膠原蛋白傳統提取方法的問題國內外重組膠原蛋白概況類人膠原蛋白研發背景膠原蛋白傳統提取方法的問題類人膠原蛋白研發背景1膠原蛋白傳統提取方式和面臨的問題[1]He|ckeT．Gelatin，Thefoodtechnologist’sfriendorfoe．InternationalFoodIngredients．2000．1，6-8．病毒隱患動物源疾病(如瘟疫、禽流感等)或人體傳染病(如病毒性肝炎和艾滋病等)病毒的傳染危險[2]排異反應異種或異體排斥反應,導致植入部位無菌性炎癥以及細胞數量和形態改變細胞毒性不溶于水，加工過程中所用的酸、堿、鹽溶劑很難脫除完全,產生細胞毒性，并降低細胞粘附性制備方法：○酸水解法○堿水解法○酶解法原料來源：豬/牛/驢/魚等動物的結締組織123膠原蛋白傳統提取方式和面臨的問題[1]He|ckeT．G2類人膠原蛋白研發背景FDA、歐盟對

動物源膠原蛋白醫學應用的限制[2][3][4]Cooperman,L.andMichaeli,D.,1984,Theimmunogenicityofinjectablecollagen.I.A1-yearprospectivestudy.JAmAcadDermatol,10:638-646.

Lee,C.H.,Singla,A.andLee,Y.,2001,Biomedicalapplicationsofcollagen.IntJPharm,221:1-22.Olsen,D.,Yang,C.L.,Bodo,M.,Chang,R.,Leigh,S.,Baez,J.,Carmichael,D.,Per?l?,M.,H?m?l?inen,E.R.,Jarvinen,M.andPolarek,J.,2003,Recombinantcollagenandgelatinfordrugdelivery.AdvDrugDelivRev,55:1547-1567.尋找一種安全、有效并具有良好生物功效的膠原蛋白類材料在組織工程、醫藥美容等領域受到越來越廣泛的關注類人膠原蛋白研發背景FDA、歐盟對動物源膠原蛋白Coope3國外重組膠原蛋白的研究現狀2000年MyllyharjuJ等人使用甲基酵母表達生產準人纖維膠原蛋白Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型[5]1998年NokelainenM等用兩種桿狀病毒轉染昆蟲細胞生產類人特異性軟骨膠原II型[6]2001年NokelainenM等使用四種人類基因報道了使用甲基酵母高水平表達I型前膠原[7]UittoJ等從人皮膚細胞體外培養中得到了Ⅰ，Ⅲ型前膠原[8]VaughnPR等在啤酒酵母中表達出了攜帶有羥基化片斷的類人Ⅲ型膠原蛋白[9]由于哺乳動物細胞和昆蟲細胞培養成本高,周期長,重組膠原蛋白表達量極低(1%左右)，培養只能限于實驗規模,不可能滿足產業化、大批量的需求[5]MyllyharjuJ，NokelainenM，Vuorela人KividkkoKI．ExpressionofrecombinanthumantypeI-IIIcollagensintheyeastpichiapastoris．BiochemSocTrans．2000．28(4)，353-7．[6]NokelainenM，TuH，Vuorela^NotbohmH，KivirikkoKI,MyllyharjuJ．High-levelproductionofhumantypeIcollagenintheyeastPichiapastoris．Yeast．2001J蚰30．18(9)．797-806．[7]NokelainenM，HelaakoskiT，MyllyharjuJ，NotbohmH，PihlajaniemiT'FietzekPP，KivirikkoKI．ExpressionandcharacterizationofrecombinanthumantypeIIcollagenswithlowandhighcontentsofhydroxylysineanditsglycosylatedforms．MatrixBi01．1998Jan．16(6)，329-38．[8]UittoJ，BoothBPolakKL．CollagenbiosynthesisbyhumanskinfibroblastsIIIsolationandfurthercharacterizationoftypeIandtypeIIIprocoUagenssynthesizedinculture．BiochimBiophysActa．1980Aug21．624(2)，545—61．[9]VaughnPR，GalanisM，RichardsKM，TebbTA，RamshawJA，WerkmeisterJA．Productionofrecombinanthydroxylatedhumantype1IIcollagenfragmentinSaccharomycescerevisiae．DNACellBi01．1998Jun．17(6)，511—8．