生化分析儀的常用檢測(cè)方法

1整理ppt內(nèi)容一概述二根本原理終點(diǎn)法三檢測(cè)方法固定時(shí)間法連續(xù)監(jiān)測(cè)法2整理ppt功能特點(diǎn)特點(diǎn)：自動(dòng)化——機(jī)械化的儀器設(shè)備模仿代替手工操作優(yōu)點(diǎn)：提高了工作效率減少了主觀誤差靈敏準(zhǔn)確快速標(biāo)準(zhǔn)化3整理ppt分類管道連續(xù)流動(dòng)式按結(jié)構(gòu)原理分分立式——常用離心式干片式——急診常用

小型按測(cè)定速度分中型大型超大型〔模塊式〕按自動(dòng)化程度分半自動(dòng)全自動(dòng)4整理ppt主要構(gòu)成加樣系統(tǒng)〔樣品轉(zhuǎn)盤試劑倉取樣裝置〕比色系統(tǒng)〔光源比色杯單色器檢測(cè)器〕供排水系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)5整理ppt內(nèi)容一概述二根本原理終點(diǎn)法三檢測(cè)方法固定時(shí)間法連續(xù)監(jiān)測(cè)法6整理ppt根本原理臨床生化分析儀最常使用的是——分光光度法分光光度法——是通過測(cè)定被測(cè)物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)光的吸收度，對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的方法。

7整理ppt分光光度計(jì)組成光源樣品池單色器檢測(cè)器記錄裝置8整理ppt光吸收曲線溶液對(duì)不同波長光的吸收程度，通常用光吸收曲線來描述。9整理ppt討論不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似λmax不變。而對(duì)于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和λmax那么不同。不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度A不同，在λmax處吸光度A的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。10整理ppt在分光光度法中,以______為縱坐標(biāo),以____為橫坐標(biāo)作圖可得光吸收曲線。濃度不同的同種溶液,在該種曲線中其最大吸收波長_______，相應(yīng)的吸光度大小那么_______，同一波長下摩爾吸數(shù)。波長不同相同吸光度相同11整理pptLamber-Beer定律：吸收光譜法根本定律描述物質(zhì)對(duì)單色光吸收強(qiáng)弱與液層厚度和待測(cè)物濃度的關(guān)系Lamber定律：A∝lBeer定律：A∝C

入射光強(qiáng)度I0

透射光強(qiáng)度I

物體截面為S

厚度為l12整理pptLambert-Beer〔朗伯-比爾〕定律

當(dāng)一束平行單色光通過均勻的非散射樣品時(shí)，樣品對(duì)光的吸光度與樣品的濃度及厚度成正比

A=kcb

A---吸光度k---吸光系數(shù)c---溶液濃度

b---液層厚度13整理ppt吸光度透光度的負(fù)對(duì)數(shù)表示物質(zhì)對(duì)光的吸收程度

A=-lgT=lg1/T=lgI0/ItT---透光度

I0--入射光強(qiáng)度

It--透射光強(qiáng)度

T=It/I014整理ppt吸光系數(shù)

定義：吸光物質(zhì)在單位濃度及單位厚度時(shí)測(cè)得的吸光度。K值的大小取決于吸光物質(zhì)的性質(zhì)、入射光波長、溶液溫度和溶劑性質(zhì)等，與溶液濃度大小和液層厚度無關(guān)。但K值大小因溶液濃度所采用的單位的不同而異。

15整理ppt吸光系數(shù)

三種表現(xiàn)形式：摩爾吸光系數(shù)ε

吸光系數(shù)a

百分吸光系數(shù)E1%1cm16整理pptLambert-Beer〔朗伯-比爾〕定律

郎伯-比爾定律說明：當(dāng)液層厚度固定時(shí)，溶液的吸光度與溶液的濃度成正比。即：A/C=const故：只要測(cè)出某種溶液的吸光度，將它與濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度進(jìn)行比較，就可以算出該溶液的濃度。17整理ppt討論：

