熱、耐胃酸、膽酸還耐氧，使其具有一定的抗逆性，便于工業規模化生產、運輸、保存和在常規環境下使用。自丁酸梭菌被發現以來，國內外很多生物、醫藥等領域的學者對丁酸梭菌進行了深入的研究，重點在菌株分離鑒定及其應用機理，而在丁酸梭菌規模化發酵生產工藝及菌數檢測等方面的基礎研究還不夠深入，生產發酵水平偏低。目前在國內，1t以上的發酵罐產出的發酵液芽孢數普遍只在2×108～2×109

CFU/mL。少數企業在后處理時經離心濃縮、噴霧干燥后有效活菌數才能達到1×1010

CFU/g，市場上現有的丁酸梭菌相關產品普遍存在有效活菌數低、貨架期短、價格偏貴等問題。隨著相關專業人員和普通大眾“減抗、禁抗”意識的增強及對益生菌劑認知的提高，現有的生產發酵水平已難以滿足食品、醫藥、養殖及飼料加工等行業對丁酸梭菌需求量大、有效活菌數高、貨架期長且價格低廉等要求，嚴重制約了丁酸梭菌的推廣和應用，各生產和使用廠家急切需要解決發酵工藝中的限制問題，突破現有發酵水平，降低發酵成本。本試驗通過探究丁酸梭菌的營養條件及其發酵工藝優化，以期能在實際生產及應用等方面提供解決思路和策略，實現丁酸梭菌的高密度發酵，從而大幅度提高有效活菌數和芽孢轉化率及降低規模化生產成本。材料與方法1.

菌種來源丁酸梭狀芽孢桿菌（C.butyricum

MY-Z），由華中農業大學農業微生物學國家重點實驗室提供。2.

試驗儀器DL-CJ-2ND1潔凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；顯微鏡GC-8860氣相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；GI54DWS型高壓滅菌鍋；AOEINSTRUMENTSUV-1500分光光度計；P70D20TLD4格蘭仕微波爐；UPR-II-5/10T超純水儀；C22-IH960D蘇泊爾電磁爐。3.

培養基梭菌增殖培養基（RCM培養基）：酵母粉3g，牛肉浸膏10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖5g，可溶性淀粉1g，氯化鈉5g，三水合乙酸鈉3g，半胱氨酸鹽酸鹽0.5g，0.5%美藍0.2mL，蒸餾水1000mL，調節pH至7.0±0.2。發酵基礎培養基：葡萄糖10.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、牛肉粉10.0g、可溶性淀粉2.0g、K2HPO4

1.05g、MgSO4·7H2O1.21g、NaCl0.3g、CaCO3

1.5g、MnSO4·H2O0.012g、促生長因子0.2g、蒸餾水1000mL，調節pH至7.0±0.2。計數培養基：梭菌增殖培養基（RCM培養基）加0.4%～0.8%的瓊脂，分裝試管，上封液體石蠟，制成高層半固體培養基。計數稀釋液：0.85%的生理鹽水加0.03%的吐溫80。上述培養基均115℃滅菌30min。4.

培養方法1）種子活化及培養方法：取超低溫保存的甘油管菌種100μL，接種到含有15mL的已除氧溶化冷卻至40℃的RCM半固體培養基的試管中，培養基表面覆蓋高2～3cm液體石蠟以隔絕空氣，37℃恒溫培養箱中靜止培養12～18h。再取此菌液100μL接種到已除氧RCM培養基中，37℃靜置培養至對數期作為種子液備用。2）丁酸梭菌發酵培養：采用液體深層靜止培養，250mL試劑瓶，裝液量150mL，表面覆蓋高2～3cm液體石蠟以隔絕氧氣，于37℃恒溫培養箱中靜止培養24h后計數。5.

檢測方法1）丁酸梭菌芽孢計數方法（試管高層半固體瓊脂法）。取菌液于80℃水浴加熱10min，取經處理后的待測菌液10mL加到90mL去氧液封稀釋液內，并用移液管攪打均勻，不形成氣泡，制成1∶10的均勻稀釋液，取此菌懸液1mL注入到9mL去氧液封稀釋液內，同上，制成1∶100均勻稀釋液，按上述操作依次進行10倍遞增稀釋，選擇1～3個合適的稀釋度，取1mL注入到10～15mL已除氧高層半固體培養基內，每個梯度做3管平行，置（36±1）℃培養16～24h，計數。2）還原糖的檢測方法。采用3，5二硝基水楊酸法（DNS法）。3）氣相色譜測定丁酸產量。取發酵液10mL，用50%硫酸和乙醚提取丁酸，以丁酸標準品為內標進行氣相色譜儀測定。色譜條件：柱流量為1mL/min，FID檢測器，檢測器溫度為250℃，進樣量為1μL；升溫程序如下：60℃保持4min，以6℃/min的速度升溫至180℃，再以20℃/min的速度升溫至200℃，保持5min。6.

