厭氧氨氧化菌的研究進展

1973年，broda發現，化能自養的細菌可以通過以no-3、a2和no-2為氧化手段的nh-4氧化。推測自然界可能存在以NO-2為電子受體的厭氧氨氧化反應。后來有研究發現氨氧化菌Nitrosomonaseuropaea和Nitrosomonaseutropha能同時硝化與反硝化,利用NH2OH還原NO-2或NO2,或者在缺氧條件下利用NH+4作為電子供體,把NH+4轉化為N2。在利用NO2為電子受體時,其厭氧氨氧化的最大速率(以單位蛋白質計)約為2nmol/(min·mg)。然而在反硝化的小試實驗中發現了一種特殊自養菌的優勢微生物群體,它以NO-2為電子受體,最大比氨氧化速率(以單位蛋白質計)為55nmol/(min·mg)。此反應比Nitrosomonas快25倍,把這種細菌稱為厭氧氨氧化菌。在無分子氧環境中,同時存在NH+4和NO-2時,NH+4作為反硝化的無機電子供體,NO-2作為電子受體,生成氮氣,這一過程稱為厭氧氨氧化。近年來,在厭氧氨氧化菌生理生化特性的理論研究領域和廢水生物脫氮的應用研究領域都有了許多新的發現,這對于全面認識厭氧氨氧化菌的性質、開發新的廢水脫氮技術都具有重要意義。1厭氧細菌的微生物特征1.1厭氧細菌的菌株1.1.1微生物特性分析Strous等研究了SBR反應器中厭氧氨氧化污泥(優勢菌為B.anammoxidans)的生理學參數。富集培養得到的細菌70%以上是一種優勢自養菌。經過pH7.4、20mmol/L的K2HPO4/KH2PO4緩沖劑和2.5%的戊二醛混合液處理后,在電子顯微鏡下表現出不規則的微生物特性。采用改進的Percoll密度梯度離心分離法分離得到了非常純的細胞懸浮物,在每200~800個細菌中含有不到1個雜細菌。這些純化的厭氧氨氧化菌活性很高,從中提取的DNA通過PCR擴增確認。16SrRNA的分析表明B.anammoxidans是厭氧氨氧化工藝的功能微生物,確認了厭氧氨氧化菌是Planctomycetales序列中自養菌的一個新成員,被命名為Candiadatus“B.anammoxidans”。此菌種適宜的pH值和溫度范圍分別為6.7~8.3,20℃~43℃。最佳條件:pH8.0,溫度40℃。對NH+4和NO-2的親和力常數低于0.1mgN/L,生物量細胞產率(以單位氨計)為(0.066±0.001)mol/mol,最大比氨消耗速率(以單位蛋白質計)為(45±5)nmol/(min·mg),倍增時間為11d。1.1.2鹽的抗氧化作用Egli等的研究結果表明,K.stuttgartiensis與B.anammoxidans的作用方式類似,電鏡顯示其細菌結構也類似。但它對磷酸鹽有更高耐受性(20mmol/L),對亞硝酸鹽耐受性則為13mmol/L,在細胞密度更低的情況下有活性。最大的厭氧氨氧化活性(以單位蛋白質計)為26.5nmol/(mg·min),比B.anammoxidans低。pH范圍是6.5~9.0,最佳為8.0。最佳溫度為37℃,在45℃時觀察不到厭氧氨氧化活性,并且發現溫度降至37℃時厭氧氨氧化活性不會恢復。在11℃時的活性約為37℃的24%,可見它適宜生存于中溫偏堿性環境。1.1.3tus和ndidaus的生理特性它又分為兩種厭氧氨氧化菌種Candidatus“Scalinduabrodae”和Candidatus“Scalinduawagneri”,其生理特性研究較少。1.2oxosose類核分析厭氧氨氧化菌是革蘭氏陰性光損性球狀化能自養菌,直徑不到1μm。具有蛋白質的S層,細胞壁上存在漏斗狀結構,無肽聚糖,厭氧氨氧化菌有一個單一雙分子層(膜)即厭氧氨氧化體(anammoxosome)。厭氧氨氧化菌的細胞質因此被anammoxosome分為3個部分:(A)外部區域(細胞壁(cellwall),細胞質膜(cytoplasmicmembrane),PP質(paryphoplasm),細胞內質膜(intracytoplasmicmembrande))。