生物制品生產和檢定用動物細胞基質制備及檢定規程本規程合用于人用生物制品生產/檢定用動物細胞基質，涉及含有細胞庫體系的細胞及原代細胞。細胞基質系指可用于生物制品生產/檢定的全部動物或人源的持續傳代細胞系、二倍體細胞株及原代細胞。生產非重組制品所用的細胞基質，系指來源于未經修飾的用于制備其主細胞庫的細胞系/株和原代細胞。生產重組制品的細胞基質，系指含所需序列的、從單個前體細胞克隆的轉染細胞。生產的細胞基質，系指通過親本骨髓瘤細胞系與另一親本細胞融合的雜交瘤細胞系。一、對生產用細胞庫細胞基質總的規定用于生物制品生產的細胞系/株均須通過全方面檢定，須含有以下對應資料，并經國務院藥品監督管理部門同意。（一）細胞系/株歷史資料的規定細胞系/株來源資料應含有細胞系/株來源的有關資料，如細胞系/株制備機構的名稱，細胞系/株來源的種屬、年紀、性別和健康狀況的資料。這些資料最佳從細胞來源實驗室獲得，也可引用正式發表文獻。人源細胞系/株須含有細胞系/株的組織或器官來源、種族及地區來源、年紀、性別及生理狀況的有關資料。動物來源的細胞系/株須含有動物種屬、種系、喂養條件、組織或器官來源、地區來源、年紀、性別、病原體檢測成果及供體的普通生理狀況的有關資料。如采用已建株的細胞系/株，應從含有一定資質的細胞保藏中心獲取細胞，且應提供該細胞在保藏中心的具體傳代過程，涉及培養過程中所使用的原材料的有關信息，含有細胞來源的證明資料。2．細胞系/株培養歷史的資料應含有細胞分離辦法、細胞體外培養過程及建立細胞系/株過程的有關資料，涉及所使用的物理、化學或生物學手段，與否有外源添加序列，以及細胞生長特性、生長液成分、選擇細胞所進行的任何遺傳操作或選擇辦法等。同時還應含有細胞鑒別、檢定、內源及外源因子檢查成果的有關資料。應提供細胞培養液的具體成分，如使用人或動物源成分，如血清、胰蛋白酶、水解蛋白或其它生物學活性的物質，應含有這些成分的來源、制備辦法及質量控制、檢測成果和質量確保的有關資料。（二）細胞庫的建立細胞庫的建立可為生物制品的生產提供已標定好的、細胞質量相似的、能持續穩定傳代的細胞種子。1．原材料的選擇建立細胞庫的多個類型細胞的供體均應符合本規程‘細胞的檢定’中有關規定。神經系統來源的細胞不得用于生物制品生產。細胞培養液中不得使用人血清，如需使用人血白蛋白，則須使用有同意文號的合格制品。消化細胞用胰蛋白酶應進行檢測，證明其無細菌、真菌、支原體或病毒污染。特別應檢測胰蛋白酶來源的動物可能攜帶的病毒，如細小病毒等。用于生物制品生產的培養物中不得使用青霉素或β-內酰胺(β-Lactam)類抗生素。配制多個溶液的化學藥品應符合《中國藥典》（二部）或其它有關國標的規定。2．細胞操作的環境規定細胞培養的操作應符合中國《藥品生產質量管理規范》的規定。生產人員應定時檢查身體。在生產區內不得進行非生產制品用細胞或微生物的操作；在同一工作日進行細胞操作前，不得操作或接觸有感染性的微生物或動物。3．建立細胞庫細胞庫為三級管理，即原始細胞庫、主細胞庫及工作細胞庫。如為引進的細胞，可采用主細胞庫和工作細胞庫構成的二級細胞庫管理。在某些特殊狀況下，也可使用MCB一級庫，但須得到國務院藥品監督管理部門的同意。（1）原始細胞庫(PCB)由一種原始細胞群體發展成傳代穩定的細胞群體，或通過克隆培養而形成的均一細胞群體，通過檢定證明合用于生物制品生產或檢定。