第一章緒論分子生物學基本含義：從廣義來講，分子生物學是從分子水平闡明生命現(xiàn)象和生物學規(guī)律的一門新興的邊沿學科。它重要對蛋白質及核酸等生物大分子構造和功效以及遺傳信息的傳遞過程進行研究。從狹義來講，分子生物學的范疇偏重于核酸（或基因）的分子生物學，重要研究基因或DNA的復制、轉錄、體現(xiàn)和調節(jié)控制等過程，固然其中也涉及與這些過程有關的蛋白質和酶的構造與功效的研究。DNA重組技術：DNA重組技術（又稱基因工程）是將DNA片段或基因在體外經(jīng)人工剪接后，按照人們的設計與克隆用載體定向連接起來，轉入特定的受體細胞中與載體同時復制并得到體現(xiàn)，產(chǎn)生影響受體細胞的新的遺傳性狀。信號轉導：是指外部信號通過細胞膜上的受體蛋白傳到細胞內(nèi)部，并激發(fā)諸如離子通透性、細胞形狀或其它細胞功效方面的應答過程。轉錄因子：是指一群能與基因5′端上游特定序列專一結合，從而確保目的基因以特定強度在特定時間和空間體現(xiàn)的蛋白質分子。RNA的選擇性剪切：是指全部基因中的內(nèi)含子并不是一次全部切去，而是在不同的細胞或不同的發(fā)育階段選擇性剪切部分內(nèi)含子，生成不同的mRNA及蛋白質分子。基因組：指某種生物單倍體染色體中所含有基因的總數(shù)，也就是包含個體生長、發(fā)育等一切生命活動所需的全部遺傳信息的整套核酸。功效基因組：又稱后基因組，是在基因組計劃的基礎上建立起來的，它重要研究基因及其所編碼蛋白質的構造和功效，指導人們充足精確地運用這些基因的產(chǎn)物。生物信息學：是生物科學和信息科學重大交叉的前沿學科，它依靠計算機對所獲得數(shù)據(jù)進行快速高效計算、統(tǒng)計分類以及生物大分子構造功效的預測。構造分子生物學：就是碩士物大分子特定空間構造及構造的運動變化與其生物學功效關系的科學。發(fā)展簡史：第一，萌芽階段：DNA是遺傳物質的證明。第二，建立和發(fā)展階段：DNA雙螺旋模型和中心法則的建立。第三，進一步發(fā)展和應用階段：①重組技術的建立和發(fā)展，②基因組研究的發(fā)展，③功效基因組研究的發(fā)展，④基因體現(xiàn)調控機理的研究。DNA重組技術的應用前景：1、可用于大量生產(chǎn)某些在正常細胞代謝過程中產(chǎn)量很低的多肽。2、DNA重組技術能夠變化某些生物的基因組構造。3、DNA重組技術還被用來進行基礎研究。兩個重要的典型實驗驗證遺傳物質是ＤＮＡ不是蛋白質：肺炎雙球菌DNA轉化實驗，T4噬菌體DNA浸染細菌的實驗★★第二章染色體與DNA第一節(jié)染色體染色體：是指存在于細胞核中的棒狀可染色構造，由染色質構成。染色質是由DNA、RNA和蛋白質形成的復合體。染色體是一種動態(tài)構造，在細胞周期的不同階段明顯不同。真核細胞染色體的特性：染色體位于細胞核的核仁內(nèi)。在細胞分裂間期，染色體以較細且松散的染色質形式存在，只有在細胞分裂期，才可在光學顯微鏡下觀察到棒狀可染色的染色體。在染色體中，DNA與組蛋白和非組蛋白完全融合在一起。原核細胞染色體的特性:染色體位于類似“核”的構造—類核體上；染色體外包裹著稀疏的非組蛋白，不含組蛋白；原核生物中普通只有一條染色體，且大都帶有單拷貝基因，只有極少數(shù)基因（如rRNA基因)是以多拷貝形式存在的；整個染色體幾乎完全由功效基因和調控序列所構成。真核細胞染色體的構成：（2種）蛋白質和DNA；（3種）組蛋白、非組蛋白和DNA。非組蛋白：涉及酶類及細胞分裂有關的某些蛋白。它們可能與DNA的構造、復制及轉錄等有關。涉及：高速泳動蛋白（HMG，可能與超螺旋構造有關）、DNA結合蛋白（可能是某些與DNA的復制或轉錄的關的酶或調節(jié)物）、A24非組蛋白（肝臟中特有的一組蛋白，與H2A及泛素構造相似，功效不詳）。組蛋白：是染色體的構造蛋白，它與DNA構成核小體，是一類小的堿性蛋白。組蛋白的特性：①進化上的極端保守（如H3、H4）；②無組織特異性；③肽鏈上氨基酸分布的不對稱性（賴氨酸、精氨酸含量豐富）；④組蛋白的修飾作用（甲基化、乙?；⒘姿峄?；⑤富含賴氨酸的組蛋白H5（H5的磷酸化可能在染色質的失活過程中起重要作用）。C-值（C-value）:一種生物單倍體基因組DNA的總量。C-值矛盾（C-valueparadox）：基因組大小與機體的遺傳復雜性缺少有關性。真核細胞DNA的種類:1、不重復序列：在單倍體基因組中只有一種或幾個拷貝的DNA序列。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝。2、中度重復序列:每個基因組中10～104個拷貝。平均長度為300bp，普通是不編碼序列，廣泛散布在非重復序列之間?？赡茉诨蛘{控中起重要作用。常有數(shù)千個類似序列，各重復數(shù)百次，構成一種序列家族。大多數(shù)高等真核生物的基因組都有10%~40%的中度重復序列。3、高度重復序列——衛(wèi)星DNA：只存在于真核生物中，占基因組的10%~60%，由6~100個堿基構成。衛(wèi)星DNA均位于染色體的著絲粒。染色質：是由許多核小體連成的念珠狀構造。核小體：是構成染色質的重復單位，每個核小體由約200（160～250）bp的DNA，和H2A、H2B、H3、H4各2個，以及一種H1構成。其中，H2A，H2B，H3，HDNA多態(tài)性：指DNA序列中發(fā)生變異而造成的個體間核苷酸序列的差別，重要涉及單核苷酸多態(tài)性（SNP）和串聯(lián)重復序列多態(tài)性兩類。真核生物基因組的構造特點：1、基因組龐大；2、大量重復序列的存在；3、大部分序列為非編碼序列；4、轉錄產(chǎn)物為單順反子；5、真核基因是斷裂基因；6、真核基因存在大量的順式作用元件；7、DNA存在多態(tài)性；8、含有端粒構造。真核生物基因組龐大的因素：①存在大量的重復序列②大部分為非編碼序列③真核生物的基由于斷裂基因，含有內(nèi)含子構造原核生物基因組的特點1、構造簡潔：其DNA分子絕大多數(shù)用于編碼蛋白質，并且編碼序列是持續(xù)的；2、存在轉錄單元：功效上親密有關的基因構成操縱子或高度集中，并且可被一起轉錄；3、有重疊基因，同一段DNA序列能攜帶兩種不同蛋白質的遺傳信息。ＤＮＡ的壓縮環(huán)節(jié)和比率：ＤＮＡ－核小體－螺線管－超螺線管－染色體。對應壓縮比為：７ｘ６ｘ４０ｘ５＝８４００第二節(jié)DNA的構造DNA的一級構造：是指4種核苷酸的排列次序，表達了該DNA分子的化學構成。又由于4種核苷酸的差別僅僅是堿基的不同，因此又是指堿基的排列次序。DNA一級構造的基本特點：1、由兩條互相平行的脫氧核苷酸鏈盤繞而成；2、兩條主鏈的脫氧核糖和磷酸由3’,5’磷酸二酯鍵交互連接而成，排在外側，構成基本骨架；堿基位于內(nèi)側；3、兩條鏈上的堿基通過氫鍵結合，形成堿基對，堿基必須以A-T、C-G配對。DNA的二級構造：是指兩條多核苷酸鏈反向平行盤繞所生成的雙螺旋構造。DNA的高級構造：是指DNA雙螺旋進一步扭曲盤繞所形成的特定空間構造。超螺旋的生物學意義：①超螺旋可形成高度致密狀態(tài)，從而得以容納于有限的空間內(nèi)。②活體中，DNA的構象是動態(tài)的。B-DNA是一種穩(wěn)定構造，引入負超螺旋可提高其能量水平，影響DNA構造變化。如有助于在特定區(qū)域的構造轉化、使DNA雙鏈分開等。DNA拓撲異構酶：1、功效：催化DNA分子拓撲異構體之間的互相轉化。2、作用機制：切開磷酸二酯鍵，在主鏈上造成切口，通過變化連接數(shù)（L）來變化超螺旋狀態(tài)。3、分類：I型拓撲異構酶：每次切開一股鏈。II型拓撲異構酶：每次切開雙股鏈。既可消除負超螺旋，又可消除正超螺旋。需要ATP，使分子L值每次變化±2。正超螺旋（positivesupercoil）：由于雙鏈緊纏而引發(fā)的超螺旋。負超螺旋（negaivesupercoil）：由于雙鏈松纏而引發(fā)的超螺旋。兩種超螺旋的自由能均高于松弛狀態(tài)。天然原核生物DNA都呈負超螺旋；③在體外可形成正超螺旋，如加入溴乙錠，可引入正超螺旋。第三節(jié)DNA的復制半保存復制：每個子代分子的一條鏈來自親代DNA,另一條則是新合成的，這種復制方式稱為DNA的半保存復制。對一種生物體而言，復制的起點是固定的，復制叉移動的方向和速度以雙向等速為主。半不持續(xù)復制：DNA在復制時，其中一條新生鏈是持續(xù)合成的，而另一條新生鏈的合成是不持續(xù)，稱為DNA合成的半不持續(xù)復制。前導鏈：隨著親本雙鏈體的解開而持續(xù)進行復制的鏈，稱為前導鏈。后隨鏈：一段親本DNA單鏈首先暴露出來，然后以與復制叉移動相反的方向、按照5’→3岡崎片段：后隨鏈不持續(xù)合成形成的短DNA片段。復制叉：正在進行復制的復制起點呈現(xiàn)叉子的形式，稱為復制叉。復制眼：DNA復制的部分看上去象一只眼睛，稱為復制眼。