第六章

抗體制備技術抗體的一些基本概念多克隆抗體（PolyclonalAntibody）：

即多個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體單克隆抗體（MonoclonalAntibody）：

即由單個B淋巴細胞克隆所分泌的抗體

EpitopesonthesurfaceofpathogensViralsurfaceproteinepitopesWholeVirusparticlesurfaceofproteins多克隆抗體的特點

制備方便，操作簡單，可大量產生容易發生沉淀反應，出現沉淀線異質性：抗體種類多樣，化學組成復雜，含有較多的無關Ig存在針對多種抗原或一種抗原不同表位的一系列親和力不同的抗體

重復性差，批間差異很大

免疫原需要純化

易出現交叉反應單克隆抗體的特點

高度均質（同一亞類），化學組成均一，不含

或很少含無關Ig特異性強，只針對一種抗原表位

親和力強

抗原用量少，無需純化

無批間差異

來源穩定，可大批生產，容易標準化

不易形成沉淀線

操作比較麻煩多克隆抗體與單克隆抗體區別什么情況需要制備單抗目的蛋白有結構類似物抗原不純，無法分開多抗效果不好（已排除非特異性反應）希望將抗體用于治療，研制成藥品希望將抗體用于診斷，研制成診斷試劑

單克隆和多克隆抗體的比較和用途特異性敏感性均一性McAbPcAb低差無高強有1.用于免疫學檢測，輔助臨床診斷2.McAb用于親和層析，分離微量可溶性抗原3.標記的McAb用于基礎研究，了解細胞分化等4.制備生物導彈用于腫瘤、移植等的臨床治療抗體名稱抗體種類 靶向抗原

適應癥

批準日期

OKT3

鼠單抗 CD3

移植排斥1986

Panorex

鼠單抗 17-1A

大腸癌

1995

ReoPro

人-鼠嵌合Fab血小板受體

冠心病

1994

ⅡbⅢa

Rituxan人-鼠嵌合抗體CD20

淋巴瘤

1997

Simulect

人-鼠嵌合抗體CD25

移植排斥

1998

Remicade

人-鼠嵌合抗體TNF-α

炎癥性腸病、

1998

類風濕關節炎

1999Zanapax

人源化抗體 CD25

移植排斥

1997

Herceptin

人源化抗體HER-2

乳腺癌

1998

Synagis

人源化抗體RSVF蛋白

RSV感染

1998

Mylotarg

人源化抗體-CD33

淋巴瘤

2000

化療藥物交聯物Campath

人源化抗體 CD52

淋巴瘤

2001

已批準上市的治療性單抗購買抗體時要注意廠商的標注適合于做什么實驗，使用濃度多少？WB（Westernblotting，免疫印跡）IH（Immunohistochemistry,免疫組織化學）IC（Immunocytochemistry,免疫細胞化學）IEM（Immunelectronmicroscopy，免疫電鏡）FCM（FlowCytometry，流式細胞儀）ELISA（enzymelinkedimmunosorbentassey,