(B)核糖質(riboplasm)。(C)厭氧氨氧化體膜(anammoxosomemembrane),厭氧氨氧化體(anammoxosome),類核(nucleoid),見圖1。在富集培養期間,厭氧氨氧化菌污泥顏色從棕色變為深紅。對厭氧氨氧化菌細胞和細胞提取物的可見光譜分析發現c型細胞色素的吸收信號明顯增加。77K的細胞光譜分析表明沒有a型、b型和d1型的細胞色素。在厭氧氨氧化活性增加期間,468nm處的吸收信號逐漸增加并達到最高值,用CO處理后就消失。1.3培養基組成對甲烷的抑制效果厭氧氨氧化菌培養基含NH+4(5~30mmol/L)、NO-2(5~35mmol/L)、重碳酸鹽(10mmol/L)、礦物質及微量元素。Dapena-Mora等研究了氣提式反應器(gasliftreactor)和SBR中厭氧氨氧化過程的穩定性,其培養基的組成為:(NH4)2SO40.132~4.240g,NaNO20.069~5.420g,NaNO30.425g,KHCO31.25g,NaH2PO40.05g,CaCl2·2H2O0.3g,MgSO4·7H2O0.2g,FeSO40.00625g,EDTA0.00625g,微量元素溶液:1.25mL,用蒸餾水定容至1L。磷酸鹽濃度應低于0.5mmol/L,加入甲烷不抑制氨和亞硝酸鹽的轉化,在長期的試驗中發現甲烷不被厭氧氨氧化菌轉化。在短期試驗中,反應器中加入H2后,明顯的刺激了厭氧氨氧化。但H2不能取代氨作為電子供體。短時間的批試驗中投加不同有機底物(丙酮酸鹽、甲醇、乙醇、丙氨酸、葡萄糖、酪蛋白氨基酸)會嚴重抑制厭氧氨氧化菌的活性,因此底物的范圍被局限為:NH+4-N、NO-2-N、肼和羥胺。1.4o2對厭氧氨氧化活性的影響Strous等發現NO-2濃度超過98mg/L時抑制厭氧氨氧化活性,當亞硝酸鹽濃度超過5mmol/L時,若持續時間較長(12h),厭氧氨氧化活性將完全消失,但加入微量(50μmol/L)羥胺或肼,則可以恢復活性。超過2mmol/L的磷酸鹽濃度將會造成厭氧氨氧化活性的喪失。O2對厭氧氨氧化是可逆抑制。γ射線照射或121℃下消毒污泥,或在接種期內沒有接種菌種將不會發生厭氧氨氧化反應;在接種期投加不同的抑制劑(2,4-二硝基酚、碳酰基氰間氯笨腙、HgCl2)時,完全抑制氨的氧化和硝酸鹽的還原,乙炔對厭氧氨氧化也有很強的抑制作用。2厭氧細菌的生物反應機制2.1環形系統的類型)厭氧氨氧化菌脂質含有酯連接和醚連接的混合脂肪酸,并發現了獨特的膜脂結構:環狀系統X(圖2-Ⅱ),環狀系統Y(圖2-Ⅰ)和2種不同的環狀系統(X+Y)見圖2-Ⅲ。環狀系統X和Y的所有環被cis-環連接,導致了象樓梯式的結構,因此定義為Ladderanelipids。有研究表明在Candidatus“B.anammoxidan”中,LadderaneX和LadderaneY占總脂的34%。目前這種梯式烷膜脂只在厭氧氨氧化菌中發現。2.2h4的轉化為氮氣VandeGraaf用15N作為示蹤元素,研究了厭氧條件下的氨氧化,提出了浮霉狀菌綱細菌在厭氧條件下以亞硝酸鹽為電子受體的氨氧化代謝途徑。假設N2H4轉化為氮氣的過程是為了給NO-2還原為NH2OH的反應提供等量的電子。得到兩種可能的機理。其一:一個由周圍是膜的酶復合體把氨和NH2OH轉化為N2H4,N2H4則在外周胞質內氧化為氮氣。利用內部電子轉移,酶復合體負責N2H4氧化,而在這種酶復合體的細胞質位置上NO-2被還原為NH2OH。其二:氨和NH2OH在細胞質內被一種周圍是膜的酶復合體轉化為N2H4。N2H4在外周胞質內轉化為氮氣,它產生的電子通過電子傳輸鏈傳遞給細胞質內的亞硝酸鹽還原酶。2.3磷酸腺苷的合成厭氧氨氧化反應的關鍵酶之一是位于anammoxosome的肼氧化酶(HZO),提出了生化模型(圖3):NH+4和羥胺(NH2OH)被肼水解酶(HH)結合為肼。