復制子：生物體的復制單位稱為復制子。DNA復制的幾個方式：線性DNA雙鏈的復制（1）將線性DNA分子轉變?yōu)榄h(huán)狀或多聚分子（末端簡并性是前提條件，如T4噬菌體）；（2）DNA末端發(fā)夾構造的形成，如（草履蟲的線性線粒體）；（3）在某種蛋白的介入下，在真正的末端起始復制，（如Φ29噬菌體和腺病毒DNA）；環(huán)狀DNA雙鏈（1）θ型，如大腸桿菌質粒DNA的復制；（2）滾環(huán)型復制如：ΦX174在原點割切，共價延伸，切下被替代的單鏈；（3）D-環(huán)形，如動物線粒體DNA的復制。實驗驗證DNA半保存復制的辦法：原理，母鏈中的全部置換為N15，然后讓E.coli在僅含有N14的培養(yǎng)基上進行復制。具體環(huán)節(jié)：1、將大腸桿菌在僅含有15N做氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到15N-DNA，同時在含有14N的培養(yǎng)基中培養(yǎng)同種的大腸桿菌作為對照，取少量大腸桿菌細胞破碎在采用氯化銫密度梯度離心標記兩種不同的DNA形成的位置區(qū)帶2、將雙鏈都是15N標記的DNA的大腸桿菌轉移到僅含有14N做氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，取出培養(yǎng)的大腸桿菌破碎進行離心，可得到離心區(qū)帶在14N和15N的中間部位原核生物DNA的復制DNA雙螺旋的解旋在拓撲異構酶I的作用下解開負超螺旋在解鏈酶共同作用，在復制起點處解開雙鏈局部解開雙鏈，就必須有單鏈結合蛋白(SSB)來穩(wěn)定解開的單鏈，以確保核苷酸局部不會恢復成雙鏈接著由引發(fā)酶等構成的引發(fā)體作用于兩條單鏈DNA上。DNA解旋過程中需要的酶有：拓撲異構酶Ⅰ，解鏈酶，單鏈結合蛋白（SSB）DNA解旋過程中需要的多個酶：a、DNA解鏈酶，大部分解鏈酶沿后隨鏈模板的5′→3′方向并隨著復制叉的邁進而移動；Rep蛋白是沿前導鏈模板的3′→5′方向移動。b、單鏈結合蛋白（SSB），作用是確保被解鏈酶解開的單鏈在復制完畢前保持單鏈構造。其并沒有解鏈作用c、DNA拓撲異構酶，在DNA復制過程中形成正超螺旋，拓撲異構酶能夠消除解鏈造成正超螺旋的堆積，消除妨礙解鏈進行的壓力，使復制繼續(xù)進行。DNA復制的引發(fā)先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物由DNA聚合酶從RNA引物3，端開始合成新的DNA鏈。后隨鏈的引發(fā)過程由引發(fā)體來完畢，引發(fā)體由6種蛋白質n、n‘、n‘‘、DnaB、C和I共同構成，6種蛋白質合在一起形成引發(fā)前體，引發(fā)前體與引發(fā)酶進一步組裝成引發(fā)體才干發(fā)揮其功效。引發(fā)酶是dnaG基因的產(chǎn)物，是在特定條件下發(fā)揮作用的RNA聚合酶，僅用于合成DNA復制所需的一小段RNA。DNA的引發(fā)過程中需要的酶：引發(fā)酶，DNA聚合酶，RnaseⅠ，DNA連接酶DNA復制的終止：當復制叉碰到約22個堿基的重復性終止子序列（Ter)時，Tus-Ter復合物能使DnaB不再將DNA解鏈，阻擋復制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復制叉達成后停止復制。原核生物復制的特點：①只有一種復制原點，而真核生物能夠有多個②在原核生物的復制原點處含有串聯(lián)重復序列，其中富含A-T堿基原核生物DNA聚合酶的比較性質聚合酶I聚合酶II聚合酶III3’-5’＋＋＋5’-3’＋——新生鏈合成——＋生物學活性10.0515DNA聚合酶Ⅰ含有兩個區(qū)域，一種為Klenow片段同時含有DNA聚合酶的活性和3’-5’DNA聚合酶II：具DNA聚合酶活性，但活力很低；具3’DNA聚合酶III：具DNA聚合酶活性，活力較強；具3’真核生物DNA的復制真核生物DNA聚合酶的比較（有：“—”，無：“＋”）性質DNA聚合酶αDNA聚合酶βDNA聚合酶γDNA聚合酶δDNA聚合酶ε亞基數(shù)4122～3≥1在細胞內(nèi)分布核內(nèi)核內(nèi)線粒體核內(nèi)核內(nèi)功效DNA引物合成損傷修復線粒體DNA復制重要DNA復制酶復制修復3’-5’外切無無有有有5’-3’外切無無無無無真核生物DNA的復制的特點：1、真核生物每條染色體上能夠有多處復制起始點。2、真核生物DNA的復制普通為雙向移動。3、真核生物的染色體在全部完畢復制之前，各個起始點上DNA的復制不能再開始。自主復制序列（ARS）特點：真核生物DNA復制的起點，含有一種A區(qū)，該區(qū)含有11個A-T堿基對的保守序列。真核生物DNA復制的起始需要起始點識別復合物（originrecognitioncomplex,ORC)結合于ARS，ORC是由6種蛋白質構成的啟動復合物。復制子工作的頻率：1、在任意時刻，普通只有少數(shù)（<15%）復制子工作。2、只有一部分用于起始復制，另有一部分有時使用。復制子的長度不是固定不變的真核生物DNA聚合酶的分類和功效：DNA聚合酶α，重要功效是引物的合成，且具體有引發(fā)和延伸鏈的雙重功效；NDA聚合酶β，活性水平穩(wěn)定，重要在DNA損傷的修復中起作用屬于高忠實性修復酶；DNA聚合酶δ是重要負責DNA復制的酶參加前導鏈和后隨鏈的合成；DNA聚合酶ε與后隨鏈的合成有關，在DNA合成過程中核苷酸切除以及堿基的切除修復中起重要作用，另外它在細胞的重組過程中起作用；DNA聚合酶γ在線粒體DNA復制中起作用第四節(jié)DNA的修復錯配修復：又稱甲基指導的錯配修復，是按模板的遺傳信息來修復錯配堿基的，修復時先要分辨模板鏈和復制鏈。這是通過堿基的甲基化來實現(xiàn)的。切除修復有兩種：1、堿基切除修復。（切除堿基）2、核苷酸切除修復。（破壞磷酸糖苷鍵）AP位點：在DNA修復過程中糖苷水解酶水解結合在五碳糖上的堿基在DNA鏈上形成的去嘌呤或去嘧啶的位點稱為AP位點。重組修復：機體細胞對在起始復制潮流未修復的DNA損傷部位能夠先復制再修復。原理：先從同源DNA母鏈上將對應核苷酸序列片段移至子鏈缺口，然后再用新合成的序列補上母鏈缺口。DNA的直接修復：在DNA光解酶的作用下把在光下或經(jīng)紫外線照射形成的環(huán)丁烷胸腺嘧啶二體和6-4光化物還原成為單體得過程。SOS反映：是細胞DNA受到損傷或復制系統(tǒng)受到克制的緊急狀況下，細胞為求生存而產(chǎn)生的一種應急方法。重要涉及：（1）DNA的修復；（2）產(chǎn)生變異。第五節(jié)DNA的轉座DNA的轉座：又稱移位，是由可移位因子介導的遺傳物質重排現(xiàn)象。轉座子：存在與染色體DNA上可自主復制和移位的基本單位。轉座子的分類：1、插入序列(IS因子)：插入序列是最簡樸的轉座子，不含有任何宿主基因，是細菌染色體和質粒DNA的正常構成部分。2、復合型轉座子：含有IS模塊，其它基因位于中央?yún)^(qū)；是一類帶有某些抗藥性基因或其它宿主基因的轉座子，其兩翼往往是兩個相似或高度同源的IS序列。3、TnA家族轉座子：復合轉座子，較大（～5kb），無IS類型元件。IS因子的普通構造：a、長度較小(約1kb)；b、含有編碼本身移動的酶--轉座酶（transposase）；c、含一對反向末端重復序列（invertedterminalrepeats）；d、在靶位點產(chǎn)生一正向重復序列。轉座的類型：1復制型轉座：轉入新位點的是原先元件的拷貝，即轉座子作為可移動的元件被復制，2、非復制型轉座：座子作為一種物理實體從供體的一種位點轉移到受體的一種位點；這種方式會在供體分子處留下一種裂口。轉座子的遺傳效應：1、引發(fā)插入突變。2、插入位點出現(xiàn)新基因。3、引發(fā)染色體畸變轉座增進重排。4、引發(fā)生物進化。真核生物的轉座子：1、玉米中的控制因子沒有固定的染色體定位。2、果蠅中的P轉座子自主性因子：含有自主剪接和轉座能力，可持續(xù)移動，造成的成果不穩(wěn)定。非自主性因子：不能自發(fā)轉座，只有在基因組中存在同一家族的自主元件時，才干發(fā)生轉座而變得不穩(wěn)定?！铩铩锏谌律镄畔鬟f（上）——從DNA到RNA基因的體現(xiàn)：涉及轉錄和翻譯兩個階段，其中轉錄是基因體現(xiàn)的核心環(huán)節(jié)，翻譯是基因體現(xiàn)的最后目的。轉錄：以DNA單鏈為模板，NTP為原料，在依賴DNA的RNA聚合酶催化下合成RNA鏈的過程。模板鏈：或反義鏈，作為模板，按堿基互補配對原則轉錄成RNA的DNA鏈。編碼鏈：或故意義鏈，與模板鏈互補的非模板鏈，其編碼區(qū)的堿基序列與轉錄產(chǎn)物mRNA的序列相似（僅T、U交換）。第一節(jié)RNA轉錄的基本過程RNA轉錄的基本過程：模板識別，轉錄起始，通過啟動子，轉錄延伸，轉錄終止。