聯免疫吸附實驗，聯免疫分析）第一節 多克隆抗體制備技術第二節 單克隆抗體制備技術第三節 基因工程抗體制備技術第四節 抗體庫技術

第六章 抗體制備技術

第一節 多克隆抗體制備技術第二節 單克隆抗體制備技術第三節 基因工程抗體制備技術第四節 抗體庫技術

第六章 抗體制備技術

第一節

多克隆抗體制備技術

一、多克隆抗體制備的原理二、多克隆抗體制備的基本條件三、多克隆抗體制備的基本方法第一節

多克隆抗體制備技術

一、多克隆抗體制備的原理二、多克隆抗體制備的基本條件三、多克隆抗體制備的基本方法一、

多克隆抗體制備的原理

多克隆抗體制備的基本流程第一節

多克隆抗體制備技術

一、多克隆抗體制備的原理二、多克隆抗體制備的基本條件三、多克隆抗體制備的基本方法二、

多克隆抗體制備

的基本條件

1.免疫原的制備2.免疫動物的選擇3.佐劑的準備二、

多克隆抗體制備

的基本條件

1.免疫原的制備2.免疫動物的選擇3.佐劑的準備1.免疫原的制備

（1）完全抗原的提?。?）半抗原與載體的交聯（3）合成肽抗原（1）完全抗原的提取細胞破碎法抗原的提取抗原的純化冷熱交替法反復凍融法超聲破碎法玻璃勻漿法自溶法酶處理法水溶液提取法有機溶劑提取法超濾鹽析電泳凝膠過濾離子交換親和層析??????溫度驟變迅速解凍超聲剪切物理研磨自身裂解蛋白酶切載體的選擇半抗原與載體的偶聯方法偶聯復合物的鑒定天然蛋白質合成類載體吸收光譜法放射性標記法（2）半抗原與載體的交聯化學偶聯法半抗原的制備半抗原與載體偶聯策略免疫原性肽的選擇肽的合成與純化計算機模擬試驗凝膠過濾法反向高效液相色譜（3）合成肽抗原

細胞、細菌和病毒等，一般具有較強的免疫原性，可不加佐劑。例如，直接腹腔注射1~2×107個細胞。顆粒性抗原：

可溶性抗原的來源主要是天然純化，或者用目的基因在原核或真核細胞內表達?？扇苄钥乖枧c弗氏完全或不完全佐劑混勻，進行免疫?？扇苄钥乖好庖咴苽涠?/p>

多克隆抗體制備

的基本條件

1.免疫原的制備2.免疫動物的選擇3.佐劑的準備2.免疫動物的選擇

兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，

抗體量較多（新西蘭、大耳白）小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但

抗體量很少（BALB/C、昆明鼠）大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過

程要麻醉動物（Wistar大鼠）羊（sheep、goat）：常用于較大批量地

生產抗體（商品）馬（horse）：常用于大批量生產治療用

抗體（商品）。豚鼠（guineapig）：國外實驗室常用二、

多克隆抗體制備

的基本條件

1.免疫原的制備2.免疫動物的選擇3.佐劑的準備佐劑的生物學功能

緩釋

促吞噬

激活免疫應答

增強輔助性T細胞

促進淋巴細胞分化和抗體分泌

提高初次和再次免疫應答的抗體滴度

改變抗體類型、促進遲發性超敏反應佐劑的種類

無機佐劑：

氫氧化鋁、明礬等

有機佐劑：

分枝桿菌、百日咳桿菌、內毒素等

合成佐劑：

雙鏈多聚核苷酸、左旋咪唑、異丙肌苷

油劑：

弗氏佐劑、花生油、礦物油、植物油等第一節

多克隆抗體制備技術

一、多克隆抗體制備的原理二、多克隆抗體制備的基本條件三、多克隆抗體制備的基本方法三、

多克隆抗體制備

的基本方法

1.抗原劑量、免疫途徑與免疫日程2.小樣試血與采血3.抗體的分離和純化技術4.抗體的鑒定5.抗體的保存三、

多克隆抗體制備

的基本方法

1.抗原劑量、免疫途徑與免疫日程2.小樣試血與采血抗體的分離和純化技術抗體的鑒定抗體的保存抗原的劑量蛋白質抗原耐受劑量小鼠：為20～400μg/0.2ml/次大鼠：100～1000μg/0.5ml/次兔：200～2000μg/2ml/次羊：5～20mg/5ml/次免疫動物的方法

免疫原制備無佐劑免疫法——適用于顆粒性抗原福氏佐劑免疫法——適用于可溶性抗原鋁佐劑免疫法——適用于人免疫免疫動物皮內免疫法皮下或肌肉免疫法淋巴結免疫法混合法

抗體效價滿意后靜脈注射加強免疫抗原免疫的基本策略加強免疫的劑量：約首次劑量的1/2加強免疫的時間：間隔2～8周加強免疫次數：2-5次高特異性的抗血清：低劑量短間隔免疫法高效價的抗血清：高劑量長程免疫法常見注射方法肌肉注射法尾靜脈注射三、