國外重組膠原蛋白的研究現狀2000年MyllyharjuJ4中國巨子生物率先實現重組膠原蛋白規模化生產的突破在中國,西北大學的范代娣等[10,11]采用PCR(聚合酶鏈式反應)擴增，得到數段人膠原蛋白基因段，接著進行拼接重復,轉化E.coli(大腸桿菌)，并通過高密度發酵培養生產人源性膠原白，所得重組膠原蛋白表達量高達29.4%[12][10]AdaehiT.,etal.GenerationofhybridtransgenicsilkwormsthatexpressBombyxmoriProlyl-hy-droxylasea-subunitsandhumancollagensinposteriorsilkglands:Productionofcocoonsthatcontainedcollagenswithhy-droxylatedpralineresidues[J].JournalofBiotechnology2006,126(2):205~219[11]駱艷娥,范代娣,花秀夫,張兮.重組大腸桿菌高密度發酵生產類人膠原蛋白的過程研究.西北大學學報2005,35(2):180~183[12]膠原蛋白與重組膠原蛋白的研究進展陳光徐珍珍吳銘明膠科學與技術第31卷第1期2011年3月Vol.31.No.1Mar.2011.中國巨子生物率先實現重組膠原蛋白在中國,西北大學的范代娣等[5科技部對類人膠原蛋白的評價世界首創全球唯一國際領先科技部對類人膠原蛋白的評價世界首創6類人膠原蛋白的來源和制備類人膠原蛋白的創新性類人膠原蛋白的實驗研究類人膠原蛋白介紹類人膠原蛋白的來源和制備類人膠原蛋白介紹7質粒載體人膠原蛋白基因構建原始菌(不具膠原合成能力)重組菌(膠原蛋白生產菌)基因工程菌的構建反饋補料壓力脈沖饑餓脅迫定向調控高密度發酵離心除雜除雜蛋白除內毒素類人膠原蛋白蛋白質分離純化類人膠原蛋白的來源和制備質粒載體人膠原蛋白基因構建原始菌重組菌基因工程菌的構建反饋壓8類人膠原蛋白的基本生物學功能通過基因重組和生物工程技術得到的，一種水溶性高分子生物膠原蛋白在結構、特性方面與人類膠原蛋白極為相似，命名它為類人膠原蛋白具備膠原蛋白基本生物學功能：生物相容性生物吸收性細胞粘附性促新細胞形成ECM示意圖類人膠原蛋白的基本生物學功能通過基因重組和生物工程技術得到的9類人膠原蛋白的創新性無細胞毒性基因工程單細胞蛋白從根本上杜絕隱患保證醫學應用安全低排異反應無病毒隱患來源于人類基因結構最大程度相似修飾過程去除端肽溶于水沒有酸堿溶劑殘留避免影響細胞代謝類人膠原蛋白的創新性無細胞毒性基因工程單細胞蛋白低排異反應無10類人膠原蛋白的創新性單螺旋線性結構pH值6.5-7.5保持皮膚酸堿平衡維持細胞粘附性變性溫度高酸堿度中性變性溫度72℃動物膠原37℃-40℃易于儲運保存使用分子量90kD利于皮膚滲透利用均質結構穩定性強類人膠原蛋白的創新性單螺旋線性結構pH值6.5-7.5變性溫11類人膠原蛋白的安全性評價實驗全身毒性實驗細胞毒性實驗皮膚刺激實驗眼部刺激實驗皮膚過敏實驗亞慢性毒性實驗遺傳毒性實驗皮下植入實驗由“中國食品藥品檢定研究院”完成的生物學評價試驗植入實驗評價:小鼠、家兔皮下植入，90天無不良反應類人膠原蛋白的安全性評價實驗全身毒性細胞毒性皮膚刺激眼部刺激12類人膠原蛋白透皮與吸收實驗小白鼠背部去毛清潔后，涂抹熒光染料(tritc)標記過的明膠和類人膠原蛋白溶液；于4h，8h分別在涂抹試樣區域取1cm×2cm大小的皮膚，進行冰凍切片，采用熒光顯微鏡觀察；結果表明：類人膠原蛋白具有較強的透皮吸收行為，而明膠的透皮吸收較差。[14][14]TheTransdermalAbsorptionStudyofHuman-LikeCollagen.AdvancedMaterialsResearch,415-417:1781-1985明膠涂抹8h后明膠涂抹4h后類人涂抹8h后類人涂抹4h后皮下真皮表皮皮下真皮表皮類人膠原蛋白透皮與吸收實驗小白鼠背部去毛清潔后，涂抹熒光染料13類人膠原蛋白促細胞生長實驗[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白對BHK-21細胞生長的影響，西北大學學報(自然科學版)，35(5):581-584,20050.1%類人膠原蛋白可促進成纖維細胞和上皮細胞的生長，其作用明顯優于0.1%的維生素C和0.1%的明膠，其促進細胞生長的速度，是對照組的1.4-1.6倍。類人膠原蛋白促細胞生長實驗[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白14類人膠原蛋白促細胞生長實驗[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白對BHK-21細胞生長的影響，西北大學學報(自然科學版)，35(5):581-584,2005結果顯示：應用類人膠原蛋白溶液培養細胞，細胞數量有大幅度增加，細胞形態正常、透亮飽滿。類人膠原蛋白促細胞生長實驗[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白15類人膠原蛋白細胞親和性實驗結果顯示：14天時成纖維細胞大量貼附在類人膠原蛋白海綿表面，且生長良好。