藤茶主要成分的含量及作用機理

藤本植物的學名是仙女興隆。這是葡萄科蛇葡萄糖屬的一種野生藤本植物。它也是一種典型的茶類。這是a.印度菖蒲的一個變種。主要分布在我國云南東南部、廣東、福建、江西、貴州、湖南和西部。它生長在海拔400.130m的山區(qū)灌木叢、森林、石頭、溝渠等地。研究發(fā)現,藤茶總黃酮含量最高可達44.0%,其中二氫楊梅素單體最高含量達38.5%,實屬黃酮類化合物在植物體中分布的1種特例。藤茶的主要成分總黃酮和二氫楊梅素具有消炎、鎮(zhèn)痛、止咳、祛痰及抗氧化、抑菌、抗高血壓、降血糖、消脂、保肝護肝及解酒、抗腫瘤等多重功效。因此,藤茶總黃酮和二氫楊梅素的提取檢測受到國內外的廣泛關注。本文對藤茶總黃酮和二氫楊梅素已優(yōu)化的提取方法及其檢測方法進行綜述,以期為應用實踐提供理論依據。1提取藤黃酮的方法1.1分離溶劑用量小、成本低、需注意的強傳統提取法是經典的提取方法,其具有設備簡單、操作方便和易于實現等優(yōu)點,廣泛應用于工業(yè)化生產,但也存在費時、費溶劑、效率低、重現性差、提取率低等缺點,且所用溶劑通常有毒,易對環(huán)境和操作人員造成危害。1.1.1提取條件的確定從經濟角度和操作方便而言,實驗中通常將水作為首選溶劑。王志宏比較了溫浸提取、回流提取和超聲提取3種藤茶總黃酮的提取方法,結果表明回流提取的提取效率最高,溫浸和超聲提取效率都較低,通過單因素和正交試驗得到回流提取最佳條件:水料比100∶1,100℃下提取45min,回流2次,所得總黃酮含量高達35.93%。倪媛等以速溶藤茶為原料,在單因素試驗基礎上,響應面優(yōu)化設計茶水比、浸提溫度、浸提時間和粒度4因素對總黃酮含量的影響,根據分析結果得出最優(yōu)浸提方案:茶葉粒度830μm,茶水比1∶25,100℃下浸提30min,總黃酮1次浸出含量達31.60%。1.1.2藤茶總黃酮最佳浸提條件的確定現有研究表明,藤茶中總酮以二氫楊梅素為主,二氫楊梅素屬雙氫黃酮醇,水溶性較差,易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑。由于甲醇、丙酮毒性較大,乙醇毒性小,且經濟易得,因此有學者以乙醇為提取劑,對總黃酮的提取進行研究。陳玉瓊等在單因素試驗的基礎上,采用二次回歸正交旋轉組合設計,結合總黃酮的純度和對超氧陰離子自由基清除率活性分析,藤茶總黃酮的最佳浸提條件為乙醇濃度67%~85%,料液比1∶30~1∶40,浸提溫度65~77.5℃,浸提時間60~100min。易海燕以清除超氧陰離子自由基活性為跟蹤,在前期單因素試驗的基礎上,應用二次回歸正交旋轉組合設計得藤茶總黃酮提取的最佳條件:藤茶原料經脫脂后,加10倍70%的乙醇,于70℃水浴中提取3次,每次60min。李安琪在單因素試驗的基礎上,利用二次回歸正交旋轉組合設計實驗,結合生產中的成本和操作問題,得出脫脂后藤茶總黃酮的最佳浸提條件為乙醇濃度65%,料液比1∶40,77.5℃下浸提90min。從以上優(yōu)化條件可以看出,乙醇的體積分數在60%~80%較適宜。乙醇的體積分數過低,提取的水溶性雜質較多,體積分數過高,提取的非極性物質較多,且浪費有機試劑,這均會導致總黃酮得率的下降。1.2藤茶總黃酮的提取超聲波提取法能夠更有效地提高有效部位提取率、瞬間穩(wěn)定和升高溫度,對熱不穩(wěn)定成分影響較小。