多克隆抗體制備

的基本方法

1.抗原劑量、免疫途徑與免疫日程2.小樣試血與采血抗體的分離和純化技術抗體的鑒定抗體的保存抗血清的獲得

眼眶取血頸動脈放血心臟采血免疫效果評價取血：兔耳靜脈、鼠尾靜脈檢測：雙向免疫擴散（1:32以上）ELISA（1：5000以上）三、

多克隆抗體制備

的基本方法

1.抗原劑量、免疫途徑與免疫日程2.小樣試血與采血3.抗體的分離和純化技術4.抗體的鑒定5.抗體的保存抗體的分離和純化技術

鹽析法

凝膠過濾法

離子交換層析法

親和層析法

電泳分離法三、

多克隆抗體制備

的基本方法

1.抗原劑量、免疫途徑與免疫日程2.小樣試血與采血3.抗體的分離和純化技術4.抗體的鑒定5.抗體的保存4.抗體的鑒定蛋白濃度測定：

紫外分光比色法，雙縮脲法、

福林-酚法、

二辛可寧酸（BCA）法，

考馬氏藍法，Lowry法等免疫效果評價：

雙向免疫擴散、ELISA純度分析：免疫印跡抗體類別分析：免疫金試條親和力分析：ELISA、Biacore、熒光偏振三、

多克隆抗體制備

的基本方法

1.抗原劑量、免疫途徑與免疫日程2.小樣試血與采血3.抗體的分離和純化技術4.抗體的鑒定5.抗體的保存5.抗體的保存抗體的濃縮：

吸收、蒸發、超濾抗體的保存：

濃縮抗體+防腐劑+甘油免疫效果不佳可能的原因第一節 多克隆抗體制備技術第二節 單克隆抗體制備技術第三節 基因工程抗體制備技術第四節 抗體庫技術

第六章 抗體制備技術

第二節單克隆抗體制備技術

一、單克隆抗體制備的原理二、單克隆抗體制備的基本條件三、單克隆抗體制備的基本方法第二節單克隆抗體制備技術

一、單克隆抗體制備的原理二、單克隆抗體制備的基本條件三、單克隆抗體制備的基本方法單克隆抗體制備技術細胞工程抗體技術、B細胞雜交瘤技術

問題的由來：

B細胞抗體單克隆B細胞單克隆抗體如何獲得抗原特異性的B細胞克?。咳绾问笲細胞長期存活，永遠產生抗體？

而：腫瘤細胞永生性細胞功能的嵌合BCELLCANCERCELL？抗體分泌永生性可能性：Barski等（1960）發現細胞的自然融合現象，但頻率很低。岡田等（1967）和Kao等（1974）分別發現滅活的仙臺病毒（HVJ）和聚乙二醇（PEG）能顯著提高細胞融合率。Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodiesofpredefinedspecificity.Nature1975,256:495綿羊紅細胞小鼠脾細胞導致生命科學領域的一場革命！骨髓瘤細胞仙臺病毒GeorgesJ.F.K?hlerCésarMilsteinHybridomas:Themakingofarevolution.Science1982Vol205pp1073-1075NielsK.JerneGeorgesJ.F.KoehlerFederalRepublicofGermanyBaselInstituteforImmunology

Basel,Switzerland(1946-1995)CarMilstein(1927-2002)ArgentinaandUnitedKingdomMRCLaboratoryofMolecularBiology

Cambridge,UnitedKingdom第二節單克隆抗體制備技術

一、單克隆抗體制備的原理二、單克隆抗體制備的基本條件三、單克隆抗體制備的基本方法單克隆抗體的制備過程

二、單克隆抗體制備

的基本條件

1.動物的免疫酶缺陷型骨髓瘤細胞的篩選

和培養3.單抗檢測方法的建立二、單克隆抗體制備

的基本條件

1.動物的免疫酶缺陷型骨髓瘤細胞的篩選

和培養3.單抗檢測方法的建立1.動物的免疫抗原與載體動物的選擇免疫途徑第一次免疫：可溶性抗原加弗氏完全佐劑第二次免疫：可溶性抗原加弗氏不完全佐劑第三次免疫：可溶性抗原加生理鹽水小鼠背部皮下注射小鼠背部皮下注射4周后3周后小鼠腹腔注射10天后檢測血清效價加強免疫：可溶性抗原加生理鹽水小鼠腹腔注射細胞融合3天后免疫動物舉例二、單克隆抗體制備