模板識別：RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈互相作用并與之相結合的過程。轉錄的起始：全酶-啟動子形成閉合二重復合體；閉合復合體轉變?yōu)殚_放復合體；整合進最初兩個核苷酸，形成一種磷酸二酯鍵，形成三重復合體。通過啟動子：在酶不需要移動時，即可加入9個核苷酸，但在加入核苷酸過程中，隨時可能釋放RNA；起始成功后，釋放出σ因子。真核生物有三種RNA聚合酶，分別催化不同RNA的合成，每種酶的作用均需某些蛋白輔助因子的參加，將這些因子稱為轉錄因子。轉錄延伸：RNA聚合酶釋放σ因子離啟動動子后，核心酶沿模板DNA鏈移動并使新生RNA鏈不停伸長的過程。轉錄的終止：RNA聚合酶和RNA鏈從模板上釋放，DNA恢復成雙鏈狀態(tài)。轉錄因子TFs：真核生物轉錄起始過程中，除RNA聚合酶之外的其它輔助因子統(tǒng)稱為轉錄因子。TFs協(xié)助RNA聚合酶識別啟動子。TFs(轉錄因子）必須先與DNA形成復合物，協(xié)助RNA聚合酶定位到轉錄起始的位點。RNA聚合酶和轉錄因子在DNA上的定位形成前起始復合物，由于轉錄因子的作用復合物由封閉型轉換成開放型。第二節(jié)轉錄機器的重要成分RNA聚合酶：RNA聚合酶重要以雙鏈DNA為模板；RNA聚合酶是轉錄過程中最核心的酶；每個細胞中約有7000個RNA聚合酶；任何時候大概2000~2500個核心酶執(zhí)行轉錄功效。原核生物RNA聚合酶：由2個α亞基、一種β亞基、一種β′亞基和一種ω亞基構成核心酶，加上一種σ亞基構成聚合酶全酶。α亞基可能與核心酶的組裝及啟動子識別有關。β亞基和β′亞基共同形成RNA合成的活性中心。σ亞基存在多個σ因子，σ因子負責模板鏈的選擇和轉錄的起始。σ因子識別起始點，延伸過程只需要核心酶的催化真核生物RNA聚合酶：分三類1、RNA聚合酶I：轉錄產(chǎn)物是45SrRNA，經(jīng)介紹修飾后生成除了5SrRNA外的多個rRNA。2、RNA聚合酶II：在核內(nèi)轉錄生成hnRNA，經(jīng)剪接加工后生成成熟mRNA被運輸?shù)郊毎|中作為蛋白質合成的模板。3、RNA聚合酶III：轉錄產(chǎn)物是tRNA，5SrRNA，snRNA；其中snRNA參加RNA的剪接。酶細胞內(nèi)定位轉錄產(chǎn)物相對活性對α-鵝膏蕈堿的敏感程度RNA聚合酶I核仁rRNA50％～70％不敏感RNA聚合酶II核質hnRNA20％～40％敏感RNA聚合酶III核質tRNA約10％存在物種特異性轉錄復合物：分為閉合二重復合體、開放二重復合體、三重復合體、轉錄延伸復合物。DNA轉錄循環(huán)理論：1、NTP彌補了開放的底物位點，并在活性位點形成磷脂鍵。2、處在聚合酶中心的核酸發(fā)生位移，其是連接區(qū)α螺旋構造由筆直變?yōu)閺澢倩謴统蔀楣P直狀態(tài)，為下一輪RNA的合成留出了空的底物位點。課本P74第三節(jié)啟動子與轉錄的起始RNA聚合酶與啟動子的互相作用重要涉及：啟動子的識別，酶與啟動子的結合，σ因子的結合與解離。啟動子：是一段位于構造基因5’端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA精確地結合并含有轉錄起始的特異性。轉錄單元：是一段從啟動子開始到終止子結束的DNA序列，RNA聚合酶從轉錄起始位點開始沿著模板邁進，直到終止子為止，轉錄出一條RNA鏈。轉錄起始位點：是指與新生RNA鏈第一種核苷酸相對應DNA鏈上的堿基，研究證明普通為一種嘌呤。★原核生物啟動子特性：①起點普通是一種嘌呤。②起點上游10bp處，有一約6bp的保守區(qū)域，稱為-10區(qū)（也叫PribnowBox），共有序列為：TATAA。③起點上游35bp處，有一約6bp的保守區(qū)，稱為-35區(qū)，共有序列為：TTGACA。④90%的啟動子中，-10與-35區(qū)的距離在16-19bp之間；兩個保守區(qū)之間的序列并不重要，但距離很核心?！镎婧松锘蛑袉幼犹匦裕孩賂ATAbox：位于RNA聚合酶II轉錄起點上游約-35~-25bp處的共同序列TATAAA，絕大多數(shù)狀況下全部是A-T堿基對，只有少數(shù)含有G-C。②CAATbox：在起點上游-78~-70bp處尚有另一段共有序列CCAAT，稱為CAAT區(qū)。③GCbox：在起點上游-110~-80bp處有一段富含GC堿基對的序列（GCCACACCC或GGGCGGG），稱為GC區(qū)。④增強子：能強化轉錄起始頻率的DNA序列。*(記得補充第八章真核生物轉錄的調控處)真核生物啟動子對轉錄的影響：①TATAbox是核心啟動子，控制轉錄的精確開始，②CAATbox上游啟動子控制轉錄起始的頻率增強子的特點：（1）遠距離作用；（2）無方向性；（3）順式調節(jié)；（4）無物種和基因的特異性；（5）含有組織特異性；（6）有相位性；（7）有的增強子可對外部產(chǎn)生信號。RNA聚合酶對啟動子的識別是通過與堿基上的氫鍵供體和受體在一定距離內(nèi)互補，形成氫鍵而實現(xiàn)的啟動子突變:下降突變：減少其構造基因轉錄水平的啟動子突變，稱為下降突變。上升突變：提高其構造基因轉錄水平的啟動子突變，稱為上升突變。第四節(jié)原核生物與真核生物mRNA特性的比較原核生物mRNA的特性：a、半衰期短；b、許多mRNA以多順反子的形式存在；c、無帽子和尾巴構造SD序列：原核生物起始密碼AUG上游7~12個核苷酸處的6個核苷酸的保守序列，被認為在核糖體-mRNA結合過程中起作用。真核生物mRNA的特性：a、mRNA的5’端存在“帽子”構造；b、3操縱子:一組相鄰或互相重疊的基因,在基因轉錄時協(xié)同作用，這樣一組基因稱為操縱子?；虻姆肿由飳W定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功效RNA所必需的全部核苷酸序列。帽子構造的作用:1、提高mRNA的活性及穩(wěn)定性；2、可能是蛋白質合成起始信號的一部分。第五節(jié)終止與抗終止不依賴于ρ因子的終止合成的RNA尾部的序列（終止子）的特性：1、二重對稱的序列形成發(fā)卡構造；在發(fā)卡構造的莖基部富含G-C對；發(fā)卡構造可減緩或暫停合成。2、尾部有約4~8個持續(xù)的U；持續(xù)的A-U對使雜交鏈更容易分離。依賴于ρ因子的終止ρ因子是由rho基因編碼，分子量為55KDa的蛋白質，其活性形式為六聚體，在離體條件下有兩種活性，一種是解螺旋酶的活性，另一種是NTP酶的活性。ρ因子可結合于自由RNA鏈，并沿RNA鏈移動。結合在正在合成的RNA鏈的5’端，運用水解NTP釋放的能量，從5’端向3’端移動，當RNA聚合酶移動到終止子而暫停時，ρ因子達成RNA的3第六節(jié)內(nèi)含子的剪切、編輯及化學修釋不持續(xù)基因：真核生物基因除了與mRNA相對應的編碼序列外，還含有某些不編碼序列插在編碼序列之間，這些不編碼序列在加工為成熟的mRNA時被去除，這樣的基因稱為不持續(xù)基因或斷裂基因。外顯子：基因中與mRNA一致的序列，即編碼序列。一種基因總是以外顯子為起點和終點。內(nèi)含子：基因中編碼序列之間的介入序列，在原初轉錄物加工為mRNA時被去除，即非編碼序列。真核生物RNA中的內(nèi)含子構造的特點：①GU表達供體銜接點的5′端，AG代表接納體銜接點的3′端，把這種保守序列模式成為GU-AG法則。②5′端有一保守序列（5′-GUPuAGU-3′）。③3′端剪接位點AG的附近有一段富含嘧啶的區(qū)域，含有10~20個嘧啶核苷酸。④3′端上游18~50個核苷酸處，存在一種序列為Py80NPy87Pu75APy96的保守區(qū)。剪接體的組裝和剪接過程：①、U1結合在5’剪切位點。②、U2AF結合在多嘧啶區(qū)。③、U2結合在分支點，形成剪接前體進一步與U4、U5、U6三聚體結合，形成60S剪接體。④、U1釋放，U5從內(nèi)含子區(qū)移到外顯子區(qū)，U6結合在5’剪切位點。⑤、U4釋放，U6/U2催化5’剪切，U5結合在3’剪切位點。⑥、U2/U5/U6催化構成性剪接：在高等真核生物中，內(nèi)含子普通是有序或構成性地從mRNA前體中被剪接，這種剪接方式稱為構成性剪接。變位剪接：又叫選擇性剪接，指在剪接過程中能夠有選擇性地越過某些外顯子或某個剪接位點進行變位剪接，產(chǎn)生出不同mRNA，這種剪接方式稱為變位剪接。自我剪切的RNA：①、I類內(nèi)含子：剪接重要是轉脂反映，即剪接反映事實上是發(fā)生了兩次磷酸二脂鍵的轉移。②、Ⅱ類內(nèi)含子：剪接重要存在于真核生物的線粒體和葉綠體rRNA基因中。RNA的編輯：指某些RNA，特別是在mRNA中插入、刪除或取代某些核苷酸殘基，造成DNA所編碼遺傳信息的變化，從而翻譯出多個氨基酸序列不同的蛋白質。