在特定條件下，將一定數量、成分均一的細胞懸液，定量均勻分裝于安瓿，于液氮或-130（2）主細胞庫(MCB) 取原始細胞庫細胞，通過一定方式進行傳代、增殖后均勻混合成一批，定量分裝，保存于液氮或-130（3）工作細胞庫(WCB)工作細胞庫的細胞由MCB細胞傳代擴增制成。由MCB的細胞經傳代增殖，達成一定代次水平的細胞，合并后制成一批均質細胞懸液，定量分裝于安瓿或適宜的細胞凍存管，保存于液氮或-130℃下列備用，即為工作細胞庫。每個生產公司的工作細胞庫必須限定為一種細胞代次。凍存時細胞的傳代水平須確保細胞復蘇后傳代增殖的細胞數量能滿足生產一批或一種亞批制品。復蘇后細胞的傳代的水平應不超出同意的該細胞用于生產限制最高限定代次。所制備的WCB必須經檢定合格（見本規程‘細胞檢定4．細胞庫的管理每種細胞庫均應分別建立臺帳，統計放置位置、容器編號、分裝及凍存數量，取用統計等。細胞庫中的每支細胞安瓿或細胞凍存管均應注明細胞系/株名、代次、批號、編號、凍存日期，儲存容器的編號等。凍存前細胞活力應在90%以上，復蘇后細胞存活率應不低于85%。凍存后的細胞，應最少作一次復蘇培養并持續傳代至衰老期，檢查不同傳代水平的細胞生長狀況。主細胞庫和工作細胞庫分別寄存。非生產用細胞應與生產用細胞嚴格分開寄存。（三）細胞檢定細胞檢定重要涉及下列幾個方面：細胞鑒別、外源因子和內源因子的檢查、致瘤性檢查等。必要時還須進行細胞染色體核型檢查。這些檢測內容對于MCB細胞和WCB細胞及生產限定代次細胞均合用。細胞檢定的基本規定見下表1。細胞庫建立后應最少對MCB細胞及生產終末細胞進行一次全方面檢定。每次從MCB建立一種新的WCB，均應按規定項目進行檢定。表1、細胞檢定項目規定檢測項目MCBWCB生產終末細胞*細胞鑒別+++無菌檢查+++支原體檢查+++病毒污染檢查：外源病毒體外培養法+++體內接種法+-+種屬特異性病毒+-+逆轉錄病毒+-+細胞致瘤性+-+*生產終末細胞:是指按生產規模制備的終末代次細胞。1．細胞鑒別實驗新建細胞系/株、細胞庫(MCB和WCB)和生產終末細胞應進行鑒別實驗，以確認為本細胞，無其它細胞的交叉污染。細胞鑒別實驗辦法有多個，涉及細胞形態、生物化學法(猶如工酶實驗)、免疫學檢測(如HLA、種特異性抗血清)、細胞遺傳學檢測(如染色體核型、標記染色體檢測)、遺傳標志檢測(如DNA指紋圖譜、STR圖譜、基因組二核苷重復序列)等。可選其中一種或幾個辦法，但均須經國家藥品檢定機構承認。細胞表型特性與遺傳學特性相結合來判斷，更有助于細胞鑒別。2．無菌檢查取混合細胞培養上清液樣品，依法檢查，應符合規定（附錄XIIA）。3．支原體檢查取細胞培養上清液樣品，依法檢查，應符合規定（附錄XIIB進行），應為陰性。4．細胞內、外源病毒因子檢查應注意檢查細胞系/株中與否有來源物種中潛在的可傳染的病毒，以及由于操作帶入的外源性病毒。細胞進行病毒檢查的種類及辦法，須根據細胞的種屬來源、組織來源及細胞特性決定。（1）細胞形態觀察及血吸附實驗取混合瓶細胞樣品，接種最少6個細胞培養瓶或培養皿，待細胞長成單層后換維持液，持續培養兩周。如有必要,能夠適宜換液。每日鏡檢細胞，細胞應保持正常形態特性。如為貼壁細胞或半貼壁細胞，細胞最少培養14天后，分別取1/3細胞培養瓶或培養皿，用%~%豚鼠紅細胞和雞紅細胞混合懸液進行血吸附實驗。