單因素試驗1）最佳接種量及初始pH的確定。分別以1%、2%、3%、4%、5%、10%的接種量接種到基礎培養基中，另將基礎培養基初始pH分別用0.5mol/L的鹽酸溶液和飽和碳酸氫鈉溶液調制成pH5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，其他培養條件不變，以確定最佳接種量及初始pH。2）碳源的篩選。分別以1.0%的量添加紅糖、糖蜜、甘油、麩皮、玉米粉、可溶性淀粉、乙酸鈉等原料替換初始培養基中的碳源，其他營養組分不變，以初始培養基為對照，探究不同碳源對丁酸梭菌增菌的影響。3%的接種量，37℃培養24h后，取樣測定菌落數。3）優勢碳源添加量的確定。篩選出優勢碳源后，再分別以2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%的量替代初始發酵培養基中的碳源，以確定最佳添加量。4）氮源的篩選。分別以2.0%的肽、玉米漿、魚粉、花生粕、酵母粉、豆粕、酶解羽毛粉、硫酸銨等量替代初始發酵培養基中胰蛋白胨和蛋白胨2種主要的氮源，考察不同的氮源對丁酸梭菌增菌的影響。5）最佳氮源添加量的篩選。本試驗采用增菌明顯的酵母粉、肽粉和魚粉分別以2.5%、3.0%、4.0%、5.0%的量替代初始培養基中的胰蛋白胨和蛋白胨，以確定最佳添加量。7.

發酵工藝的研究以下試驗培養基均以2.5%的葡萄糖、3.5%魚粉和0.5%的酵母粉，其他營養成分與比例同初始培養基。1）發酵過程中間歇調控pH對增菌的影響。在單因素試驗基礎上，三角瓶發酵靜置培養至10h，10、15h時分別用20%NaOH溶液調節發酵液pH至6.0，并檢測葡萄糖。2）在發酵過程中補料對增菌的影響。培養至10、15h時分別按1.0%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、5.0%的量向發酵液中補充初始培養基營養液。3）發酵過程中在線控制pH并補料對增菌的影響。50L自控發酵罐，配制優化后的培養基，裝液系數60%，上覆2～3cm厚的液體石蠟或連續通入氮氣以保證相對厭氧環境，低速攪拌，接種量3%，培養溫度37℃，培養至10h開始變量流加補充培養基營養液，總流加量為5%，同時用中和劑維持培養液pH在6.0。發酵過程中分時段取樣檢測葡萄糖、丁酸及芽孢數。研究結果1.

不同的接種量和初始pH值對菌數的影響從圖1可以看出，接種量為3%的發酵液生物量最高，隨著接種量的增加，生物量略有下降。分析原因：由于接種量大，生長速率快，營養消耗快，且接種量過大，種液中的代謝物特別是酸性物質降低了培養基的初始pH值，縮短了菌體的生長對數期。由此可見，在實際應用中并不是接種量越大越好，應根據實際的試驗和生產情況確定相應的接種量。另外，在本試驗中發現接種量越小，相對啟動耗時越長，接種量越大，發酵啟動越快，接種量為10%的發酵液啟動時間比1%組提前了約1.5h，接種量過低啟動時間過長，增加了動力消耗和發酵液污染的風險。本研究后面試驗均采用3%的接種量。圖1不同的接種量對菌落數的影響由圖2可知，初始pH為5.5時，丁酸梭菌的啟動很慢，生長很弱，隨著pH值的升高菌數增加，pH值為6.0時菌數最高，pH6.5時菌數略低，2組差異不明顯。此后，隨著pH升高，菌數開始下降，由此表明初始pH在偏酸范圍內較好。后面試驗確定初始pH值為6.0。圖2不同的初始pH值對菌落數的影響2.

不同碳源篩選碳源是微生物培養基的主要營養成分，為微生物的生長繁殖、構成菌體細胞和代謝活動提供能源。丁酸梭菌可以利用多種碳源，包括單糖和多糖。本試驗所選的8種碳源中包括單糖、多糖及乙酸鈉。由圖3可知，葡萄糖作為碳源時芽孢數最高，達到0.98×108

CFU/mL，明顯高于其他碳源組（P>0.05），因此優選葡萄糖作為本次后續試驗碳源。紅糖和糖蜜僅次于葡萄糖，從原料來源和生產成本考慮，建議在工業化生產中選這2種作為主要碳源。圖3不同碳源對丁酸梭菌菌落數的影響3.