1.Lamber-Beer定律的適用條件〔前提〕:入射光為單色光溶液是均勻，無散射溶液2.該定律適用于固體、液體和氣體樣品3.在同一波長下，各組分吸光度具有加和性如果溶液中同時(shí)存在兩種或兩種以上的吸光性物質(zhì),那么測(cè)得的該溶液的吸光度等于溶液中各吸光性物質(zhì)吸光度的總和，即：A〔a+b+c〕＝Aa＋Ab＋Ac應(yīng)用：多組分測(cè)定18整理ppt偏離Beer定律的因素依據(jù)Beer定律,A與C關(guān)系應(yīng)為經(jīng)過原點(diǎn)的直線偏離Beer定律的主要因素表現(xiàn)為以下兩個(gè)方面：〔一〕光學(xué)因素〔二〕化學(xué)因素19整理ppt〔一〕光學(xué)因素1．非單色光的影響：Beer定律應(yīng)用的重前提—入射光為單色光

照射物質(zhì)的光經(jīng)單色器分光后并非真正單色光其波長寬度由入射狹縫的寬度和棱鏡或光柵的分辨率決定為了保證透過光對(duì)檢測(cè)器的響應(yīng)，必須保證一定的狹縫寬度這就使別離出來的光具一定的譜帶寬度20整理ppt討論入射光的譜帶寬度嚴(yán)重影響吸光系數(shù)和吸收光譜形狀E1＝E2A=E1C·LE1≠E2A與C不成線性關(guān)系，偏離Beer定律〔E2-E1)↑A與C偏離線性關(guān)系越嚴(yán)重結(jié)論：●選擇較純單色光〔Δλ↓，單色性↑〕●選λmax作為測(cè)定波長21整理ppt〔一〕光學(xué)因素2.雜散光的影響雜散光是指從單色器分出的光不在入射光譜帶寬度范圍內(nèi)，與所選波長相距較遠(yuǎn)。雜散光來源：儀器本身缺陷；光學(xué)元件污染造成雜散光可使吸收光譜變形，吸光度變值。22整理ppt〔一〕光學(xué)因素3．反射光和散色光的影響：反射光和散色光均是入射光譜帶寬度內(nèi)的光直接對(duì)T產(chǎn)生影響。散射和反射使T↓，A↑，吸收光譜變形注：一般可用空白比照校正消除4．非平行光的影響：使光程↑，A↑，吸收光譜變形23整理ppt〔二〕化學(xué)因素溶液中的溶質(zhì)可因c的改變而有離解、締合、配位以及與溶劑間的作用等原因而發(fā)生偏離L-B定律的現(xiàn)象。例：在水溶液中，Cr(Ⅵ)的兩種離子存在如下平衡

Cr2O42-+H2O?2CrO42-+2H+

定量分析方法(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線法(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液比照法〔外標(biāo)一點(diǎn)法〕(3)吸光系數(shù)法25整理ppt標(biāo)準(zhǔn)曲線法——最經(jīng)典方法

前提：固定儀器和固定條件

過程：配置標(biāo)準(zhǔn)溶液系列分別測(cè)定A

得C~A曲線樣品測(cè)定A樣查得C樣26整理ppt標(biāo)準(zhǔn)曲線法27整理ppt標(biāo)準(zhǔn)溶液比照法在相同的條件下，配制濃度為cs的標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為cx的試樣溶液，在最大吸收波長處，分別測(cè)定二者的吸光度值為As、Ax，依據(jù)朗伯-比爾定律得:As=KbcsAx=Kbcx