的基本條件

1.動物的免疫酶缺陷型骨髓瘤細胞的篩選

和培養3.單抗檢測方法的建立骨髓瘤細胞的演化酶缺陷型骨髓瘤細胞的篩選HGPRT缺陷型骨髓瘤細胞的選擇：

8-雜氮鳥嘌呤（8-azaguanine，8-AG）

6-硫代鳥嘌呤（6-thioguanine，6-TG)TK缺陷型骨髓瘤細胞的選擇：溴脫氧尿嘧啶核苷（bromodeoxyuridine，

BrdU）細胞DNA生物合成途徑嘌呤合成旁路途徑核酸生物合成主要途徑嘧啶合成旁路途徑次黃嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷單磷酸DNA胸腺嘧啶脫氧核苷酸鳥嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）酶缺陷型細胞的篩選嘌呤合成旁路途徑核酸生物合成主要途徑嘧啶合成旁路途徑次黃嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷單磷酸DNA胸腺嘧啶脫氧核苷酸鳥嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）8-AG或6-TGBrdU二、單克隆抗體制備

的基本條件

1.動物的免疫酶缺陷型骨髓瘤細胞的篩選

和培養3.單抗檢測方法的建立單克隆抗體的鑒定免疫酶技術免疫熒光技術免疫擴散試驗第二節單克隆抗體制備技術

一、單克隆抗體制備的原理二、單克隆抗體制備的基本條件三、單克隆抗體制備的基本方法三、單克隆抗體制備

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養飼養細胞的制備脾細胞的分離細胞融合HAT選擇性培養陽性克隆的篩選克隆化培養單克隆抗體的擴大生產三、單克隆抗體制備

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養飼養細胞的制備脾細胞的分離細胞融合HAT選擇性培養陽性克隆的篩選克隆化培養單克隆抗體的擴大生產組織培養的基本條件儀器：包括CO2培養箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、液氮罐、低速低溫離心機等試劑：培養液、HAT培養液、HT培養液、

牛血清、抗生素等耗材：培養板、培養瓶、吸管、移液管等組織培養的常用儀器骨髓瘤細胞系的選擇要點所選擇的骨髓瘤細胞應與提供免疫脾細胞的動物品系相同自身不產生免疫球蛋白的重鏈與輕鏈對氨基碟呤敏感與免疫脾細胞融合后產生穩定分泌Ig雜交瘤細胞三、單克隆抗體制備

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養飼養細胞的制備脾細胞的分離細胞融合HAT選擇性培養陽性克隆的篩選克隆化培養單克隆抗體的擴大生產飼養細胞的作用：小鼠腹腔巨噬細胞小鼠脾細胞成纖維細胞飼養細胞（feedercell）

增加細胞密度，滿足新生的雜交瘤細胞對

細胞密度的要求吞噬清除死亡的細胞分泌生長刺激因子促進雜交瘤細胞的生長飼養細胞的種類和制備方法：三、單克隆抗體制備

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養飼養細胞的制備脾細胞的分離細胞融合HAT選擇性培養陽性克隆的篩選克隆化培養單克隆抗體的擴大生產拉頸處死小鼠無菌操作取出脾臟清洗、研磨收集細胞離心洗滌細胞計數脾細胞的分離三、單克隆抗體制備

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養飼養細胞的制備脾細胞的分離細胞融合HAT選擇性培養陽性克隆的篩選克隆化培養單克隆抗體的擴大生產細胞融合的方法

PEG融合

仙臺病毒

電融合細胞融合骨髓瘤細胞與脾細胞

按1:10或1:5的比例混合并加入促融劑PEGPEGPEG介導的細胞融合融合后的細胞類型脾細胞脾細胞×脾細胞脾細胞×瘤細胞瘤細胞×瘤細胞瘤細胞BCELLCANCERCELL三、單克隆抗體制備