成果使成熟mRNA的核苷酸序列不同于前體，也不同于DNA模板，使遺傳信息在mRNA水平上發(fā)生變化。介導RNA編輯的機制有兩種：a、脫氨基作用（載脂蛋白mRNA的編輯）b、引導RNA指導的尿嘧啶插入或刪除（尿苷酸的缺失和添加）指導RNA：指導RNA編輯的小分子RNA，又稱向導RNA。長度大概是60~80個核苷酸，中間有一段與被編輯mRNA相稱程度互補的序列。指導RNA上存在某些未能配對的腺嘌呤，形成缺口，為插入尿嘧啶提供了模板。RNA編輯的生物學意義：（1）校正作用；（2）調控翻譯；（3）擴充遺傳信息。RNA的化學修飾含有位點特異性。途徑涉及：甲基化，去氨基化，硫代，堿基的同分異構化，二價鍵的飽和化，核苷酸的替代。核酶：是指一類含有催化功效的RNA分子，通過催化靶位點RNA鏈中磷酸二酯鍵的斷裂，特異性地剪切底物RNA分子，從而阻斷基因的體現(xiàn)。核酶的分類：根據(jù)催化功效可分為：剪切型核酶，剪接型核酶。核酶的成果特點：核酶的二級成果為錘頭構造。由三個莖構成，莖區(qū)是由互補堿基構成的局部雙鏈構造，包圍著一種由11~13個保守核苷酸構成的催化之心。核酶剪切普通發(fā)生在H位點?！铩铩锏谒恼律镄畔⒌膫鬟f（下）——從mRNA到蛋白質蛋白質的生物合成環(huán)節(jié)：(1)翻譯的起始：核糖體與mRNA結合并與氨酰-tRNA生成起始復合物。(2)肽鏈的延伸：由于核糖體沿mRNA5’端向3’端移動，開始了從N端向C端的多肽合成，這是蛋白質合成過程中速度最快的階段。(3)肽鏈的終止及釋放：核糖體從mRNA上解離，準備新一輪合成反映。核糖體是蛋白質合成的場合。mRNA是蛋白質合成的模板。轉移RNA是模板與氨基酸之間的接合體。在合成的各個階段有許多蛋白質、酶和其它生物大分子參加。翻譯：是指將mRNA鏈上的核苷酸從一種特定的起始位點開始，按每3個核苷酸代表一種氨基酸的原則，依次合成一條多肽鏈的過程。第一節(jié)遺傳密碼——三聯(lián)子遺傳密碼的破譯：1954，Gamov提出遺傳密碼的問題,43=64；1961，Brenner&Crick：加入或減少1個或2個核苷酸即可造成形成不正常的蛋白質；但加入或減少3個經(jīng)常對蛋白質活性影響不大。1961，Nirenberg：人工合成多聚尿嘧啶核苷酸指導合成的多肽只含一種氨基酸--苯丙氨酸；1964，Nirenberg：tRNA結正當。特異的氨酰-tRNA可與核糖體-mRNA結合。mRNA可短至3個堿基。密碼：也叫三聯(lián)子密碼，mRNA上代表一種氨基酸或蛋白質合成及終止信號的核苷酸三聯(lián)體?！镞z傳密碼的特點：1、密碼的持續(xù)性。2、密碼的簡并性。3、密碼的通用性與特殊性。4、密碼子與反密碼子的互相作用。密碼子與反密碼子的互相作用機制：搖晃假說，1）mRNA上密碼子第一、二堿基與tRNA上反密碼子對應堿基形成強配對；密碼專一性重要是由于這兩個堿基的作用。2）反密碼子的第一種堿基決定一種tRNA能夠解讀密碼子的數(shù)目。3）當一種氨基酸的幾個密碼子中，有頭2個堿基中任一種是不同的，則必須有不同的tRNA。閱讀框：讀取由一系列三聯(lián)體構成序列的三種可能方式之一?？勺g框架：又叫可讀框，指由起始密碼子開始，到終止密碼子結束的核苷酸序列。簡并：一種氨基酸由多個密碼子編碼的現(xiàn)象，稱為簡并。同義密碼子：對應同一種氨基酸的密碼子稱為同義密碼子。★起始密碼子：密碼子AUG與N-甲酰甲硫氨酸-tRNA（tRNAfMet）結合，在原核生物中啟動蛋白質結合，因此AUG被稱為起始密碼子?！锝K止密碼子：UAA、UAG、UGA；終止密碼子不編碼任何氨基酸，也稱為無義密碼子。第二節(jié)tRNAtRNA的共同特性：1、存在通過修飾的特殊堿基。2、3'端均為CCA-OH。★tRNA的構造：①二級構造：三葉草形。tRNA上的手臂：（1）受體臂：鏈兩端堿基序列互補形成的桿狀構造；3’端有未配對的3～4個堿基；3’端的CCA，最后一種堿基2‘自由羥基可被氨?；?。（2）TψC臂（環(huán)）其中ψ表達擬尿嘧啶，是tRNA分子所擁有的不常見核苷酸。（3）反密碼臂（環(huán)）位于套索中央有三聯(lián)反密碼子。（4）D臂（環(huán)）含有二氫尿嘧啶。（5）多出臂（環(huán)）。②tRNA三級構造：tRNA折疊為L形，與氨基酸結合的受體臂與反密碼環(huán)互相遠離，分別位于兩端；不同的tRNA形狀大致相似又有所差別。★tRNA的功效：tRNA在蛋白質合成中為每個三聯(lián)密碼子翻譯成氨基酸提供了接合體，為精確無誤地將所需氨基酸運輸?shù)胶颂求w上提供了運輸載體，它又被稱為第二遺傳密碼。每個tRNA與一特定的氨基酸特異共價結合生成有蛋白質合成活性的AA-tRNA（氨酰-tRNA）；含有一種三核苷酸序列的反密碼子，與mRNA上代表該氨基酸的密碼子互相識別并配對。密碼子的識別僅決定于反密碼子，而與氨基酸無關。tRNA的種類：1、起始tRNA和延伸tRNA：特異地識別mRNA模板上起始密碼子的tRNA叫起始tRNA，其它tRNA統(tǒng)稱為延伸tRNA。2、同工tRNA：代表相似氨基酸的不同tRNA。3、校正tRNA：通過反密碼子區(qū)的變化把對的的氨基酸加到多肽鏈上的tRNA。無義突變：指某個核苷酸的變化使代表某個氨基酸的密碼子變成終止密碼子，使蛋白質的合成提前終止，合成無功效或無意義的多肽，這種突變稱為無義突變。錯義突變：指某個核苷酸的變化使一種氨基酸的密碼變成另一種氨基酸的密碼，這種突變稱為錯義突變。氨酰tRNA合成酶：是一類催化氨基酸與tRNA結合的特異性酶。功效是：既要識別tRNA，又要能識別氨基酸，它對兩者都含有高度的專一性。第三節(jié)核糖體★核糖體的構造：1、核糖體由大小兩個亞基構成，存在形式為核糖體、核糖體亞基、多核糖體。2、核糖體蛋白構成：核糖體上有多個活性中心，每個中心都由一組特殊的核糖體蛋白質構成。3、核糖體RNA（rRNA）：5SrRNA，16SrRNA，23SrRNA，5.8SrRNA，18SrRNA，28SrRNA。4、核糖體有3個tRNA結合位點：A位點：氨酰tRNA結合位點；P位點：肽酰tRNA結合位點；E位點：延伸過程中多肽鏈轉移到肽酰tRNA上釋放tRNA的位點?！锖颂求w的功效：1、核糖體小亞基負責對模板mRNA進行序列特異性識別，如起始部分的識別、密碼子與反密碼子的互相作用等，mRNA的結合位點也在小亞基上。2、大亞基負責攜帶AA及tRNA的功效，涉及肽鍵的形成、AA-tRNA與肽酰-tRNA的結合等。核糖體上的活性位點：mRNA結合部位、結合或接受AA-tRNA部位（A位），結合或接受肽酰-tRNA的部位（P位），肽基轉移部位及形成肽鍵的部位（轉肽酶中心）。★第四節(jié)蛋白質合成的生物學機制氨基酸的活化：氨基酸與tRNA結合形成氨酰-tRNA，反映在細胞質進行。tRNA末端最后一種堿基五碳糖3’起始因子：蛋白質合成起始階段特異地與小亞基結合的蛋白質?！镌松锏鞍踪|翻譯的起始：第一步，30S小亞基首先與翻譯起始因子IF-l，IF-3結合，通過SD序列與mRNA模板相結合。第二步，在IF-2和GTP的協(xié)助下，fMet-tRNAfMet進入小亞基的P位，tRNA上的反密碼子與mRNA上的起始密碼子配對。第三步，帶有tRNA、mRNA及3個翻譯起始因子的小亞基復合物與50S大亞基結合，GTP水解，釋放翻譯起始因子?！镎婧松锏鞍踪|翻譯的起始：第一步，Met－tRNAiMet與40S小亞基相結合；接著核糖體上專一位點識別mRNA的帽子，使mRNA與核糖體結合。第二步，帽子在mRNA與40S亞基結合過程中起穩(wěn)定作用。帶帽子的mRNA5‘端與18SrRNA的3’端序列之間存在堿基配對型互相作用。第三步，除了識別帽子構造以外，40S小亞基還能識別mRNA上的起始密碼子AUG。真核生物與原核生物翻譯起始的異同點：真核生物翻譯起始機制與原核生物基本相似，其差別是核糖體較大、起始因子較多、mRNA有m7GpppNp帽子構造、Met-tRNAMet不甲酰化，mRNA分子5’端的帽子和3’端的多聚A都參加形成翻譯起始復合物。肽鏈的延伸：1、后續(xù)AA-tRNA與核糖體結合。2、肽鍵的形成。3、核糖體的移位。延伸因子：是指在蛋白質合成中，每向肽鏈中加入一種氨基酸時，與核糖體周期性結合的蛋白質分子。EF-Tu：協(xié)助氨酰-tRNA進入A位點；EF-Ts：使EF-Tu恢復活性；EF-G：參加核糖體移位。肽鏈的終止：肽鏈在延伸過程中，當終止密碼子出現(xiàn)在核糖體的A位時，釋放因子能識別終止密碼子并與之結合，水解P位上多肽鏈與tRNA之間的酯鍵。新生的肽鏈和tRNA從核糖體上釋放，核糖體解體，蛋白質合成結束。蛋白質前體的加工：1．N端fMet或Met的切除：細菌蛋白質N端的甲酰基能被脫甲?；杆?，原核生物和真核生物N端的甲硫氨酸在多肽鏈合成完畢之前被切除。2．二硫鍵的形成：二硫鍵是蛋白質合成后通過兩個半胱氨酸的氧化作用生成的。3．