反映了類人膠原蛋白具有良好的細胞親和性和相容性。類人膠原蛋白海綿表面2BS培養14天后掃描電鏡觀察[15]程寧,范代娣類人膠原蛋白對BHK-21細胞生長的影響，西北大學學報(自然科學版)，35(5):581-584,2005類人膠原蛋白細胞親和性實驗結果顯示：類人膠原蛋白海綿表面2B16類人膠原蛋白組織相容性實驗試驗方法：將類人膠原蛋白海綿、動物膠原蛋白海綿和可吸收明膠海綿分別植入兔子肝臟，4周后開腹觀察植入處的肝組織。[16]類人膠原蛋白生物相容性實驗研究《西北大學學報（自然科學版）》2004年2月第32卷第1期作者：西北大學范代娣，米鈺，惠俊峰等類人膠原蛋白細胞核形態正常明膠海綿細胞核皺縮動物膠原海綿細胞核皺縮變形類人膠原蛋白組織相容性實驗試驗方法：[16]類人膠原蛋白生物17類人膠原蛋白組織相容性實驗結果表明：明膠海綿和動物膠原蛋白海綿植入處造成細胞形態和數量改變，組織腫脹，大量炎性細胞浸潤類人膠原蛋白海綿對植入處肝細胞形態幾乎不造成影響，細胞器的形態較好；組織相容性好，優于供試的其他產品類人膠原蛋白植入處組織形態正常少量炎性細胞浸潤明膠海綿植入處大量炎性細胞浸潤組織增生，細胞腫脹動物膠原海綿植入處大量炎性細胞浸潤組織增生，細胞腫脹[16]類人膠原蛋白生物相容性實驗研究《西北大學學報（自然科學版）》2004年2月第32卷第1期作者：西北大學范代娣，米鈺，惠俊峰等類人膠原蛋白組織相容性實驗結果表明：類人膠原蛋白植入處明膠海18皮膚美容止血材料骨修復材料人工血管皮下注射填充類人膠原蛋白的應用皮膚美容類人膠原蛋白的應用19類人膠原蛋白在皮膚美容領域的應用皮膚美容:眼膜、面膜、噴霧、原液等系列；用于衰老性肌膚緊致抗衰；日常的肌膚養護；皮炎、痤瘡、敏感肌膚等問題肌膚的修護。類人膠原蛋白在皮膚美容領域的應用皮膚美容:20生產環境為萬級條件下的局部百級，等同于手術室的潔凈要求親和層析+凝膠過濾層析+超濾的純化工藝，可滿足體內植入的要求所采用的為注射用水，無菌、無內毒素真正不含防腐劑類人膠原蛋白在皮膚美容領域的應用生產環境為萬級條件下的局部百級，等同于手術室的潔凈要求親和層21類人膠原蛋白在醫學領域的應用研究可降解止血海綿:主要用于腔內、顱內的外科手術止血可吸收明膠海綿動物膠原蛋白海綿進口可吸收紗布類人膠原蛋白止血海綿類人膠原蛋白在醫學領域的應用研究可降解止血海綿:可吸收明膠海22可降解止血海綿:主要用于腔內、顱內的外科手術止血馬茂，范代娣殼聚糖-類人膠原蛋白對兔肝創面的止血效果及組織相容性觀察，第四軍醫大學學報，2007，28(12):1122-1124專利成果：一種可生物降解止血海綿材料及其制備方法。專利號：ZL200610041913.3一種規模制備類人膠原蛋白止血海綿的方法。申請號：200910218514.3類人膠原蛋白在醫學領域的應用研究可降解止血海綿:主要用于腔內、顱內的外科手術止血馬茂，范代娣23骨修復材料:仿生礦化，制備骨修復材料，用于骨缺損的修復類人膠原蛋白在醫學領域的應用研究骨修復材料:仿生礦化，制備骨修復材料，用于骨缺損的修復類人膠24類人膠原蛋白在醫學領域的應用研究人工血管：模擬人體血管結構，仿生制備，用于血管修復類人膠原蛋白在醫學領域的應用研究人工血管：模擬人體血管結構，25類人膠原蛋白在醫學領域的應用研究注射填充水凝膠應用領域采用皮下注射或填充，可用于去皺、豐唇、面部矯形、凹陷填充等。產品特點生物相容性優異；降解時間可控；產品可促進注射部位細胞活性和膠原蛋白纖維的再生

類人膠原蛋白在醫學領域的應用研究注射填充水凝膠應用領域產品特26研發團隊研發成果產業化之路類人膠原蛋白的科研和產業化研發團隊類人膠原蛋白的科研和產業化27類人膠原蛋白的研發團隊范代娣：新世紀“百千萬人才工程”國家人選獲“中國青年女科學家”提名享受“國務院特殊津貼”博士生導師研發團隊：博士研究生20余人碩士研究生50余人類人膠原蛋白的研發團隊范代娣：28類人膠原蛋白的專業水準XiaoxuanMa,DaidiFan,Long-anShang,QiangCai,LeiChi,ChenhuiZhu,YuMi,Yan-eLuo.Oxygentransferratecontrolintheproductionofhuman-likecollagenbyrecombinantEscherichiacoil.BiotechnologyandBiochemistry.2010,55,4：169-174(SCI)WenjiaoXue,DaidiFan,LonganShang.Effectsofaceticacidanditsassimilationinfed-batchculturesofrecombinantEscherichiacolicontaininghuman-likecollagencDNA.JournalofBioscienceandBioengineering.2010.109（3）：257-261(SCI)Xiao-JunWang,Dai-DiFan,Yan-ELuo.BreakthroughModelofRecombinantHuman-LikecollageninImmobilizedMetalAffinityChromatography.AppliedBiochemistryandBiotechnology,2009,158(2),262-276.