加入紅細胞后置2~8℃30分鐘，然后置20~25℃30新鮮紅細胞在2~8℃保存不得超出7天,（2）不同細胞傳代培養法檢測病毒因子將待檢細胞分別接種下列三種單層細胞，涉及猴源細胞、人源二倍體細胞和同種屬同組織類型來源的細胞。每種單層細胞接種最少107個含有原細胞培養上清液的活細胞懸液或細胞裂解物，每種細胞最少接種2瓶。接種供試品量應占維持液的1/4以上，培養最少14天。實驗應設立病毒陽性對照，涉及可觀察細胞病變的病毒陽性對照、血凝陽性對照及血吸附陽性對照。如細胞裂解物對單層細胞有干擾，則應排除干擾因素。在培養第7天時，分別取每種接種的單層細胞上清液各一瓶，分別接種于新鮮制備的對應的單層細胞上，繼續培養7天，觀察細胞病變并進行細胞形態觀察及血吸附實驗。每種接種的單層細胞不得出現細胞病變，血吸附實驗應均為陰性。若待檢細胞已知可支持人巨細胞病毒(CMV)的生長，則應在接種人二倍體細胞后最少觀察28天，應無細胞病變。同時，應進行血吸附實驗,應為陰性。（3）接種動物和雞胚法檢測病毒因子MCB或WCB細胞、增殖到或超出生產用體外細胞齡限制代次的細胞須采用動物體內接種法進行外源病毒因子檢測。選用乳鼠、成鼠和雞胚(兩組不同日齡)累計4組，按表2所列辦法進行實驗和觀察。接種細胞后，任何動物出現異常或疾病均應進行因素分析。觀察到期時，應最少有80%以上接種動物或雞胚健存，視為實驗有效。接種動物未顯示有外源病毒感染，則細胞鑒定為合格。表2動物體內接種法檢測外源病毒因子動物組規定數量接種途徑細胞濃度(個活細胞/ml)接種細胞液量(ml/只)觀察天數結果判定乳鼠24小時內10(2窩)腦內腹腔＞1x10721應健存成鼠15~2010腦內腹腔＞1x10721應健存雞胚*9~11日齡10尿囊腔＞1x1073~4尿液血凝實驗陰性雞胚5~6日齡10卵黃囊＞1x1075應存活豚鼠350~500g5腹腔＞1x10742應健存，解剖無結核病變家兔~2.5kg5皮下皮內**＞1x10721無異常，健存*經尿囊腔接種的雞胚，在觀察末期，應用豚鼠和雞紅細胞混合懸液進行直接紅細胞凝集實驗。**每只家兔于皮內注射10處每處對于新建細胞系/株，還應接種豚鼠和家兔（見表1）。豚鼠重要用于檢查細胞內結核分支桿菌，在注射前觀察4周，結核菌素實驗為陰性者方可用于實驗。家兔重要用于檢測猴來源細胞中與否存在B病毒污染，也可用兔腎細胞培養法替代。（4）逆轉錄病毒及其它內源性病毒或病毒核酸的檢測可采用下列辦法對MCB或WCB細胞、增殖到或超出生產用體外細胞齡限制代次的細胞進行逆轉錄病毒的檢測。①逆轉錄酶活性測定：采用敏感的辦法,如產品增強的逆轉錄酶活性測定法(PERT)法或其它敏捷度相稱的檢測逆轉錄酶的辦法檢測細胞培養液上清中逆轉錄酶活性。②透射電鏡檢查：收集待檢細胞，低速離心后，棄上清，沉淀中應含有1×107個細胞，且細胞存活率應不低于99%。在沉淀中加入固定劑，于4℃③感染性實驗：將待檢細胞感染逆轉錄病毒敏感細胞，培養后檢測。根據待檢細胞的種屬來源，須使用不同的敏感細胞進行感染性實驗。這三種辦法含有不同的檢測特性及敏捷度，因此應采用不同的辦法聯合檢測。若逆轉錄酶活性檢測陽性時，建議進行透射電鏡檢查及感染性實驗，以確證與否有感染性逆轉錄病毒顆粒存在。小鼠來源和其它嚙齒類來源的細胞系或其雜交瘤細胞系有可能攜帶潛在的逆轉錄病毒。因此，對于人-鼠雜交瘤細胞系則應進行特異性逆轉錄病毒檢測。