陳帥等在考察乙醇體積分數、液料比、提取時間和提取次數4個因素的基礎上,采用L9(34)正交試驗,以總黃酮得率為考察指標,得到超聲輔助提取藤茶總黃酮的最佳條件:70%乙醇,液料比30∶1,提取時間20min,提取3次,總黃酮得率為35.86%。超聲提取具有短時、高效、節(jié)能的優(yōu)點,因此陳帥等提出該方法可用于藤茶總黃酮的提取。向東山采用四因子二次正交旋轉組合設計,研究提取溫度、提取時間、提取次數和料液比4個因素對藤茶總黃酮得率的影響,并用DPS9.50分析軟件建立4個因素對總黃酮得率的數學模型,所得回歸方程達到極顯著水平,無失擬因素存在,最優(yōu)提取條件為:75%乙醇,料液比為1∶25,提取溫度90℃,超聲提取30min,提取3次,根據該最優(yōu)提取條件對預測值進行驗證,其結果為16.51%(±0.85)%(n=6),與最優(yōu)條件下黃酮得率相差不大,說明預測值與實際值擬合情況較好。2直接檢測法主藤茶總黃酮的檢測方法以紫外分光光度法為主,包括ZrOCl2·8H2O顯色法、AlCl3顯色法和直接檢測法。此外,還有熒光檢測法可用于藤茶總黃酮的檢測。2.1藤茶總黃酮含量測定很多物質的溶液雖然無色,但在紫外區(qū)(200~400nm)有特征吸收,根據朗伯-比爾定律,對在紫外區(qū)有特征吸收的物質進行分光光度測定的方法叫做紫外分光光度法,簡稱UV法。覃潔萍等以ZrOCl2·8H2O為絡合劑,采用差示分光光度法,以二氫楊梅素為標樣,測定波長為318(±1)nm,測得廣西瑤族藤茶精制品中總黃酮的含量高達45.50%。何桂霞等以同樣方法對湖南不同產地不同采收期藤茶的葉、莖進行含量測定,用95%乙醇回流提取總黃酮,結果5月份采集的藤茶葉中總黃酮含量最高為41.2%~45.3%,葉中含量高于莖中3~4倍。藤茶總黃酮的檢測通常采用A1Cl3顯色法,其原理是是黃酮類物質與鋁離子形成穩(wěn)定的絡合物。甲醇回流提取藤茶總黃酮,以二氫楊梅素為標樣,采用AlCl3顯色分光光度法,最大吸收波長為314nm,總黃酮含量約45%。熊皓平等用95%的乙醇回流浸提顯齒蛇葡萄幼嫩莖葉中總黃酮,選用與以上方法選用相同的顯色劑,最大吸收波長為294nm,測得幼葉干樣及加工成品中總黃酮含量均在36%以上。周大寨等以95%乙醇為溶劑提取藤茶中總黃酮,A1Cl3為顯色劑,采用三波長紫外光譜法檢測藤茶總黃酮,在波長λ1=322nm、λ2=311nm、λ3=296nm處測得來鳳縣藤茶總黃酮的含量約為28μg/mL。成桂鳳等比較了“二氫楊梅素”的紫外吸收光譜和“二氫楊梅素+A1Cl3”顯色后的紫外吸收光譜,發(fā)現兩者在最大吸收波長下的吸光度值差別不大,只是顯色導致了紅移,而二者吸光度差值較大的波長處是375nm,此時吸光度值卻很小,又A1Cl3顯色法穩(wěn)定性較差,成桂鳳等從而提出以二氫楊梅素為標樣,不顯色直接用紫外法于291nm處測定藤茶總黃酮含量,這樣更方便、穩(wěn)定,且節(jié)省試劑,成桂鳳等分別以甲醇、乙醇和水為提取劑進行試驗,所得藤茶總黃酮提取得率相近,均在35%~39%。