那么:cx=cs*Ax/As28整理ppt標(biāo)準(zhǔn)溶液比照法29整理ppt吸光系數(shù)法吸光系數(shù)法又稱絕對(duì)法，是直接利用朗伯-比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式A＝Kbc進(jìn)行計(jì)算的定量分析方法。在手冊(cè)中查出待測(cè)物質(zhì)在最大吸收波長處的吸光系數(shù)或,并在相同條件下測(cè)量樣品溶液的吸光度A，那么其濃度為：或30整理ppt內(nèi)容一概述二根本原理終點(diǎn)法三檢測(cè)方法固定時(shí)間法連續(xù)監(jiān)測(cè)法31整理ppt終點(diǎn)法終點(diǎn)法——通過檢測(cè)終點(diǎn)吸光度的改變大小來求出被測(cè)物含量。何為終點(diǎn)？如何判斷？通常在反響終點(diǎn)附近連續(xù)選擇兩個(gè)吸光度值，求其平均值，根據(jù)兩點(diǎn)的差值來判斷反響終點(diǎn)。32整理ppt終點(diǎn)法終點(diǎn)時(shí)間確實(shí)認(rèn)：一、根據(jù)時(shí)間-吸光度曲線如:Trinder反響測(cè)尿酸，反響曲線上3-5分鐘時(shí)其A趨向穩(wěn)定,故可將5分鐘作為反響終點(diǎn)。二、根據(jù)被測(cè)物反響終點(diǎn)，結(jié)合干擾物的反響情況來確定如:溴甲酚綠法測(cè)血清白蛋白33整理ppt分類終點(diǎn)法：一點(diǎn)終點(diǎn)法二點(diǎn)終點(diǎn)法免疫比濁法雙波長法34整理ppt一點(diǎn)終點(diǎn)法一點(diǎn)終點(diǎn)法——在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)，選擇一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定吸光度值。通常在反響終點(diǎn)附近連續(xù)讀兩個(gè)吸光度，求出兩點(diǎn)的平均值，并根據(jù)兩點(diǎn)的差值判斷反響是否到達(dá)平衡。35整理ppt一點(diǎn)終點(diǎn)法的設(shè)置：以R和S混合之前的空氣空白、水空白或試劑空白的吸光度值為測(cè)定計(jì)算基點(diǎn)，以反響到達(dá)平衡的吸光度讀數(shù)減去空白讀數(shù)，校準(zhǔn)曲線通過零點(diǎn)且成直線，對(duì)于反響速度快的多用。如：GLUTGCH等36整理ppt2023/11/2537AlT〔時(shí)間〕AS+R(吸光度〕一點(diǎn)終點(diǎn)法反響曲線37整理ppt計(jì)算公式：

C=(Am-Ab)*KAm----終點(diǎn)讀數(shù)點(diǎn)的吸光度

Ab----試劑空白吸光度

K----校正系數(shù)38整理ppt二點(diǎn)終點(diǎn)法

第二試劑參加以前，選擇某一點(diǎn)讀取吸光度Am，經(jīng)過一定時(shí)間后反響達(dá)終點(diǎn)后測(cè)第二個(gè)吸光度值A(chǔ)n,利用兩吸光度之差計(jì)算結(jié)果。第一點(diǎn)吸光度值由樣本本身或第一試劑與樣品的非特異性反響有關(guān)，相當(dāng)于樣品空白，可有效的消除樣品自身的吸光度，如溶血，黃疸，脂血等的干擾。39整理ppt2023/11/2540AnTAR2AmS+R1(吸光度〕〔時(shí)間〕兩點(diǎn)終點(diǎn)Ax=樣本空白An-k0

Am〔體積校正因子〕k0=Sv+RlSv+R1+R240整理ppt兩點(diǎn)終點(diǎn)法計(jì)算公式：

C=(An-K0*Am)*K

K0---體積校正因子K0=(Sv+R1)/(Sv+R1+R2)41整理ppt免疫比濁法

通過物質(zhì)對(duì)光的散射或透射來測(cè)定物質(zhì)含量的方法：散射比濁：特定蛋白分析儀透射比濁：自動(dòng)生化分析儀通常作兩點(diǎn)終點(diǎn)法分析，多采用多點(diǎn)校準(zhǔn)。應(yīng)用：用Ab測(cè)定Ag〔主要為微量蛋白：IG、C、APOA1/B、ASO、RF、CRP等〕，要求Ab過量，此時(shí)Ag-Ab復(fù)合物的生成量隨Ag的增加而遞增，光散/透射射強(qiáng)度與抗原量成正比。42整理ppt免疫比濁法優(yōu)點(diǎn)：方法簡便結(jié)果準(zhǔn)確可用于自動(dòng)化儀器檢測(cè)缺點(diǎn)：抗體用量大達(dá)平衡時(shí)間長43整理ppt雙波長法

