燒傷后淋巴細胞肌醇脂質信號系統活性的變化

（3）自然資源項目（批準號39500149）。②重慶第三軍醫大學臨床檢驗教研室,重慶400038大面積深度燒傷后,患者死亡率仍然很高。隨著對傷后機體生理改變和液體復蘇等方面認識的加深,感染已成為人們關心的最主要問題。雖然引起感染的最直接原因主要是皮膚屏障功能的損傷和腸源性感染,但燒傷后機體免疫功能受損應該是引起感染的重要內在因素。我們清楚,T淋巴細胞是機體細胞免疫功能的重要載體和執行細胞。大面積深度燒傷后,機體免疫系統包括多種免疫活性細胞和體液免疫均發生了不同程度的改變,具體表現為特異性細胞免疫功能受抑和非特異性炎癥反應亢進兩方面,而細胞免疫受抑又以T細胞功能受抑尤為突出,故可以肯定細胞免疫功能受損應該是嚴重燒傷后并發感染及其他并發癥的重要原因。早期研究表明,燒傷后機體受損的T細胞功能以IL-2、IFN-γ分泌降低和IL-4、IL-10分泌增加為主要特征。最近,燒傷后TH1/TH2平衡的破壞被認為是傷后機體免疫紊亂的主要機制,但導致TH1/TH2平衡漂移的原因尚未得到闡明。近十年來,基礎研究對T淋巴細胞活化的信號轉導機制已經闡明,即肌醇脂質信號系統是T淋巴細胞活化和執行功能的最主要信號途徑。雖然過去對燒傷后機體T細胞功能改變報道較多,但從信號轉導入手系統地分析T細胞功能受抑的分子機制尚鮮有報道,本文以18%Ⅲ度燙傷小鼠為模型,對T細胞功能受抑的分子機制進行探討。1材料和方法1.1小鼠uf-t-uf4/hsb型熱蒸汽損傷tba度昆明種小鼠60只,雌雄各半,體重23～26g,隨機分為正常對照、傷后2、12、24、96、168h共6組,每組10只。將小鼠背部剪毛,清醒狀態下高壓熱蒸汽造成18%TBSAⅢ度燙傷(病理切片證實)。傷后腹腔注射等滲鹽水3ml預防休克,各組動物于相應時相腋動脈放血活殺,無菌制備脾淋巴細胞懸液。1.2t細胞的分離參照文獻方法,以尼龍毛纖維分離細胞懸液中的T細胞,酸性α-醋酸萘酯酶(ANAE)染色,96%以上為T細胞,臺盼藍染色證明分離出T細胞存活率>95%。1.3指標的識別和方法1.3.1胞漿ptk提取物的制備取1ml分離純化調濃度至3×106ml-1的T細胞懸液,ConA5×10-3g/L刺激15min,離心去上清后立即懸于4ml漿PTK提取液(10mmol/LTris-HClpH7.4,1mmol/LMgCl2、1mmol/LEDTA、10mmol/LDTT、1mmol/LPMSF、50×10-3g/LAprotinin、體積分數為10%Glycerol),冰浴中超聲破碎(250mA、20s×3)4℃,7000g離心,除去細胞核及完整細胞。上清37000g,4℃離心1h,所得上清即為胞漿PTK提取物(-20℃凍存備測蛋白含量及酶活性);沉淀復懸于膜溶解液中[20mmol/LMg(AC)2,5mmol/LNaF,0.2mmol/LEDTA,0.8mmol/EGTA,1mmol/LDTT,質量濃度為0.5%NP-40,50mmol/LTris-HClpH7.5],置冰上提取1h,期間于冰溶中250mA超聲3次,每次10s,再次4℃,37000g離心1h,獲得上清即為膜性PTK提取物。活性測定參照KongSK方法進行,考馬斯亮藍G-250測定蛋白含量。1.3.2可溶性酶檢測方法同樣取新鮮分離純化調濃度至3×106ml-1T細胞懸液1ml,ConA5×10-3g/L刺激15min,離心去上清,加入4℃預冷緩沖液A(50mmol/Lβ-2Me,1mmol/LPMSF、1mmol/LEGTA、2.5mmol/LMgCl2、0.34mol/L蔗糖、10mmol/LTris-HClpH7.5)4ml,超聲破碎(300mA,20s×3),37000g,4℃離心60min,收集上清,上清即含胞漿可溶性酶。離心沉淀部分加入含0.1%TritonX-100(體積分數)勻漿緩沖液(其它成分同緩沖液A),4℃冰箱靜置1h,37000g,4℃離心60min,收集上清,上清液即含轉膜部分可溶性酶,活性測定參照文獻進行。1.3.3pi-蒙古國的分離和活性測試PI-PLC分離及活性測定均參照張澤林等方法進行。1.3.4游離ca++濃度[ca++]io和傳感器合成產物分別測定傷后脾臟T淋巴細胞未接受刺激的胞漿游離Ca++濃度[Ca++]io和ConA刺激后Ca++濃度[Ca++]ia,測定方法為Fura-2/AM熒光探針法。1.3.5il-2,il-10含量各取5×106ml-1純化T細胞懸液0.5ml,加入10×103g/LConA0.5ml混勻,在體積濃度為5%的CO2、37℃孵箱培養24h,離心收集上清,ELISA法測定IL-2、IL-10含量(試劑購自深圳晶美公司)。1.3.6新鮮配制的mtt按MTT比色法稍加改進進行檢測。