特定氨基酸的修飾：氨基酸側鏈的修飾涉及磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化和羧基化等。4、切除新生鏈中非功效片段。蛋白質的折疊：是指從多肽氨基酸序列形成含有對的三維空間構造的蛋白質。分子伴侶：是介導新生肽鏈對的組裝，成為成熟蛋白質，而本身卻不是最后功效蛋白構成成分之一的蛋白質分子。熱休克蛋白：是一類應激反映性蛋白，涉及HSP70、HSP40和GrpE家族，廣泛存在于原核和真核細胞中。三者協(xié)同作用，促使某些能自發(fā)折疊的蛋白折疊整天然構象。伴侶素：涉及HSP60和HSP10，重要為非自發(fā)性折疊蛋白提供能折疊整天然構象的環(huán)境。蛋白質合成的克制劑：（克制途徑）制止mRNA與核糖體結合（氯霉素）；制止AA-tRNA與核糖體結合（四環(huán)素）；干擾AA-tRNA與核糖體產(chǎn)生錯讀（鏈霉素）；作為競爭性克制劑克制蛋白質合成（白喉毒素與EF2結合，克制肽鏈的移位）。第五節(jié)蛋白質的轉運機制蛋白轉運：指蛋白插入或穿過膜的過程。翻譯后轉運機制：若蛋白質是在胞質中的核糖體上合成、釋放后再過膜轉移，這種蛋白質過膜方式稱為翻譯后轉運。翻譯-轉運同時機制：若在與內(nèi)質網(wǎng)結合的核糖體上合成的蛋白質前體，其合成和過膜轉移是同時發(fā)生的，這種蛋白質的過膜方式稱為翻譯-轉運同時機制。兩種轉運的共同特性:N端序列在移位過程中被切除；2、N端序列構成一成熟蛋白質沒有的前導序列，含有前導序列的蛋白稱為前體蛋白。前導肽的特性:1、富含帶正電荷的堿性氨基酸，且分布在不帶電荷的氨基酸之間；2、缺少帶負電荷的酸性氨基酸；3、羥基氨基酸含量較高；4、有形成兩親（現(xiàn)有親水又有疏水部分）α螺旋構造的能力。翻譯-轉運同時機制蛋白質的合成環(huán)節(jié)：核糖體在自由mRNA上起始合成蛋白質；信號識別顆粒（signalrecognitionparticle,SRP）結合于前導序列，翻譯暫停；SRP與SRP受體結合，核糖體附著在膜上；翻譯繼續(xù)；前導序列進入膜；蛋白穿過膜，前導序列被切除；翻譯繼續(xù)；蛋白通過膜被分泌；核糖體從mRNA上釋放。翻譯后轉運蛋白質由有利核糖體合成，去向：線粒體、葉綠體等細胞器，細胞質蛋白，細胞核蛋白第五章分子生物學研究法（上）——DNA、RNA及蛋白質操作技術第一節(jié)重組DNA技術回想上世紀分子生物學研究獲得的三大成就：第一，在20世紀40年代擬定了遺傳信息的攜帶者：即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；第二，50年代提出了DNA分子的雙螺旋構造模型和半保存復制機制，解決了基因的自我復制和世代交替問題；第三，50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學說，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動與體現(xiàn)機制。重組DNA技術：是應用酶學辦法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適宜的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代DNA分子的過程。重組DNA技術使用的工具酶：1、限制性內(nèi)切酶：一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。分為：I型、II型、Ⅲ型。其中類型I：識別的DNA序列長約十幾個bp；酶切位點在距識別位點1kb左右處隨機切割，非特異性；復合酶，無使用價值。類型II：識別位點和酶切位點一致，具特異性。單體酶，性質穩(wěn)定，Mg2+為輔助因子?，F(xiàn)在已分離了數(shù)百種。2、DNA連接酶：將兩段DNA片段連接起來的酶稱為DNA連接酶。類型Ⅲ：酶切位點在識別位點下游24-26bp處，非特異性。限制性內(nèi)切酶II型的基本特性：(1)識別dsDNA分子中4～8bp的特定序列；(2)大部分酶的切割位點在識別序列內(nèi)部或兩側；(3)識別切割序列呈典型的旋轉對稱型回文構造。限制性內(nèi)切酶切割雙鏈DNA分子可產(chǎn)生粘性末端（切口上兩條鏈上的堿基不互補配對）和平末端（切口上兩條鏈上的堿基都互補配對），重組DNA技術中運用粘性末端?？寺∮幂d體：是指含有自我復制能力的DNA分子。常見的分子克隆載體有：病毒、噬菌體、質粒?？寺∮幂d體的選擇條件：1、含有復制原點，能夠自我復制。2、含有適合的酶切位點，且不在原點。3、含有篩選指標：對抗菌素的抗性和基因產(chǎn)物的顯色反映。載體的功效：運輸外源基因高效轉入受體細胞；為外源基因提供復制能力或整合能力；為外源基因的擴增或體現(xiàn)提供必要的條件。第二節(jié)DNA基本操作技術核酸的凝膠電泳基本原理：帶有負電荷的DNA或RNA核苷酸鏈，依靠無反映活性的穩(wěn)定的介質（瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠）和緩沖液，在電場中以一定的遷移率從負極移向正極。根據(jù)核酸分子大小不同、構型的差別，以及所帶電荷的不同，能夠通過電泳將其混合物中的不同成分彼此分開。種類：(1)按凝膠材料分:聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠電泳。(2)按電泳裝置分:水平式/瓊脂糖凝膠;豎式/聚丙烯酰胺凝膠。(3)兩種辦法比較：分離效果和分離范疇;操作難易電泳遷移率：電泳分子在電場作用下的遷移速度。與電場強度和電泳分子所帶的凈電荷成正比。影響因素：與分子的摩擦系數(shù)成反比，摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質粘度的函數(shù)。瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖是從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取的一種線性多糖聚合物。將瓊脂糖粉未加熱到溶點后凝固，便會形成良好的介質，其密度由瓊脂糖的濃度所決定。特點：分辨能力低，但應用范疇廣，合用于較大分子的分析。適于分離200bp~50kb的DNA片段。操作簡便。聚丙烯酰胺凝膠電泳：聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，由丙烯酰胺單體和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺在催化劑過硫酸銨和加速劑TEMED(四甲基乙二胺）的作用下聚合而成。聚合時，由單體丙烯酰胺聚合成鏈狀物，由交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺將鏈與鏈交聯(lián)成網(wǎng)狀，形成立體的不溶于水的凝膠。特點：分辨能力高，但應用范疇小，合用于較小分子的分析。適于分離5bp~500bp的DNA片段。操作復雜。用途：瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠慣用于小分子核酸分析。凝膠電泳的普通程序制膠點樣電泳染色觀察細菌轉化：是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株DNA而造成性狀特性發(fā)生遺傳變化的生命過程。提供轉化的DNA菌株叫供體菌株，接受轉化的DNA菌株叫受體菌株?，F(xiàn)在慣用的轉化辦法有CaCl2法(化學轉化法)和電轉化法?；蚩寺〉牟僮鳎?、從復雜的生物有機體基因組中，通過酶切消化或PCR擴增等環(huán)節(jié)，分離出帶有目的基因的DNA片段；2、在體外，將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并含有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子；3、感受態(tài)細胞的制備—氯化鈣法：第一次搖菌第二次搖菌離心收集細菌0.1MCaCl2重懸細胞,冰浴30min離心、重懸重復一次4、轉化：感受態(tài)細胞與連接產(chǎn)物輕輕混勻,冰浴30分鐘，42℃水浴熱激60–90秒，快速冰浴2分鐘加液體LB5、篩選：①根據(jù)重組載體的表型；②根據(jù)DNA限制酶的酶譜分析：③PCR反映聚合酶鏈式反映：即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的辦法。PCR特異性：即所擴增片段是由兩個人工合成的引物序列決定的。