消除樣品中對(duì)測(cè)定有干擾的物質(zhì)的影響；在試樣中含有兩個(gè)組分a和b時(shí)，假設(shè)要測(cè)定組分b,組分a有干擾，應(yīng)設(shè)法消除組分a的吸收干擾。首先選擇待測(cè)組分b的最大吸收波長λ1作為測(cè)量波長，然后用作圖的方法選擇參比波長λ2，使組分a在這兩個(gè)波長處的吸光度相等。44整理ppt雙波長法試樣溶液在λ2和λ1兩個(gè)波長處的吸光度之差，只與待測(cè)組分的濃度成正比，而與干擾組分的濃度無關(guān)45整理ppt干擾物質(zhì)1.脂血：吸收光譜300～600nm呈下降趨勢(shì)2.Hb：350nm、400nm、540nm、580nm吸收峰3.膽紅素：300～500nm有吸收峰可見它們的吸收峰都較寬，且同測(cè)定波長有重疊現(xiàn)象。46整理ppt雙波長法主波長的選擇

反響體系中待測(cè)組分吸收峰對(duì)應(yīng)的波長，盡量避開或減少來自試劑空白和樣本空白對(duì)測(cè)定組分的干擾，提高特異性和靈敏度。47整理ppt雙波長法輔助波長的選擇：根據(jù)測(cè)定波長選擇輔助波長，要求干擾物質(zhì)在測(cè)定波長同輔助波長有相同的吸光度，待測(cè)物吸光度差異很大。如:鉬酸銨法測(cè)P3＋用340nm，而Hb在340及380nm均有較高吸收峰，選380nm作為輔助波長。48整理ppt雙波長法雙波長測(cè)定優(yōu)點(diǎn)：①消除噪音干擾②減少雜散光影響③減少樣品本身光吸收的干擾49整理ppt固定時(shí)間法指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，這兩點(diǎn)既非反響初始吸光度亦非終點(diǎn)吸光度，利用這兩點(diǎn)吸光度差值計(jì)算結(jié)果。如：苦味酸法測(cè)肌酐50整理ppt固定時(shí)間法計(jì)算公式：

C=(A2-A1)*K

·●●A1A2T(吸光度〕51整理ppt連續(xù)監(jiān)測(cè)法根據(jù)反響速度與待測(cè)物的濃度成正比，通過測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)吸光度的變化速率〔△A/min〕來計(jì)算待測(cè)物的濃度。酶活性測(cè)定常用52整理ppt酶促反響曲線53整理ppt連續(xù)監(jiān)測(cè)法零級(jí)反響期---酶促反響速度到達(dá)并保持恒定速率進(jìn)行反響，單位時(shí)間內(nèi)的變化速率恒定不變。在零級(jí)反響期單位時(shí)間內(nèi)的吸光度變化(反響速率△A/min)與酶活力呈正比。54整理ppt連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定時(shí)間的選擇：監(jiān)測(cè)時(shí)間應(yīng)根據(jù)所用儀器不影響檢測(cè)速度和結(jié)果的準(zhǔn)確性選在時(shí)間反響進(jìn)程曲線的線性期。通常：延遲時(shí)間：30-60秒監(jiān)測(cè)時(shí)間：>120秒55整理ppt1.連續(xù)監(jiān)測(cè)法

即零級(jí)反響速率法,亦稱斜率法