如用于單克隆抗體生產的小鼠細胞系，則可不檢測特異性的逆轉錄病毒，但在生產工藝中應增加病毒滅活程序。（5）特殊外源病毒因子的檢測應對MCB或WCB的細胞進行特殊病毒的檢測。檢測病毒的種類應根據細胞系/株種屬、組織來源等擬定。如鼠源的細胞系，可采用小鼠、大鼠和倉鼠抗體產生實驗檢測其種特異病毒。人源的細胞系/株，則應檢測如人鼻咽癌病毒、人巨細胞病毒、人逆轉錄病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。在某些狀況下，也可能進行轉化病毒的檢測，如人乳頭瘤病毒、腺病毒及人單純皰疹病毒。這些病毒的檢測可采用適宜的體外檢測技術。5致瘤性檢查某些傳代細胞系已證明含有致瘤性，如來源于嚙齒類的細胞系BHK21，CHO，C127細胞等，或細胞類型屬致瘤性細胞，如雜交瘤細胞，則可不必作致瘤性檢查。某些傳代細胞系已證明在一定代次內不含有致癌性，而超出某代次則含有致瘤性，如VERO細胞，則必須進行致瘤性檢查。人上皮細胞系、人二倍體細胞株及全部用于活病毒疫苗生產的細胞系/株應進行致瘤性檢查。另外，新建細胞系/株必須進行致瘤性檢查。在某些狀況下，用于人體細胞治療及基因治療的細胞也須進行致瘤性檢查。將MCB或WCB的細胞增殖到或超出生產用體外細胞齡限制代次，再進行致瘤性實驗。”下述兩種致癌性實驗辦法可任選其一：①裸鼠最少10只，將細胞懸浮于適量無血清培養基中，使細胞濃度為5×107個細胞/ml，每只裸鼠皮下或肌內注射；同時用Hela或Hep-2細胞設立陽性對照，陽性對照組最少10只，每只注射含106個細胞；可用人二倍體細胞株作為陰性對照，陰性對照組最少10只，每只注射含1067個細胞。②新生小鼠(3~5日齡)，8~10g小鼠10只，在出生后第0天、2天、7天和第14天，分別用抗胸腺血清(ATS)或球蛋白解決，然后同上每只皮下接種107活細胞。并設立陽性對照組，對照組最少接種10只。成果鑒定：定時觀察并觸摸注射部位有無結節形成，且形成的任何結節均應進行雙向測量并統計。陽性對照組應最少有9只有進行性腫瘤生長時，實驗視為有效。如實驗組動物有進行性生長的結節或可疑病灶，應觀察最少1~2周；若出現的結節在觀察期內開始消退，則應在結節完全消退前，處死動物并進行解剖作病理及組織學檢查。④未發生結節的動物半數應觀察21天，剖檢，另外半數動物應觀察12周，進行病理檢查，剖檢接種部位，觀察各淋巴結和各器官有無結節形成，如有懷疑，進行病理組織檢查，不應有轉移瘤形成。除上述體內法外，也可采用軟瓊脂克隆形成實驗或器官培養實驗等體外法檢測，特別合用于在低代次時在動物體內無致瘤性的傳代細胞系。（四）生產用細胞培養生產用原材料的選擇和細胞操作環境應符合本規程‘細胞庫的建立’中有關規定。從凍存的WCB中取出一支或多支安瓿，混合后培養，傳至一定代次后供生產用。其代次不得超出該細胞用于生產的最高限定代次。生產用細胞的最高限定代次應根據研究成果擬定，但不得超出國際承認的最高限定代次。從WCB取出的細胞種子增殖的細胞不得再回凍保存后而再用于生產。體外培養細胞齡的計算二倍體細胞齡以細胞群體倍增（PopulationDoubling）計算，以每個培養容器細胞群體細胞數為基礎，每增加一倍作為一世代，即一瓶細胞傳二瓶(1:2分種率)，再長滿瓶為一世代；一瓶傳四瓶(1:4)為二世代；一瓶傳八瓶(1:8)則為三世代。