煙草接種cmv防治效果研究

香煙病毒在不同國家的植煙區都有危害，中國的大多數地區都容易發生。近年來,云南省主要煙區病毒病的發生危害日趨嚴重,且有不斷上升的趨勢,直接影響著云南省煙葉的產量和質量,給云南省煙葉生產造成嚴重損失,目前生產上用于防治煙草病毒病的藥劑比較單一,主要是植病靈Ⅰ號。為此,本試驗通過人工接種CMV后,噴施植病靈Ⅰ號、病毒必克、LZ18-6,菌毒清、植病靈Ⅱ號、金葉寶和植物動力2003進行田間藥效及其抗性機理試驗研究,以期篩選出1～2種最佳抗病毒劑應用于大面積生產。對CMV的防治人們已作了大量的研究工作,王緯等研究得出多效肥對煙草黃瓜花葉病有積極的防治作用。有關研究表明,病毒侵染導致葉片光合作用時葉綠素和類胡蘿卜素的形成受到強烈抑制,煙草感染CMV后可明顯降低光合速率,并使呼吸強度上升,但對PAL活性、總酚和類黃酮有刺激作用。PAL是苯丙烷代謝的定速酶,與此代謝途徑有關的一些物質與植物的抗病性有密切關系。木質素可以加強細胞壁,增加木質化程度,形成病原物入侵的機械屏障,而類黃酮物質中的豌豆素、菜豆素則是重要的植保素,可以防止病原菌的再侵染。1材料和方法1.1供試地與培養試驗于1998年在云南省煙草科學研究所試驗基地病圃進行,供試土壤為砂壤,肥力中等,前作苕子。2月23日播種,5月6日移栽。移栽行株距1.1m×0.65m,施肥及管理同優質煙栽培。1.2材料和來源1.2.1試驗品種K326。1.2.2病毒的接種CMV。把分離提純的CMV在網室接種于黃瓜上擴繁后,取新鮮病葉研磨成汁液,用磷酸緩沖液稀釋500倍待用。1.2.3植物、病毒藥及藥物①1.5%植病靈Ⅰ號,600倍,云南星耀生物制品廠。②3.85%病毒必克,500倍,陜西海浪精細化工有限公司。③LZ18-6,200倍,長沙市金葉天然植物開發有限公司。④5%菌毒清,250倍,云南牟定高新精細化工有限公司。⑤1.5%植病靈Ⅱ號,300倍,山東省曲阜市爾福農藥廠。⑥金葉寶,250倍,河南省長葛市農用生物廠。⑦植物動力2003(PP2003),1000倍,植物動力2003云南推廣中心。1.3測試方法1.3.1噴霧器接種前用藥次數用尼龍網覆蓋至移栽前培育無毒壯苗。移栽后22d(即5月28日)用工農-16型噴霧器在接種前3d,接種后4d,11d按藥劑標簽注明的使用方法各施藥1次,共施藥3次。1.3.2葉片噴槍接種施藥后3d(6月1日)用高壓噴槍接種CMV。病葉汁液稀釋液加入1%600目金剛砂,用高壓噴槍接種,噴射壓力1.5kg/cm2,噴嘴至接種葉片距離3～5cm,點射3次,每秒1次,接種后馬上噴清水至剛有液滴流下。1.3.3試驗設計試驗設7個處理,1個對照,隨機排列,3次重復,共24個小區,每小區栽煙40株,共栽960株,試驗面積666.7m2。1.3.4煙草病害分級及調查方法按小區在接種當天調查病情基數,發病情況在下次施藥當天進行,以后每7d調查一次,共調查5次。以株為單位分級調查,分級標準按《中華人民共和國行業標準》“煙草病害分級及調查方法”進行,編號為YC/T39-1996。計算發病率、病情指數和防治效果,計算方法如下:發病率(％)=發病株數調查總株數×100％(1)(％)=發病株數調查總株數×100％(1)病情指數=∑(各級病株×該病級值)調查總株數×4×100(2)=∑(各級病株×該病級值)調查總株數×4×100(2)相對防治效果(％)=對照病情指數-處理病情指數對照病情指數×100%(3)1.4葉綠素a及類黃酮活性測定在發病盛期(接種后40d)各處理按小區分別取病株和健株腰葉2片,即每處理病株、健株分別取6片葉,測定葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素、總酚和類黃酮含量以及苯丙氨酸酶(PAL)活性。1.4.1葉綠素及類胡蘿卜素含量測定每個樣品用打孔器(直徑0.5cm)取15小片放在25mL容量瓶中,用丙酮∶乙醇=1∶1的溶液定容,常溫下避光保存20h,用分光光度法測定,葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素含量以mg/dm2表示。