PCR反映原理：①變性：雙鏈DNA分子加熱分離成兩條單鏈DNA分子的過程變性溫度：是指雙鏈DNA分子50％發(fā)生變性時的溫度，普通為94∽95℃②退火：兩引物分別與兩條DNA的兩側序列特異性互補，形成雙鏈的過程稱為退火。退火溫度：普通在50∽65℃③延伸：在適宜條件下，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板，以4種脫氧核苷三磷酸（dNTP)為底物,在引物的誘導下，按5′→3′方向復制互補DNA的過程。延伸溫度：普通為70∽75℃，此時DNAPCR反映體系的成分：模板DNA，耐熱的DNA聚合酶，PCR反映的緩沖液（Mg2+，Tris?Cl），引物，dNTP。循環(huán)參數(shù)：溫度循環(huán)參數(shù)：變性，變性溫度，退火，退火溫度，延伸，延伸溫度時間參數(shù)：變性時間：決定于DNA的復雜性，普通選用94℃1min,因過長的高溫時間，會減少DNA退火時間：普通狀況下取30s~1min，由于引物比較短。延伸時間：根據(jù)擴增片段的長度而定，普通在1kb以內(nèi)的片段需延伸1min,更長的片段需對應延長時間。引物應滿足的條件：1、引物長度在15∽30bp之間，引物的退火溫度Tm=4(G+C)+2(A+T)。2、堿基隨機分布：避免一連串相似堿基，引物本身不應存在互補序列，兩條引物間也不應有互補性，特別是3′端。3、G+C含量：G+C含量普通為40％∽60％。4、引物3′端堿基的特異性。PCR技術的特點：第一，特異性強；第二，效率高；第三，敏捷度高。實時定量PCR技術：指運用帶熒光檢測的PCR儀對整個PCR過程中擴增DNA的累積速率繪制動態(tài)變化圖，運用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，從而測定終端產(chǎn)物的豐度。特異性的熒光探針：是把熒光化合物標記到特異性的寡核苷酸上形成熒光標記的DNA探針。通過探針與PCR產(chǎn)物特異性的結合，在PCR過程中可對產(chǎn)物實現(xiàn)實時、定量檢測。TaqMan探針：是一小段被設計成能夠與靶DNA序列中間部位結合的單鏈DNA（普通為5~50bp），并且該單鏈DNA的5’和3’端帶有短波長和長波長兩個不同熒光基團。Ct值：指PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物熒光強度初次超出設定閾值時，PCR反映所需的循環(huán)數(shù)。Ct值與模板起始濃度的關系：1、模板起始濃度越高，Ct值越小。2、Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關系?；蚪MDNA文庫構建：是指將某種生物體的全部基因組DNA用限制性內(nèi)切酶或機械力量切割成一定長度范疇的DNA片段，再與適宜的載體在體外重組并轉化對應的宿主細胞獲得的全部陽性菌落，這個群體就稱為該生物基因組文庫?；蚪MDNA文庫的類型：根據(jù)所選用的載體能夠分為：質粒文庫、噬菌體文庫、粘粒文庫、人工染色體文庫（細菌人工染色體文庫、酵母人工染色體文庫）。一種抱負的基因組DNA文庫應含有下列條件：1、重組克隆的總數(shù)不適宜過大，以減輕篩選工作的壓力。2、載體的裝載量最佳不不大于基因的長度，避免基因被分隔克隆。3、克隆與克隆之間必須存在足夠長度的重疊區(qū)域，以利克隆排序。4、克隆片段易于從載體分子上完整卸下。5、重組克隆能穩(wěn)定保存、擴增、篩選?；蚪MDNA文庫構建的程序：①載體DNA的制備；②基因組DNA的提取；③基因組DNA的部分酶切、分離與回收；④載體與外源片段的連接與轉化或侵染宿主細胞；⑤重組克隆的挑選和保存。第三節(jié)RNA基本操作技術總RNA的提取（書P.172）；mRNA的純化的原理及重要操作環(huán)節(jié)（書P.173）；cDNA的合成的原理及重要操作環(huán)節(jié)（書P.174）cDNA文庫：將某種細胞的全部mRNA通過逆轉錄合成cDNA，與載體連接，然后轉化宿主細胞，得到含全部體現(xiàn)基因的種群，稱為cDNA文庫。cDNA文庫含有組織細胞特異性。構建cDNA文庫的重要操作（書P.176）基因文庫的篩選：構建cDNA文庫的重要操作1、核酸雜交法2、PCR篩選法①設計特異性引物；②將文庫保存在多孔培養(yǎng)板上，對每個孔進行PCR擴增；③對陽性孔進行稀釋至次級孔，再對每個孔進行PCR擴增，直至鑒定出與目的基因對應的單克隆。3、免疫篩選法合用范疇：體現(xiàn)文庫；用某個基因產(chǎn)物的特異性抗體對重組克隆進行篩選。第四節(jié)SNP理論及應用SNP：中文翻譯為單核苷酸多態(tài)性，指基因組DNA序列中由于單個核苷酸的突變而引發(fā)的多態(tài)性。根據(jù)位置不同可分為：基因編碼區(qū)SNP（cSNP），基因調控區(qū)SNP（pSNP）和基因間隨機非編碼區(qū)SNP（rSNP）。cSNP又可分為同義cSNP和非同義cSNP。單倍型：位于染色體上某一區(qū)域的一組有關聯(lián)的SNP等位位點被稱作單倍型?；蚍中停菏侵高\用數(shù)據(jù)庫中已有的SNP進行特定人群的序列和發(fā)生頻率研究。檢測SNP慣用的辦法及原理：1、基因芯片技術：就是將大量探針分子固定于支持物上，根據(jù)堿基互補配對原理，與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測雜交信號的強度及分布進而獲取樣品中靶分子的數(shù)量和序列信息。工作原理：應用已知核酸序列作為靶基因與互補的探針核苷酸序列雜交，通過隨即的信號檢測進行定性與定量分析。具體操作:①將許多特定的寡核苷酸片段或cDNA基因片段作為靶基因，有規(guī)律地排列固定于支持物上；②樣品DNA/RNA通過PCR擴增、體外轉錄等技術摻入熒光標記分子或放射性同位素作為探針；③然后按堿基配對原理將兩者進行雜交;④再通過熒光或同位素檢測系統(tǒng)對芯片進行掃描，由計算機系統(tǒng)對每一探針上的信號作出比較和檢測，從而得出所需要的信息。2、Taqman技術：在反映體系中加入2種不同熒光標記的探針，這兩個探針分別與兩個等位基因完全配對。原理：1、探針設計運用了熒光共振能量轉移。2、Taq酶5'→3'外切酶的活性。3、通過不同熒光值的變化，對基因型進行分型。3、分子信標：是一種呈環(huán)狀構造的熒光標記的寡核苷酸，環(huán)狀區(qū)與靶序列特異性結合，莖干區(qū)由5~8個堿基對構成，5'端帶有熒光發(fā)生基團，3'端帶有熒光猝滅基團。4、焦磷酸測序法：是一種短片段焦磷酸測序技術，在測序引物的引導下，完畢短片段（含SNP）的測序，從而實現(xiàn)基因分型。缺點：不能檢測長片段，對于重復序列沒有方法。原理：加入1分子dNTP生產(chǎn)1分子PPi，PPi在ATP硫酸化酶的作用下與APS反映，生產(chǎn)ATP，是熒光素生產(chǎn)氧化熒光素。SNP的應用：1、人類基因單倍型圖的繪制；2、SNP與人類疾病易感基因的有關性分析；3、指導用藥與藥品設計。第五節(jié)基因克隆技術RACE技術（單邊PCR或者錨定PCR）：是一項在已知cDNA序列的基礎上克隆5′端或3′端缺失序列的技術，在很大程序上依賴于RNA連接酶連接的寡聚帽子的快速擴增。重要環(huán)節(jié)：1、獲得高質量RNA；2、去磷酸化作用；（帶帽子構造的mRNA不受影響）；3、去掉mRNA的帽子構造，加特異性RNA接頭并用RNA連接酶連接；4、以特異性寡聚dT為引物，在反轉錄酶的作用下合成第一條cDNA鏈，其涉及寡聚接頭的互補序列；5、分別以第一條cDNA鏈為模板進行RACE反映；6、純化后的PCR產(chǎn)物克隆到載體進行序列分析。第六節(jié)蛋白質組與蛋白質組學技術雙向電泳技術：是大多數(shù)蛋白質組研究中分離復雜蛋白質混合物的首選技術。能將來自于全細胞、組織或生物體中所包含的多達幾千種混合蛋白質進行分離、檢測和分析。蛋白質免疫印跡實驗原理：1、確保蛋白質解離為單個多肽亞基能與SDS結合；2、通過分離膠的篩分作用，將蛋白質多肽按分子量的大小不同得到分離；3、將蛋白質固定于膜上；4、以抗體識別待檢蛋白（抗原）。典型的印跡實驗涉及五個環(huán)節(jié)：①蛋白樣品的制備；②通過SDS分離樣品；③將電泳后凝膠上的蛋白質轉移至固體膜上，用非特異性，非反映活性分子封閉固體膜上未吸附蛋白質區(qū)域；④用固定在膜上的蛋白質作為抗原，與固定的非標記抗體結合；⑤洗去未結合的一抗，加入標記的二抗，通過顯色或放射自顯影法檢測凝膠中的蛋白質成分。MALDI-TOF（基質輔助的激光解析電離-飛行時間質譜）工作原理：1、將蛋白酶解；2、小肽段與基質混合；3、將樣品點到金屬靶表面并使之干燥結晶；4、用激光轟擊，將呈離子化氣體態(tài)的待分析物質從靶表面噴射出去；5、這些氣體達成檢測器的時間由肽段的質量和其所帶的電荷數(shù)的比值（m/z)決定。