第七章

高效液相色譜分析法7.3.1

液相色譜固定相7.3.2液相色譜流動相第三節

液相色譜的固定相與流動相Highperformanceliquidchromatograph,HPLCStationaryphaseandmobilephaseofHPLC2023/11/277.3.1液相色譜固定相

1.液-液分配及離子對分離固定相（1）全多孔型擔體

氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見。現采用10μm以下的小顆粒，化學鍵合制備柱填料。（2）表面多孔型擔體

（薄殼型微珠擔體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量低。2023/11/27（3）化學鍵合固定相

化學鍵合固定相：應用最廣、性能最佳的固定相。

a.硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—

C

穩定，耐水，耐光，耐有機溶劑，應用最廣。

c.硅碳鍵型：≡Si—C

d.硅氮鍵型：≡Si—N2023/11/27化學鍵合固定相的特點：（1）傳質快，表面無深凹陷。（2）壽命長，化學鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機溶劑，穩定。（4）選擇性好，可鍵合不同官能團，提高選擇性。（5）有利于梯度洗脫。存在著雙重分離機制：(鍵合基團的覆蓋率決定)高覆蓋率：分配為主；低覆蓋率：吸附為主。

2023/11/272.液-固吸附分離固定相種類：硅膠、氧化鋁、分子篩、聚酰胺等。種類有限，應用面相對較窄。結構類型：全多孔型和薄殼型；粒度：5～10μm。

2023/11/273.離子交換色譜分離固定相

結構類別：（1）薄殼型離子交換樹脂薄殼玻璃珠為擔體，表面涂約1%的離子交換樹脂。（2）離子交換鍵合固定相薄殼鍵合型；微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團）。

樹脂類別：（1）陽離子交換樹脂（強酸性、弱酸性）。（2）陰離子交換樹脂（強堿性、弱堿性）。2023/11/274.空間排阻分離固定相（1）軟質凝膠

葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等。多孔網狀結構。水為流動相。適用于常壓排阻分離。（2）半硬質凝膠

苯乙烯-二乙烯基苯交聯共聚物，有機凝膠。非極性有機溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑（3）硬質凝膠

多孔硅膠、多孔玻珠等；化學穩定性，熱穩定性好，機械強度大，流動相性質影響小，可在較高流速下使用。可控孔徑玻璃微球，具有恒定孔徑和窄粒度分布。2023/11/27

５.手性固定相生物、藥物分子和天然有機產物的分離。環糊精（CD）結構：2023/11/27環糊精：

空腔內壁為弱疏水性，所有羥基在空腔的外沿呈親水性，這使它們能與各種極性、非極性分子、離子形成包含化合物（主客體配合物）。

1984年Armstrong首次將環糊精鍵合到二氧化硅上用作HPLC的手性分離固定相，目前已成為十分普及的手性固定相。全苯基環糊精分離柱特別適合于分離氨基醇類β阻斷劑，而其他類型手性固定相則很難分離。2023/11/277.3.2液相色譜的流動相1.流動相特性（1）流動相組成改變，極性改變，可顯著改變組分分離狀況。（2）親水性固定液常采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定相的極性，正相，極性柱也稱正相柱。（3）若流動相的極性大于固定液的極性，則稱為反相液液色譜，非極性柱也稱為反相柱。組分在兩種類型分離柱上的出峰順序相反。2023/11/272.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；

按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調節流動相的極性或增加選擇性，以改進分離或調整出峰時間。2023/11/273.流動相選擇

在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據。

采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加。

也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環己烷>己烷>煤油(最小)2023/11/27多元混合溶劑的溶劑極性參數計算

式中

i為混合溶劑中各溶劑的體積百分數。二元混合溶劑的則為式中

A，

B分別為二元混合溶劑中溶劑A和溶劑B的體積百分數。

2023/11/27多元混合溶劑的溶劑極性參數計算

色譜分析需要調節流動相極性使試樣組分的容量因子k的數值在適宜范圍內。對于正相色譜，二元溶劑的極性參數P'和組分的k值存在如下關系：

式中、分別為初始和調節后二元溶劑的極性參數。k1、k2為組分相應的容量因子。2023/11/27例4-3在一反相色譜柱上，當流動相為30%甲醇和70%水(體積比)時，某組分的保留時間為25.6min，死時間為0.35min，如何調節溶劑配比使組分容量因子為5？

解：初始值

=0.75

即調整溶劑比例為75%甲醇和25%水可使該組分的k值為5。2023/11/27溶劑的選擇性溶劑和樣品分子間的作用力用接受質子的能力xe、給予質子的能力xd和靜電力xn(由偶極矩決定)三種參數來表征，并以xe、xd和xn構成一個三角坐標圖

。

溶劑可分為八組而分別位于圖中不同區。I組的xe值較大，屬質子受體溶劑；VII組的xd值較大，屬質子給于體溶劑；V組的xn值較大，屬偶極作用力溶劑。同組溶劑在分離中具有相似的選擇性，不同組差別較大。2023/11/27溶劑的選擇性2023/11/274.選擇流動相時應注意的幾個問題（1）盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質長期累積，損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。（2）避免流動相與固定相發生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失，酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。（3）試樣在流動相中應有適宜的溶解度，防止產生沉淀并在柱中沉積。（4）流動相同時還應滿足