肼又被肼氧化酶(HZO)氧化,HZO與HAO(N.europaea)有些相似。氧化發生在anammoxosome的里面,形成N2、4個質子和4個電子。這4個電子和從來自Riboplasm中的5個質子一起被亞硝酸還原酶(NIR)還原亞硝酸鹽至羥胺。在這個模型中,通過消耗在Riboplasm中的質子和在anammoxosome里面產生的質子,厭氧氨氧化反應建立了一個質子梯度。這就導致了電化學質子梯度直接從anammoxosome到Riboplasm。這種梯度含有化學勢能(ΔpH)和電子勢能(Δψ)。ΔpH和Δψ都有一種讓質子從anammoxosome的里面到外面的一種力(質子驅動力Δp)。在厭氧氨氧化體膜的三磷酸腺苷酶(ATPase)的催化作用下合成三磷酸腺苷(ATP)。質子通過ATPase形成的質子孔回到Riboplasm中,厭氧氨氧化體膜的ATPase位于Riboplasm中球狀的、親水的ATP合成區和厭氧氨氧化體膜中非親水的質子遷移區上,合成的ATP在Riboplasm中被釋放。3厭氧細菌的應用3.1連續攪拌反應器中亞硝酸鹽氧化的研究Mulder等在厭氧流化床中發現了厭氧氨氧化。后來,vandeGraaf等和Bock等發現了以亞硝酸鹽為電子受體的厭氧氨氧化過程。鄭平等研究了厭氧氨氧化菌混培物的動力學特性。FuxChristian等進行中試試驗研究,首先在連續攪拌反應器中完成亞硝化,58%的NH+4-N轉化為NO-2;在SBR中完成厭氧氨氧化,除N速率為2.4kgN/(m3·d),除N達90%;Sliekers等在gasliftreactor中發現除N速率達8.9kgN/(m3·d),這個除N速率是實驗室所獲得的除N速率的20倍。Dapena-Mora等研究中發現在gasliftreactor中N負荷率為2.0g/(L·d),最大比厭氧氨氧化活性(MSAA)為0.9g/(g·d)。在SBR中N負荷率為0.75g/(L·d),MSAA為0.4g/(g·d),除NO-2達99%。3.2nh+4-n的處理效果Jetten等利用SHARON-ANAMMOX聯合工藝對污泥消化出水進行了研究。SHARON反應器總氮負荷為0.8kg/(m3·d),轉化53%的總氮(39%NO-2,14%NO-3),用SHARON反應器的出水作為厭氧氨氧化流化床反應器的進水,在限制NO-2的厭氧氨氧化反應器中NO-2全部被除去。試驗中NH+4-N的去除率達83%。VanDongen等應用SHARON-ANAMMOX聯合工藝在工廠中長時間穩定運行。3.3氧化菌和微生物菌群Dijkman和Strous描述了一個新的生物脫氮工藝CANON,在限氧條件下(<0.5%空氣飽和度)得到了好氧和厭氧氨氧化菌的混培物,NH+4被需氧氨氧化菌(Nitrosomonas和Nitrososira)氧化為亞硝酸鹽,然后被厭氧氨氧化菌轉化為氮氣,此過程依賴于2種(Nitrosomonas需氧菌和Planctomycete厭氧氨氧化菌)自養微生物菌群的協同作用。CANON在2種不同的反應器(SBR和恒化器)中進行,容積負荷0.1(kgN)/(m3·d),除氮達92%。Sliekers等發現在限氧條件以及好氧氨氧化菌和厭氧氨氧化菌都有合適的負荷率時,SBR反應器中除N負荷率達0.3(kgN)/(m3·d),NH+4主要轉化為N2(85%),其余的轉化為硝酸鹽(15%)。Sliekers等用gasliftreactor,除N負荷率達1.5(kgN)/(m3·d),這個速率是以前實驗室獲得的速率的20倍。Hao等開發了在生物膜反應器中混合硝化(亞硝化+硝化)、厭氧氨氧化的數學模型,基于此模型,評價了CANON過程的溫度,流速。3.4電子供體反硝化技術Jetten等通過污泥消化產甲烷除去COD,N部分氧化至NO-2,然后以NH+4為電子供體反硝化,實現了甲烷化和厭氧氨氧化。ZHANG運用EGSB反應器技術COD的去除率97%、NO-2去除率100%,容積負荷達6.56gCOD/(L·d)和0