(SCI)WenJXue,DaiDFan,LonganShang,ChenHZhu,XiaoXMa,YuanYYu.Productionofbiomassandrecombinanthuman-likecollageninEscherichiacoliprocesseswithdifferentCO2pulses.BiotechnologyLetters.2009,31:221-226.(SCI)DaiD.Fan，L.-H.Wang，L.-A.Shangetal.AMicrocalorimetricMethodforStudyingtheBiologicalEffectsofMg2+IononRecombinantEscherichiacoli.ChemicalBiochemicalEngineering,2008,22(3):363-368.(SCI)DAIDFAN,LIHWANG,LONGASHANG,HUIJSHI,XIAOXMA,YUMI,LIFGU,KANGZXU.AmicrocalorimetricmethodtostudytheeffectofkanamycinonthemetabolismofrecombinantEscherichiacoliChemicalEngineeringCommunications,2007，194:1127-1137.(SCI)YanELuo,DaiDFan,LongAShang,HuiJShi,XiaoXMa,YuMi,GuiFZhao.AnalysisofmetabolicfluxinEscherichiacoliexpressinghuman-likecollageninfed-batchculture,Biotechnologyletters,30(4):637-643,2008.(SCI,EI)DaiDFan,YaneLuo,YuMi,XiaoXMa,LonganShang.Characteristicsoffed-batchculturesofrecombinantEscherichiacolicontaininghuman-likecollagencDNAatdifferentspecificgrowthrates.BiotechnologyLetters,2005,27:865–870.(SCI,EI)LUOYane,FANDaidi,MAXiaoxuan,WANGDewei,MIYu,HUAXiufuandLIWenhong.ProcessControlforProductionofHuman-likeCollageninFed-batchCultureofEscherichiacoliBL21.ChineseJ.Chem.Eng.,2005,13(2):276-279.(SCI,EI)HUAXiufu,FANDaidi,LUOYane,HANGXI,SHIHuijuan,MIYu,MAXiaoxuan,SHANGLong'an,ZHAOGuifang.KineticsofHighCellDensityFed-batchCultureofRecombinantEscherichiacoliProducingHuman-likeCollagen.ChineseJ.Chem.Eng.,2006,14(2):242-247.(SCI,EI)……60余篇SCI文獻報道類人膠原蛋白的專業水準XiaoxuanMa,Daidi29類人膠原蛋白的專業水準國家自然科學基金：工程控制策略有效解除大腸桿菌培養過程中乙酸抑制機理探索（21076169）國家自然科學基金：周期性饑餓協迫對重組大腸桿菌高密度培養的影響（31000019）國家自然科學基金：重組類人膠原蛋白大腸桿菌表達體系高密度發酵的代謝調控及動力學（20606026）國家自然科學基金：重組E.coli類人膠原蛋白表達體系多聚體現象研究(20476085)國家高技術產業化示范工程發展計劃：基因工程技術生產類人膠原蛋白生物材料高技術產業化示范工程[發改高計(2004)2563]國家科技部863計劃：重組類人膠原蛋白Ⅱ可降解材料制造關鍵技術及應用(2006AA02Z246)國家科技部創新基金：重組基因工程菌生產類膠原蛋白(01C26216110599)國家火炬計劃：類人膠原蛋白(2002EB021307）利用重組類人膠原礦化仿生制備骨修復材料及應用(2007AA03Z456)類人膠原蛋白人工血管體外構建過程的工程學（20776119）新型有機無機雜化納米生物功能材料復合制備及控制機理（21006079）……13項國家級科研項目類人膠原蛋白的專業水準國家自然科學基金：工程控制策略有效解除30類人膠原蛋白的專業水準一種類人膠原蛋白及其生產方法。專利號：