1.4.2總酚含量測定用電子天平稱取0.5000g新鮮葉片剪至1～2mm的小塊,加1%HCl的甲醇溶液5mL提取24h(4℃),取0.5mL提取液用蒸餾水稀釋至25mL,測定OD280nm和OD325nm,類黃酮含量以OD325nm/g鮮重表示,總酚含量以沒食子酸標準曲線加以計算。1.4.3l-苯丙氨酸氧基的制備取新鮮葉片0.5000g,加0.1000g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),1mL含0.5mmol巰基乙醇的硼酸緩沖液,4℃下研磨,10000r/min離心10min,取上清液0.1mL,加0.5mL0.02mol/L的L-苯丙氨酸,2.75mL重蒸水于30℃水浴中保溫30min,加入0.25mL5mol/LHCl終止反應,取200mL加5mL0.5mol/L巰基乙酸的硼酸緩沖液,測OD290nm,以OD變化為0.01為一個活性單位。2結果分析2.17金葉寶、pp2003對cmv的防治效果從表1可看出,接種1周后開始發病,2周后進入發病高峰,以后病情逐漸上升;不同藥劑對CMV的防治效果差異明顯,金葉寶防效最好,第3次施藥當天防效為54.38%,第3次施藥后9d防治持效仍達40.06%,其次是植病靈Ⅱ號和Ⅰ號,第3次施藥后9d防效分別為28.96%和26.09%,PP2003對CMV無防治效果;從表1中還可看出除PP2003外,各種抗病毒劑的防治效果隨時間的推移逐漸下降。2.2對苯丙氨酸解氨酶活性的影響由表2和表3可看出以下5個方面:①從對照看,煙株感染CMV后與健株相比葉綠素a和類胡蘿卜素、總酚和類黃酮含量、PAL活性上升趨勢,而葉綠素b略有下降。②感染CMV煙株噴施植病靈Ⅰ號、病毒必克、LZ18-6,菌毒清、植病靈Ⅱ號、金葉寶后葉綠素a,b和類胡蘿卜素含量與對照相比明顯降低,噴施上述藥劑后病株與健株的比值在0.71～0.98之間,對照為0.90～1.06之間。③噴施金葉寶、植病靈Ⅱ號與其它處理相比,病株的總酚、類黃酮含量減少,病株與健株的比值在0.93～0.99之間,與其它處理及對照相比,表現為病株所測各項生理指標保持或接近正常煙株的所測各項生理指標;噴施植病靈Ⅰ號、病毒必克、LZ18-6,菌毒清的處理病株總酚、類黃酮含量上升,病株與健株的比值均大于1.00,在1.03～1.66之間。④各處理苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性明顯上升(噴施1.5%植病靈Ⅱ號處理除外),由此推測PAL的活性可能與煙株本身對CMV的抗性有關。⑤噴施PP2003煙株總酚、類黃酮、葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素含量及苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性與對照相近,這與上述PP2003對CMV無防治效果是一致的。3對cmv的防治效果(1)本研究結果表明煙株感染CMV后葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素、總酚、類黃酮含量及PAL活性增高,葉綠素b含量下降;施藥后病株的葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素含量下降,防治效果較好的藥劑,即金葉寶和植病靈Ⅱ號噴施后感染CMV煙株的總酚、類黃酮、PAL活性、葉綠素a,葉綠素b,類胡蘿卜素含量保持或接近正常煙株的含量,說明兩種藥劑都能有效地抑制CMV對煙株的再侵染,這與兩種藥劑防治效果最好是一致的。(2)各處理接種CMV后均不同程度發病,說明上述7種藥劑在接種前3d噴施均不能完全抑制CMV的感染。發病初期噴施LZ18-6,菌毒清和金葉寶能有效控制病情;植病靈Ⅰ號和植病靈Ⅱ號的藥效緩慢但持久,在停藥后10d仍能有效地控制CMV危害的進一步加重;菌毒清、LZ18-6兩種藥劑在施藥期間防效也較好,但停施后防效下降快,說明宜連續施藥方可達到理想的效果。(3)PP2