第六章分子生物學研究辦法(下)——基因功效研究技術原位雜交：是用標記的DNA或RNA為探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測體系，在組織、細胞、間期核及染色體上對核酸進行定位和相對定量研究的一種手段。普通可分為RNA原位雜交和染色體原位雜交。酵母單雜交法原理酵母雙雜交系統(tǒng)的原理RNA干擾技術的原理：RNA干擾技術運用雙鏈小RNA高效、特異性降解細胞內(nèi)同源mRNA，從而阻斷體內(nèi)靶基因體現(xiàn)，使細胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。基因芯片技術的原理：DNA芯片(DNAchip)，又稱DNA微列陣(DNAmicroarray)，是指通過微電子、微加工技術在平方厘米大小的固體介質表面構建的微型分析系統(tǒng)，以實現(xiàn)對組織細胞中DNA、蛋白質和其它生物成分的快速、高效、敏感的解決與分析。凝膠滯緩實驗：電泳遷移率變動實驗又叫凝膠阻滯實驗，是在80年代早期出現(xiàn)的用于在體外研究DNA與蛋白質互相作用的一種特殊的凝膠電泳技術。它含有簡樸、快捷等優(yōu)點，也是現(xiàn)在被選作分離純化特定DNA結合蛋白質的一種典型的實驗辦法。原理：DNA與蛋白的結合造成了電泳時遷移率的減少。噬菌體展示技術的原理：將編碼“誘餌”的DNA片段插入到噬菌體基因組，并使之與噬菌體外殼蛋白編碼基因融合。該重組噬菌體侵染宿主細菌后，復制形成大量帶有外殼蛋白的噬菌體顆粒，直接捕獲靶蛋白庫中與“誘餌”互相作用的蛋白質?！铩铩锏谄哒禄虻捏w現(xiàn)與調控（上）——原核基因體現(xiàn)調控模式蛋白質合成的類型：1、永久型：是指蛋白質的合成不受環(huán)境變化或代謝狀態(tài)的影響，始終維持在恒定水平。2、適應型或調節(jié)型：是指蛋白質的合成速度明顯地受環(huán)境的影響。第一節(jié)原核基因體現(xiàn)調控總論基因體現(xiàn)：是指DNA分子所承載的遺傳信息，通過密碼子—反密碼子系統(tǒng)，轉變成蛋白質或功效RNA分子的過程，稱為基因體現(xiàn)。基因體現(xiàn)調控:是指對基因體現(xiàn)過程的調節(jié)?；蝮w現(xiàn)調控重要體現(xiàn)在下列幾個方面：1、轉錄水平上的調控；2、mRNA加工成熟水平上的調控；3、翻譯水平上的調控。原核基因調控機制的類型：正轉錄調控：調節(jié)基因的產(chǎn)物是激活蛋白，起著提高構造基因轉錄水平的作用。負轉錄調控：調節(jié)基因的產(chǎn)物是阻遏蛋白，起著制止構造基因轉錄的作用。原核基因調控機制的特性：誘導：調節(jié)因子與效應物結合后，啟動基因的轉錄活性稱為誘導。阻遏：調節(jié)因子與效應物結合后，關閉基因的轉錄活性稱為阻遏。原核基因調節(jié)的重要特點：1、特殊代謝物對基因活性的調節(jié)。2、弱化子對基因活性的調節(jié)。3、降解物對基因活性的調節(jié)。4、細菌的應急反映（是指細菌在供應物全方面匱乏的狀況下，難以找到代用物，所作出的一種反映，協(xié)助細菌渡過難關）?？烧T導調節(jié)：是指某些基因在某些代謝物的誘導下使其活化，由原來的關閉狀態(tài)轉變?yōu)殚_放狀態(tài)。如：大腸桿菌的乳糖操縱子?？烧T導的操縱子：是某些編碼糖和氨基酸分解代謝蛋白的基因。阻遏調節(jié)：是指某些基因由于某些代謝物的積累，而使其由原來的開放狀態(tài)轉變?yōu)殛P閉狀態(tài)。如：色氨酸操縱子?？勺瓒舻牟倏v子：是某些合成多個細胞代謝過程中所必須的小分子物質。色氨酸含量和核糖體位置對弱化子構造的影響：①、當色氨酸充足時，前導序列的合成正常進行，核糖體占據(jù)1區(qū)和部分2區(qū)，2、3不能有效配對；3、4配對形成終止子的發(fā)卡構造，轉錄終止。②、當缺少色氨酸時，翻譯在雙色氨酸密碼子處中斷；核糖體僅占據(jù)1區(qū)，2、3區(qū)配對；3、4區(qū)不能形成發(fā)卡構造，轉錄繼續(xù)。弱化子：是指起轉錄終止信號的一段核苷酸序列。弱化調節(jié)的機理：細胞中某一氨基酸或嘧啶的濃度發(fā)生變化，造成氨酰–tRNA的濃度變化，核糖體在轉錄產(chǎn)物RNA上的結合位置不同，使得RNA形成特定的二級構造，最后由RNA的二級構造判斷基因能否繼續(xù)轉錄葡萄糖效應或降解物克制作用：細菌培養(yǎng)基中在葡萄糖存在的狀況下，即使加入乳糖、半乳糖等誘導物，與其對應的操縱子也不會啟動，這種現(xiàn)象稱為葡萄糖效應或降解物克制作用。葡萄糖效應作用機理：葡萄糖克制腺苷酸環(huán)化酶活性，造成環(huán)腺苷酸的合成減少，與其相結合的蛋白質（環(huán)腺苷酸受體蛋白CRP）因找不到受體而不能形成復合物。復合物結合在啟動子區(qū)域是乳糖等糖類mRNA轉錄所必需的。應急反映：是指細菌在供應物全方面匱乏的狀況下，難以找到代用物，所作出的一種反映，協(xié)助細菌渡過難關?！锏诙?jié)乳糖操縱子與負控誘導系統(tǒng)誘導物：如果某物質能促使細胞產(chǎn)生一特定的酶，該物質就叫做誘導物。輔阻遏物：如果某物質能制止細胞產(chǎn)生一特定的酶，該物質就叫做輔阻遏物。安慰誘導物：可誘導酶的合成，但不被所誘導的酶降解的物質稱為安慰誘導物。IPTG（異丙基巰基半乳糖苷）和巰甲基半乳糖苷（TMG）兩個含硫的乳糖類似物是lac基因的安慰誘導物。操縱子：一種或幾個構造基因與一種調節(jié)基因、一種操縱區(qū)構成一種操縱單元。乳糖操縱子控制模型的重要內(nèi)容：①一條多順反子mRNA編碼Z、Y、A基因；②操縱區(qū)位于啟動子與構造基因之間，不能單獨起始構造基因的體現(xiàn)；③操縱區(qū)是一小段DNA序列，是阻遏物結合位點；④操縱與啟動子部分重疊，當阻遏物與操縱區(qū)結合時，即制止RNA聚合酶起始轉錄；⑤誘導物通過與阻遏物結合，變化其三維構象，使之不能與操縱區(qū)結合，從而激發(fā)mRNA的合成。乳糖操縱子中調節(jié)基因的作用過程：lacI產(chǎn)生阻遏蛋白結合在lacO上，阻遏蛋白與lacO的結合會制止RNA聚合酶與啟動子區(qū)的正常結合，從而造成轉錄無法正常進行，構造基因不能產(chǎn)生相對應的RNA，進而不能產(chǎn)生lac分解蛋白。誘導物作用的對象是阻遏蛋白。在添加lac后，lac被異構成為葡萄糖-1,6-半乳糖，進而與阻遏蛋白結合，造成阻遏蛋白失活，從lacO上分離脫落，RNA聚合酶得以正常和啟動子區(qū)結合從而轉錄得到含有構造基因的mRNA，成果基因得以體現(xiàn)產(chǎn)生β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷透過酶和β-半乳糖苷乙?；D移酶三種酶，細胞吸取大量乳糖從而培養(yǎng)集中的乳糖被降解。本底水平的構成合成型：在非誘導的狀態(tài)下仍有少量的lacmRNA合成，這種合成被稱為本底水平的構成型合成。由于阻遏蛋白過多，與其結合的異構乳糖減少，使其恢復活性，又重新結合到操作區(qū)，使lacmRNA合成被克制。葡萄糖對lac操縱子的影響：在葡萄糖存在時，E.coli優(yōu)先運用葡萄糖；此時即使培養(yǎng)基中含有乳糖，乳糖操縱子蛋白仍然含量很低。這是通過制止乳糖操縱子體現(xiàn)來完畢的，這種效應稱為降解物克制（cataboliterepression）。另外葡萄糖對乳糖操縱子的另一種作用方面體現(xiàn)在他對cAMP的克制作用，其重要克制腺苷酸環(huán)化酶的活性，使得ATP無法通過環(huán)化作用形成cAMP造成cAMP的含量減少，從而影響cAMP-CAP的含量，而cAMP-CAP與特定的區(qū)域結合后lacoperon才干過轉錄形成mRNA，進而體現(xiàn)構造基因。lac基因產(chǎn)物數(shù)量，1：0.5：0.2不同酶的數(shù)量差別，是由于在翻譯水平上的調節(jié)。方式有二:核糖體脫離：多順反子的差別性翻譯；內(nèi)切酶作用（在lacmRNA分子內(nèi)部，a基因比z基因更易受內(nèi)切酶作用）.★第三節(jié)色氨酸操縱子與負控阻遏系統(tǒng)色氨酸操縱子:由與色氨酸合成有關的基因及其調控序列構成。當缺少色氨酸時，trp操縱子基因體現(xiàn)；當外源色氨酸含量較高時，操縱子中的基因受到阻遏。弱化作用：是指控制某些細菌操縱子轉錄終止的調節(jié)。弱化子：是指弱化所發(fā)生的終止子序列，并且這種終止是被調節(jié)的，這段序列就稱為弱化子。前導區(qū)：在trpmRNA5‘端trpE基因的起始密碼子前有一種長162bp的mRNA片段，被稱為前導區(qū)。前導肽：由前導序列指導合成的含有14個氨基酸殘基的肽稱為前導肽。前導序列構造特點：第10和11位兩個密碼子為色氨酸密碼子。