2.2測定總黃酮含量的確定根據黃酮類化合物本身具有熒光的性質,朱炯波等研究了熒光分析法直接測定顯齒蛇葡萄總黃酮含量的條件,以蘆丁為標樣,激發(fā)及發(fā)射波長分別為424nm和530nm,以pH=2的95%乙醇作溶劑,2~4h內定,檢出限為2.07×10-9mol/L,對樣品溶液進行5次平行測定,所得總黃酮平均含量為4.00%,RSD為1.62%,樣品測定重現性較好。3二羥楊梅素提取方法3.1氫楊素最佳提取工藝的確定傳統的二氫楊梅素提取方法有熱提取法(煎煮法、回流提取法)和浸泡提取法(滲透法、冷浸法)。謝郁峰等在單因素試驗基礎上,選取乙醇體積分數、料液比和提取時間為自變量,二氫楊梅素提取率為響應值,采用三因素三水平響應面分析法優(yōu)選二氫楊梅素的提取工藝,所得最佳提取工藝條件為17倍量81%乙醇,回流提取95min,在此條件下,二氫楊梅素提取率可達9.58%,與理論值9.72%僅相差0.14%,說明方程可較好的預測二氫楊梅素的理論提取率。涂招秀等以二氫楊梅素得率為指標,通過單因素和正交試驗得到最佳提取條件:原料粒度180μm,料水比1∶25,95℃下提取120min,在此條件下,二氫楊梅素得率為22.8%。曹敏慧等采用熱水提取法,通過單因素和正交試驗得到最佳提取條件為料水比1∶25,100℃下回流提取60min。3.2最佳提取工藝的確定微波利用分子極化或離子導電效應直接對物質進行加熱,因此熱效率高、升溫快速均勻,大大縮短了萃取時間,提高了萃取效率。楊鈴等以水為溶劑,通過L9(33)正交試驗表明,在料液比1∶20,提取溫度95℃,微波輻射時間15min的條件下,二氫楊梅素的提取率最高達46.89%。鄭成等通過單因素分析和正交試驗,確定最佳提取工藝條件為,以水為提取劑,料液比1∶20,浸泡10min,濾渣微波照射3min,微波功率為高檔,合并濾液濾渣,100℃下水浴浸提2h,二氫楊梅素的提取率為29%。韋星船等利用微波裝置并結合食品高溫高壓滅菌裝置,考察了料液比、微波溫度、微波時間、微波功率、轉子轉速和高溫高壓時間6個因素對二氫楊梅素提取率的影響,通過單因素和正交試驗,確定最佳提取條件為料水比1∶25,微波溫度95℃,微波時間5min,微波功率600W,轉速高速,高溫高壓時間45min,在此條件下,二氫楊梅素提取率為30.94%。3.3超聲輔助提取二氫楊樹超聲波提取法具有提取周期短、提取溫度低等優(yōu)點。姚茂君等通過單因素和正交試驗,得到超聲波輔助提取二氫楊梅素的最佳條件:以65%乙醇溶液為提取劑,料液比1∶15,提取溫度40℃,提取40min,二氫楊梅素的一次提取率達93.1%,優(yōu)于常規(guī)的溶劑提取法。3.4最佳提取條件的確定超臨界流體萃取法通常以無毒的CO2為介質,其對產品無毒,特別適用于醫(yī)藥、食品添加劑等產品的提取。沈露采用該技術,通過單因素和正交試驗,得到提取二氫楊梅素的最佳條件為萃取壓力25MPa、萃取溫度50℃、萃取時間1.5h、CO2流量20~25L/h時,此條件下二氫楊梅素的萃取得率為15.40%,純度可達85.5%。超臨界流體萃取二氫楊梅素具有節(jié)省試劑、無污染的優(yōu)點,但由于一次性設備投資較大、回收率較低、運行成本高等原因,此方法很難實現大規(guī)模生產。3.5微波前后提取工藝的比較半仿生提取法是模擬口服給藥及藥經胃腸道運轉的原理,為經消化道給藥的中藥制劑設計的一種新的提取方法。微波輻射能夠同時達到加熱均勻、破壞細胞結構和縮短加熱時間的效果。將以上二者結合起來,產生一種高效、環(huán)保的提取方法,且可有效避免因加熱時間長引起的有效成分破壞。