最佳碳源添加量的確定微生物在生長過程中對營養物質的需求有一定的限量范圍，營養物質過低或過高都會對菌體的生長造成很大的影響，因此確定適當的量，對微生物生長尤為重要。本試驗在確定最佳碳源的基礎上，優化其最佳添加量，結果見圖4。從圖4可以看出，葡萄糖添加量為3.0%的發酵液菌數最高，達到2.33×108

CFU/mL，明顯高于1.0%組，與2.5%組差異不顯著，與4.0%、5.0%組差異顯著。由表1可知，發酵結束后1.0%、2.0%組的培養液所含還原糖分別為0.18%和0.23%，表明糖幾乎消耗殆盡，2.5%添加量的培養液內還原糖為0.48%，3.0%及以上各組培養液里還原糖均高于2.5%組，5.0%組還原糖值最高，達到了2.21%。隨著糖量的增加，培養液還原糖值越高，培養基內的殘糖越多，并且從發酵液的pH值可以看出，所添加的糖并沒有被利用轉化，由此確定葡萄糖的最適添加量為2.5%。圖4優勢碳源不同添加量對丁酸梭菌菌落數的影響表1各組發酵液中還原糖及pH的檢測結果4.

優勢氮源添加量的確定氮是構成生命重要物質蛋白質和核酸等的主要元素，與碳源相同，氮源也是微生物的主要營養物質，通常分為有機氮源和無機氮源。本試驗以市場上常見的包含有機氮和無機氮的8種氮源，以部分替代基礎培養基中原有氮源的方式，考查不同氮源對丁酸梭菌生長的影響，結果見圖5。其中，肽粉、魚粉和酵母粉3組間菌數差異不顯著，但優于對照組，且顯著高于其他氮源。圖5不同氮源對丁酸梭菌菌落數的影響本試驗選擇菌落數相對較高的酵母粉、魚粉和肽粉作為優勢氮源，在一定范圍內以確定最佳添加量，結果見圖6，酵母粉在2.5%時菌數為3.12×108

CFU/mL。肽粉和魚粉分別在3%菌數最高，分別達到2.95×108、3.05×108

CFU/mL。各組添加比例間菌落數沒有隨著添加量的增加而顯著提升，且各組最高菌數間差異不顯著。3種優勢氮源中，酵母粉不僅是微生物生長的優質氮源，還含有多種生長因子，但價格相對來說要高出很多。在發酵生產中，為保證營養互補多采用復合氮源的方式。因此，本試驗確定酵母粉為0.5%與3.0%的肽粉或3.0%的魚粉組合成復合氮源。圖63種優勢氮源不同的添加量對丁酸梭菌菌落數的影響5.

發酵過程中間歇調控pH對增菌的影響試驗結果顯示，初始pH在5.5時菌體生長緩慢，表明過低的pH值對丁酸梭菌生長會形成抑制。由試驗結果可知，發酵結束時培養液的pH值顯示為4.7左右，且除1.0%組外，其他各組培養液內均有不等量的殘留葡萄糖，表明菌體可能是由于受到酸性代謝物的抑制，糖沒有被完全利用。為了解除酸抑制，本試驗在培養至10h和培養至10、15h分別調節pH至6.0，培養結果見圖7。由圖7可知，在培養過程中調節pH可以明顯提高丁酸梭菌的生物量，在10h和10、15h分別調節pH至6.0的試驗組菌落數比對照組分別提高了21.02%和39.66%。檢測培養液內剩余葡萄糖，由表2可知，1次補堿組剩余葡萄糖為0.31%、2次補堿組剩余葡萄糖為0.06%。經2次補堿后，葡萄糖基本被利用完全。表明解除酸抑制，不僅延長了菌體的生長對數期，還可提高糖的利用率，同時也大幅度提高了生物量。圖7不同補堿次數對丁酸梭菌菌落數的影響表2間歇控酸發酵液殘糖量檢測結果6.

發酵過程中補料對增菌的影響從試驗可知解除酸抑制后，培養液里的糖基本利用完全，培養基內的碳量偏低，表明對數期菌體生長快，培養基中的營養物質消耗也快，可能會造成后期發酵動力不足。本試驗通過培養至10、15h在2次補堿的同時分別按總量為1%、2%、3%、5%補充初始培養基營養液，結果見圖8。2%的補料量菌數最高，但與1%組差異不顯著。3%、5%補料組的菌落