轉錄的弱化作用：trp的缺少會造成細胞中的氨酰tRNAtrp的含量減少，從而造成核糖體通過兩個trp密碼子的速度慢，占據(jù)前導序列的trp1區(qū)，2區(qū)與3區(qū)配對，不能形成終止子構造，構造基因轉錄。而當trp濃度高時，前導肽中trp合成速度快，前導肽始終合成至其末端，核糖體占據(jù)1區(qū)和2區(qū)，3區(qū)與4區(qū)配對，形成終止子構造，使轉錄終止（詳見課本P251）為什么需要阻遏體系？當大量Trp存在時，阻遏系統(tǒng)起作用。阻遏物與之結合，制止先導mRNA合成。為什么需要弱化系統(tǒng)？當trp濃度低時，阻遏物從有活性變?yōu)闊o活性，速度極慢，不能很快引發(fā)trp合成。因此需要一種能快速作出反映的系統(tǒng)，以保持培養(yǎng)基中適宜的Trp水平。Trp操縱子的其它調節(jié)機制：1、大腸肝菌中共有5個基因參加色氨酸生物合成，構成色氨酸操縱子。其中trpG-D，trpC-F為融合基因，翻譯出的多肽含有雙重功效。2、有兩個啟動子，一種位于操縱子5‘，一種位于trpG-D編碼區(qū)。3、大腸肝菌色氨酸操縱子受到由色氨酸激活的負阻遏蛋白的調節(jié)作用。一旦轉錄越過前導區(qū)，開始構造基因的轉錄，又會受弱化子的調控，感受無負載的tRNATrp的變化。使轉錄機器在前導區(qū)附近停止或繼續(xù)構造基因的轉錄。第四節(jié)其它操縱子半乳糖操縱子的調控與乳糖操縱子基本相似，但稍有差別：1、雙啟動子;2、雙操縱區(qū),一種在P區(qū)上游–67～–73，另一種在構造基因galE內(nèi)部3、調節(jié)基因距離構造基因很遠；4、在有外源葡萄糖時，仍然能夠被低水平誘導。阿拉伯糖操縱子：（1）當葡萄糖水平較高、阿拉伯糖水平較低時，C蛋白與操縱區(qū)O2及araI誘導因子結合區(qū)上半?yún)^(qū)結合，形成DNA回轉構造，araBAD基因不體現(xiàn)。（2）當體系中有阿拉伯糖、無葡萄糖時，AraC與阿拉伯糖相結合，變化構象成為激活蛋白，AraC同源體分別與araO1和araI區(qū)結合。RNA聚合酶在AraC蛋白和CRP-cAMP的作用下，起始BAD基因體現(xiàn)。第五節(jié)轉錄水平上的其它調控方式第一、σ因子的調節(jié)作用：不同σ因子會選擇不同的起始點作為轉錄遠點進行轉錄；σ因子本身活性的調節(jié)；第二、組蛋白類似蛋白的調節(jié)作用：在細菌細胞中存在的用來維持DNA高級構造的非特異性DNA結合蛋白，稱為組蛋白類似蛋白。第三、轉錄調控因子的作用：轉錄調控因子：指與基因的啟動子區(qū)結合，對基因的轉錄起激活或克制作用的DNA結合蛋白稱為轉錄調控因子。第四、抗終止因子的調節(jié)作用：抗終止因子是能夠在特定位點制止轉錄終止的一類蛋白質。這種調節(jié)作用重要見于噬菌體和少數(shù)細菌中。參加大腸肝菌抗終止作用的蛋白是Nus蛋白。第七節(jié)轉錄后調控一、mRNA本身構造元件對翻譯起始的調節(jié)：AUG的識別、SD序列和mRNA的二級構造。二、mRNA穩(wěn)定性對轉錄水平的影響：一系列核酸酶用來去除無用的mRNA。三、調節(jié)蛋白的調控作用：調節(jié)蛋白的體現(xiàn)本身也受到調控。四、反義RNA的調節(jié)作用：細菌細胞中某些非編碼的小RNA，與mRNA中特定序列配對，變化所配對mRNA分子的構象，造成翻譯過程的啟動或關閉。五、稀有密碼子對翻譯的影響：使用稀有密碼子頻率較高的蛋白質，其體現(xiàn)率較低，多為調控蛋白。六、重疊基因對翻譯的影響：細菌中重疊基因的存在，確保了同一核糖體對兩個持續(xù)基因進行翻譯的暢通及數(shù)量上的一致。七、翻譯的阻遏：在Qβ噬菌體中，純化的復制酶可與外殼蛋白的翻譯起始區(qū)結合，克制蛋白質的合成。八、魔斑核苷酸水平對翻譯的影響：細菌細胞生長過程中既要合成蛋白質，又要合成rRNA。嚴緊控制型（基因型rel+)：在缺少任何一種氨基酸的培養(yǎng)基上生長時，不僅蛋白質的合成速度下降，RNA合成速度也下降。松散控制型（基因型rel-)：當氨基酸供應局限性時，蛋白質合成即使停止了，但RNA的合成速度卻沒有下降?！铩铩锏诎苏禄虻捏w現(xiàn)與調控（下）——真核基因體現(xiàn)調控普通規(guī)律原核生物基因體現(xiàn)調控的特點：原核生物是單細胞生物，環(huán)境因子往往是調控的誘導物，每個細胞對環(huán)境變化的反映都是直接和一致的。真核生物基因體現(xiàn)調控的特點：能在特定的時間，特定的細胞中激活特定的基因，從而實現(xiàn)“預定”的、有序的、不可逆轉的分化過程，并使生物的組織和器官保持正常的功效。真核基因體現(xiàn)調控根據(jù)性質分為兩種類型：1、瞬時調控或稱可逆性調控：相稱于原核細胞對環(huán)境變化所做出的反映。2、發(fā)育調控或稱不可逆調控：是真核基因調控的精髓部分，決定了真核細胞生長、分化、發(fā)育的全部進程。第一節(jié)真核生物的基因構造與轉錄活性基因家族：真核細胞中，許多功效有關的基因成套組合，稱為基因家族?；虼兀和换蚣易逯械慕M員緊密排列在一起，稱為一種基因簇。單順反子：只編碼一種蛋白質的mRNA稱為單順反子mRNA。多順反子：編碼多個蛋白質的mRNA稱為多順反子mRNA?；蚣易宸诸悾?、簡樸多基因家族：家族中的組員普通以串聯(lián)方式前后連接形成的多基因家族，稱為簡樸多基因。2、復雜多基因家族：由幾個有關的多基因構成，基因家族間由間隔序列隔開，并作為獨立的轉錄單位。3、發(fā)育調控的復雜多基因家族：血紅蛋白是全部動物體內(nèi)輸送分子氧的重要載體，由兩條a鏈和兩條b鏈構成的四聚體加上一種血紅素輔基（結合鐵原子）后形成功效性血紅蛋白。斷裂基因：真核生物基因除了與mRNA相對應的編碼序列外，還含有某些不編碼的序列插在編碼序列之間，這些非編碼序列在加工為成熟的mRNA時被去除。這樣的構造基因稱為斷裂基因。外顯子與內(nèi)含子的連接區(qū)特點：（1）內(nèi)含子兩端序列不能互補；（2）連接區(qū)序列高度保守（GT-AG法則）；構成性剪接：在高等真核生物中，內(nèi)含子普通是有序或構成性地從mRNA前體中被剪接，這種剪接方式稱為構成性剪接。選擇性剪接：又叫變位剪接，指在剪接過程中能夠有選擇性地越過某些外顯子或某個剪接位點進行變位剪接，產(chǎn)生出不同mRNA的過程，這種剪接方式稱為變位剪接。真核生物轉錄的特點：（1）相似密碼子、不同起始位點產(chǎn)生長度不同的蛋白質。（2）不同起始位點、不同讀碼次序產(chǎn)生不同蛋白質。（3）不同外顯子的使用產(chǎn)生不同蛋白質。真核生物DNA水平上的基因體現(xiàn)調控：在個體發(fā)育過程中，用來合成RNA的DNA模板也會發(fā)生規(guī)律性變化，從而控制基因體現(xiàn)和生物的發(fā)育。它涉及了基因丟失、擴增、重排和移位等方式，能夠消除或變換某些基因并變化他們的活性。調控方式與轉錄及翻譯水平的調控是不同的，由于它使基因組發(fā)生了變化。涉及：1、★“開放型”活性染色質構造對轉錄的影響：轉錄之前，染色體解旋或松弛，使自由DNA暴露，造成構造基因暴露；此時HMG蛋白結合啟動子，造成單鏈區(qū)形成，啟動子暴露，產(chǎn)生DNaseI超敏感位點，此時DNA與RNA聚合酶和其它轉錄調控因子結合。2、基因擴增。3、基因重排與變換。HMG蛋白：高速泳動族蛋白，是染色體上一類低分子量非組蛋白。染色質轉錄的動力學模型：蛋白因子能夠運用ATP水解所提供的能量，將核心組蛋白八聚體從DNA鏈中置換。基因擴增：是指基因的拷貝數(shù)專一性大量增加，使細胞在短時間內(nèi)產(chǎn)生大量的基因產(chǎn)物以滿足生長發(fā)育的需要。基因重排：將一種基因從遠離啟動子的地方移到距離很近的位點從而啟動轉錄，這種方式稱為基因重排。DNA甲基化的重要形式：5-甲基胞嘧啶(5-mC)，7-甲基鳥嘌呤(7-mG)，N6-甲基腺嘌呤(N6-mG)。（DNA甲基化能關閉某些基因的活性，去甲基化則誘導了基因的重新活化與體現(xiàn)。）CpG島：CpG普通成串出現(xiàn)在DNA上，這段序列往往被稱為CpG島。甲基化酶：日常型甲基化酶：在甲基化母鏈指導下使處在半甲基化的DNA雙鏈分子上與甲基胞嘧啶相對應的胞嘧啶甲基化。從頭合成型甲基轉移酶：催化未甲基化的CpG成為mCpG,它不需要母鏈指導，但速度很慢。DNA甲基化克制基因轉錄的機理：DNA甲基化造成某些區(qū)域DNA構象變化，從而影響了蛋白質與DNA的互相作用，克制了轉錄因子與啟動區(qū)DNA的結合效率。X染色體失活中心：在失活的片段上可能存在著一種失活中心，另一片段很可能由于缺少該核心區(qū)域而保持活性，人們將該核心區(qū)域命名為X染色體失活中心。X染色體失活的機理：（X染色體上有一種失活