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養飼養細胞的制備脾B細胞的分離細胞融合HAT選擇性培養陽性克隆的篩選克隆化培養單克隆抗體的擴大生產雜交瘤細胞的選擇性培養HAT選擇性培養的原理：細胞的DNA生物合成有主要途徑和補償途徑。當有氨基碟呤存在時，能夠阻斷DNA合成的主要途徑，需通過補償途徑合成DNA，這時就需要次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶（HGPRT）利用次黃嘌呤合成DNA，或胸腺嘧啶核苷激酶（TK）利用胸腺嘧啶核苷合成DNA。正常細胞DNA生物合成途徑嘌呤合成旁路途徑核酸生物合成主要途徑嘧啶合成旁路途徑次黃嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷單磷酸DNA胸腺嘧啶脫氧核苷酸鳥嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）氨基蝶呤（A）酶缺陷型細胞的篩選嘌呤合成旁路途徑核酸生物合成主要途徑嘧啶合成旁路途徑次黃嘌呤（H）氨基酸谷氨酰胺尿核苷單磷酸DNA胸腺嘧啶脫氧核苷酸鳥嘌呤核苷酸胸腺嘧啶核苷（T）HGPRT（次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶）TK（胸腺嘧啶核苷激酶）8-AG或6-TGBrdU氨基蝶呤（A）HAT選擇性培養H：次黃嘌呤A：氨基喋呤T：胸腺嘧啶核苷

融合后3~4天后，可見外形似骨髓瘤細胞，渾圓透亮的克隆。融合后第7~9天取培養上清，檢測特異性抗體。細胞生長情況：

篩選后存活的細胞脾細胞脾細胞×脾細胞脾細胞×瘤細胞瘤細胞×瘤細胞瘤細胞獲得雜交瘤細胞三、單克隆抗體制備

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養飼養細胞的制備脾細胞的分離細胞融合HAT選擇性培養陽性克隆的篩選克隆化培養單克隆抗體的擴大生產分泌單克隆抗體雜交瘤細胞的檢測方法免疫酶技術間接ELISA免疫熒光技術間接免疫熒光測定法

流式細胞術分析（陰性對照：骨髓瘤細胞培養上清；

陽性對照：免疫鼠血清）三、單克隆抗體制備

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養飼養細胞的制備脾細胞的分離細胞融合HAT選擇性培養陽性克隆的篩選克隆化培養單克隆抗體的擴大生產陽性細胞的單克隆化克隆（cloning）：由單個細胞繁殖、擴增而形成性狀均一的細胞集落的過程。

有限稀釋法軟瓊脂克隆技術有限稀釋法從陽性分泌孔收集雜交瘤細胞，經逐步稀釋，使每孔只有一個細胞。軟瓊脂克隆技術從陽性分泌孔收集雜交瘤細胞，以適當濃度雜交瘤細胞加入軟瓊脂培養基中，形成由一個細胞增殖而成的細胞集落。。雜交瘤細胞的克隆化篩選：單克隆抗體的鑒定抗體敏感性的測定

——對腹水和培養上清進行效價測定抗體特異性的檢測——是否與其他抗原有交叉反應抗體效價的測定抗體亞類的鑒定——IgG（IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3），IgM抗體親和力分析識別表位分析三、單克隆抗體制備

的基本方法

酶缺陷型骨髓瘤細胞的培養飼養細胞的制備脾細胞的分離細胞融合HAT選擇性培養陽性克隆的篩選克隆化培養單克隆抗體的擴大生產單克隆抗體的擴大生產細胞培養法（50μg/ml）小鼠體內誘生法（mg/ml）生物反應器（g/10L）細胞培養法雜交瘤細胞培養瓶或罐中培養收集上清液純化抗體動物體內誘生法Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml液體石臘或降植烷腹腔內接種雜交瘤細胞收集腹水生物反應器單抗制備常見問題污染：培養環境、操作融合細胞不生長：PEG、血清、HAT培養基抗體分泌不足：支原體污染、細胞突變、

培養體系有問題雜交瘤細胞難以克隆化：血清質量、細胞活性第一節 多克隆抗體制備技術第二節 單克隆抗體制備技術第三節 基因工程抗體制備技術第四節 抗體庫技術

第六章 抗體制備技術

基因工程抗體基因工程抗體優點原核表達抗體人源化小分子抗體雙功能抗體易于改造親和力成熟產業化第三節基因工程抗體制備技術

一、鼠源抗體人源化二、小分子抗體三、抗體融合蛋白第三節基因工程抗體制備技術

一、鼠源抗體人源化二、小分子抗體三、抗