即在培養的最后4h每孔加入新鮮配制的濃度為5g/L的MTT10μl。移出上清,加入100μl乙醇放置30min顯色,酶標儀上570nm測定。1.4處理數據結果均以ˉx±s表示,采用STAT5.0統計程序處理,包括行方差分析、方差齊性檢驗和t檢驗相關分析。2t細胞肌醇磷脂途徑胞漿信號轉導分子活性/濃度變化2.1燒傷后脾臟T淋巴細胞肌醇磷脂途徑跨膜信號轉導酶PTK、G-Protein及轉膜PKC活性變化與正常對照相比,燒傷后T細胞G-protein,PTK活性均于傷后2h即出現明顯降低,傷后12、24h降低非常顯著,傷后168h出現回升,二者變化趨勢較一致;轉膜PKC活性出現雙相改變,即傷后2～12h降低,傷后96h及以后升高(表1)。2.2燒傷后T淋巴細胞肌醇磷脂途徑胞漿信號轉導分子活性/濃度變化參與介導燒傷后T細胞胞內信號轉導各分子活性變化較復雜,具體表現在與正常對照組相比胞漿PKC活性出現先升高(12h,P<0.01),后降低(96h,P<0.01)的雙相改變,與轉膜PKC變化趨勢相反,其活性改變與IL-10分泌呈負性直線相關;PI-PLC活性和Ca++濃度傷后各時相均降低,但變化趨勢一致,二者均于傷后168h出現恢復(表2,表3)。2.3燒傷后T淋巴細胞功能活性與正常對照組相比較,燒傷后小鼠脾臟T細胞增殖能力減弱,明顯減弱出現于傷后12h,傷后24、96h顯著減弱,IL-2的分泌于傷后明顯降低,傷后24～168h降低有非常顯著性意義(P<0.001),IL-10的分泌出現先降低后升高的變化趨勢,降低出現于傷后2～96h,升高出現在傷后168h及以后。相關分析結果(rCa++/IL-2=0.581,rPI-PLC/IL-10=0.753)表明:胞漿[Ca++]與IL-2分泌及PI-PLC活性與IL-10分泌呈非常顯著正相關。3損傷后t細胞功能變化與信號轉導活性的變化嚴重燒傷患者由于其機體天然和獲得性免疫功能紊亂,其導致感染的易感性大大增加。天然免疫功能的損傷包括皮膚屏障的破壞,腸源性感染和巨噬細胞功能降低等;獲得性免疫功能的損傷則主要是對T淋巴細胞功能的破壞,包括T細胞IL-2分泌減少和增殖功能降低等。此外,燒傷后免疫紊亂還包括非特異性炎癥反應亢進和由此導致的諸多并發癥等。最近的資料顯示,動物和人體實驗均證明,燒傷和創傷后機體T淋巴細胞分泌IFN-γ、IL-2降低,而IL-10、IL-4的產生卻增加,故由此推論,燒傷和創傷后可誘發機體TH1/TH2平衡破壞。眾所周知,IL-2是T細胞必需的生長因子,而IL-10是機體細胞免疫反應的重要抑制因子,其抑制活性體現在對輔助細胞合成分泌IL-1β、IL-12(TH1細胞)的抑制和抑制單核細胞、巨噬細胞功能等方面。即傷后機體細胞因子的分泌可以誘導和加重機體的免疫抑制。我們的實驗同樣證實了上述結果。具體表現為,嚴重燒傷后常誘導機體TH1/TH2平衡偏向TH2型反應為主(TH2細胞增殖分化增強而TH1細胞增殖分化減弱)。為探索傷后T細胞的細胞因子分泌改變(TH1/TH2平衡偏移)和功能受抑的分子機制,我們對傷后T淋巴細胞信號轉導活性進行研究。T細胞的活化和功能的執行可以由絲裂原介導,而在體內更主要的是接受抗原遞呈細胞呈遞的抗原信號和MHC(Ⅰ、Ⅱ)類信號,在共刺激分子如CD28作用下活化、增殖、分泌細胞因子,執行相應的免疫功能。T淋巴細胞活化過程涉及信號接收、跨膜轉導、胞內傳導、信號入核和基因表達等多個方面。本研究以肌醇磷脂信號途徑為對象,探索嚴重燒傷后T細胞功能受抑的分子機制。全面分析本實驗結果可以發現:①嚴重燒傷后,T細胞跨膜信號轉導處于T細胞活化信號流的“限速酶”地位,也即參與跨膜信號轉導的G-Protein、PTK、轉膜PKC活性受抑是制約燒傷后T細胞活化信號轉導的“瓶頸”。G-Protein、膜PTK傷后各時相和轉膜PKC傷后早期活性均降低,其變化趨勢與淋巴細胞增殖反應和IL-2分泌變化趨勢相一致;且該三個信號轉導酶在諸多信號轉導分子中活性明顯降低的時相發生最早。②嚴重燒傷后,PKC轉膜可以獨立于PI-PLC作用底物DAG。原因在于:PKC是由PI-PLC分解PIP2所產生底物DAG活化,為PI-PLC下游信號分子,其活性變化應尾隨PI-PLC的活性變化,與同屬PI-PLC作用主物IP3介導的[Ca++]濃度相一致。但我們的研究結果顯示其活性變化早于PI-PLC和Ca++,提示存在有活化PKC的另外途徑,且說明PKC轉膜可以獨立于PI-PLC作用底物DAG。另外,轉膜PKC出現先降低后升高,其變化趨勢與IL-10分泌相一致,提示二者可能存在某種相關性。③燒傷后脾臟T淋巴細胞胞漿Ca++濃度降低可能是導致T細胞增殖活性降低和IL-2分泌減少的重要原因,但傷后168hCa