倪峰等采用該方法,以蛇葡萄素含量為考察指標,選用U9(91×33)均勻設計試驗,得到最佳提取工藝為:3次提取用水pH分別為6.0、7.5、9.0,微波處理時間依次為3、1.5、1.5min。研究者曾設計使提取溶劑均未調pH值,在其余條件不變的情況下,結果發(fā)現未調pH的提取量僅為半仿生提取法的40%左右,說明半仿生提取法的酸堿連續(xù)提取能有效提高藤茶提取物中活性成分的含量。3.6微波動態(tài)循環(huán)提取二氫楊樹模微波動態(tài)循環(huán)階段連續(xù)逆流提取(MDMCE)將微波提取與動態(tài)循環(huán)階段連續(xù)逆流提取有效地結合起來,將多個提取單元科學組合,使單位時間內固液兩相保持較高的濃度差,從而提高提取效率。李衛(wèi)等采用MARS5微波裝置(美國CEM公司),利用其1次可進行多罐提取的特點,采用微波動態(tài)循環(huán)階段連續(xù)逆流提取的方法,正交試驗得到5階段MDMCE提取二氫楊梅素的最佳條件為料液比1∶30,提取時間10min,提取溫度110℃,微波功率600W,在此條件下,MDMCE的提取率為92.2%,排出渣中二氫楊梅素百分含量為3.1%,對應的微波靜態(tài)間歇提取(MSBE)提取率為67.4%,排出渣中二氫楊梅素百分含量為13.0%。因此,在相同原料量、相同提取劑用量及相同提取條件下,MDMCE比MSBE提取效率高。Li等進一步比較了不同提取劑(水、甲醇和乙醇)的提取效果,發(fā)現以水為提取劑的提取率最高,并通過正交試驗進一步得到5階段MDMCE提取二氫楊梅素的最佳條件為水料比30∶1,提取時間5min,提取溫度110℃,微波功率600W,在此條件下,MDMCE提取率比對應的微波靜態(tài)間歇提取(MSBE)提取率高20%~30%。4高效液相色譜法藤茶二氫楊梅素的檢測方法主要有薄層、紫外和高效液相色譜法。其中,高效液相色譜法具有分離速度快、效率高、精密度和準確度較高等優(yōu)點,廣泛用于藤茶二氫楊梅素的檢測。4.1樣品預處理和se-cmc-na法薄層掃描法具有快速、簡單、穩(wěn)定,測定結果準確、可靠,流動相用量少且選擇范圍寬、更換方便等優(yōu)點,且固定相為一次性使用,對樣品的預處理要求不高。但其準確度和精密度均不如HPLC。何桂霞等采用薄層掃描法,分別吸取供試樣品和對照品溶液點樣于硅膠G-CMC-Na薄層板(105℃活化0.5h)上,以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(10∶8∶5)為展開劑,展距15cm,用3%FeCl3乙醇溶液噴霧,顯色后密封。二氫楊梅素斑點呈紫色,藤茶中二氫楊梅素的含量為38.17%~38.54%。4.2蛇葡萄素的分布紫外分光光度法具有操作簡便、重現性好的特點。魏捷用紫外分光光度法,以蛇葡萄素為對照品,在292nm下,所測顯齒蛇葡萄各部位均含蛇葡萄素,其分布狀態(tài)以老葉較高為12.39%,嫩枝葉次之為19.98%,莖枝和根中微量。4.3月份藤茶中二氫楊梅素純品的制備高效液相色譜分離技術具有分離速度快、效率高的特點。何桂霞等采用HPLC法對不同產地不同采收期藤茶葉、莖中二氫楊梅素的含量進行測定,用Nova-PakC18色譜柱(150