第第頁糖原磷酸化酶a（Glycogenphosphorylasea，GPa）試劑盒說明書糖原磷酸化酶a（Glycogenphosphorylasea，GPa）試劑盒說明書微量法100管/96樣注意：正式測定前務必取23個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：糖原磷酸化酶（Glycogenphosphorylase，GP，EC2.4.1.1)）是糖原分解代謝的關鍵酶，使糖原分子從非還原端逐個斷開α1，4糖苷鍵移去葡萄糖基，釋放1磷酸葡萄糖，直至臨近糖原分子α1，6糖苷鍵分支點前4個葡萄糖基處。GP分為有活性的糖原磷酸化酶a（GPa）和無活性的糖原磷酸化酶b（GPb）兩種形式。糖原的分解主要在GPa的催化下進行。測定原理：未添加激活劑時，GPa催化糖原和無機磷產生葡萄糖殘基生成糖原和1磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖變位酶和6磷酸葡萄糖脫氫酶進一步依次催化NADP還原生成NADPH，在340nm下測定NADPH上升速率，即可反映GPa活性。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水。試劑的組成和配制：提取液：100mL×1瓶，4℃保存；試劑一：液體16mL×1瓶，4℃保存；試劑二：粉劑×1瓶，20℃保存；試劑三：粉劑×1支，20℃保存；試劑四：粉劑×1支，20℃保存；樣本的前處理：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測。測定步驟：1、分光光度計或酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零；2、工作液的配制：臨用前將試劑二轉移到試劑一中混合溶解待用；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復凍融。3、試劑三的配制：臨用前在試劑三管中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復凍融。4、試劑四的配制：臨用前在試劑四管中加入1mL蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑分裝后20℃保存，禁止反復凍融。5、將工作液、試劑三和試劑四置于37℃預熱5分鐘；6、在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本、10μL試劑三、10μL試劑四、10μL蒸餾水和160μL工作液，立即混勻，記錄340nm處5min后的A1和10min后的吸光值A2，計算ΔA=A2A1.GPa活性計算：a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下：（1）按樣本蛋白濃度計算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。GPa（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=643×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算單位定義：每g組織每分鐘產生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。GPa（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=643×ΔA÷WV反總：反應體系總體積，2×104L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.01mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應時間，5min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g。b.用96孔板測定的計算公式如下：（1）按樣本蛋白濃度計算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘產生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。GPa（nmol/min/mgprot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(V樣×Cpr)÷T=1286×ΔA÷Cpr（2）按樣本鮮重計算單位定義：每g組織每分鐘產生1nmolNADPH定義為一個酶活力單位。GPa（nmol/min/g鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=1286×ΔA÷WV反總：反應體系總體積，2×104L；ε：NADPH摩爾消光系數，6.22×103L/mol/cm；d