生產用細胞齡限制在細胞壽命期限的前2/3內。傳代細胞系則以一定稀釋倍數進行傳代，每傳一次為一代。二、持續傳代細胞系的特殊規定傳代細胞系普通是由人或動物腫瘤組織或正常組織傳代或轉化而來，可懸浮培養或采用載體培養，能大規模生產。這些細胞可無限傳代，但到一定代次后，致瘤性會增強。因此對生產用傳代細胞系應進行嚴格檢查。應按本規程‘細胞的檢定’的規定進行細胞庫的檢查。對生產過程中細胞培養的規定以下：1．用于生產的細胞代次用于生產的傳代細胞系，生產代次應有一定限制。用于生物制品生產的細胞最高限定代次，須經同意。2．生產過程中細胞培養物檢查：對于病毒類制品，在生產末期，應按照本規程中的三.6（2）、（3）、（4）和（5）對生產對照用細胞進行檢查，并合格。對于在不同時間收集合并的培養物，應在每次收集時檢測對照細胞培養物。三、人二倍體細胞株的特殊規定新建的人二倍體細胞必須含有下列資料：建立細胞株所用胎兒的胎齡和性別、終止妊娠的因素、所用胎兒父母的年紀、職業及健康良好的證明（醫師出具的健康狀態良好、無潛在性傳染病和遺傳性疾患等證明），以及胎兒父系及母系三代應無明顯遺傳缺點疾病歷史的書面調查資料。人二倍體細胞株應在傳代過程的早期，選擇適宜世代水平（2-8世代）增殖出大量細胞，定量分裝后，置液氮中或–130℃下凍存，供建立PCB之用，待全部檢定合格后，即可正式定為PCB，供制備1．染色體檢查及鑒定原則新建人二倍體細胞株及其細胞庫必須進行染色體檢查。對于已建株的人二倍體細胞株，如WI-38、MRC-5、2BS，KMB17等，在建立MCB時可不必進行細胞染色體檢查。但如對細胞進行了遺傳修飾，則須按新建細胞株進行染色體檢查。（1）染色體檢查新細胞建株過程中，每8~12世代應作一次染色體檢查，一株細胞整個生命期內持續培養過程中，最少應有4次染色體檢查成果。每次染色體檢查，應最少隨機取1000個分裂中期細胞，進行染色體數目、形態和構造檢查，并作統計以備復查。其中最少選擇50個分裂中期細胞進行顯微攝影，作出核型分析，并應粗數500個分裂中期細胞，檢查多倍體的發生率。每次染色體檢查，應從同一世代的不同培養瓶中取細胞，混合后進行再培養，制備染色體標本片。染色體片應長久保存，以備復查。可用G分帶或Q分帶技術檢查50個中期細胞染色體帶型，應用攝影圖片作出帶型分析。（2）鑒定原則對1000個和500個中期細胞標本異常率進行檢查，合格的上限(可信限90%Poison法)如表2。表2人二倍體細胞染色體分析原則檢查細胞數異常1000500100染色單體和染色體斷裂47268構造異常17102超二倍體852亞二倍體*1809018多倍體**30174*亞二倍體如超出上限，可能因制片過程人為地丟失染色體，應選同批號標本重新計數。**一種中期細胞內超出53條染色體即為一種多倍體。2無菌檢查每8~12世代細胞培養物，應進行無菌檢查，依法檢查，應符合規定（附錄XIIA）。3支原體檢查每8~12世代細胞培養物，應進行支原體檢查，依法檢查，應符合規定（附錄XIIB）。4病毒檢查二倍體細胞株傳代過程中，最少對2個不同世代水平進行病毒包含體、乙型肝炎、丙型肝炎、EB病毒，艾滋病病毒進行檢查等，成果應均為陰性。5致瘤性檢查每8~12世代應作一次致瘤性檢查，（辦法見本規程‘致瘤性檢查’），成果應無致癌性。6生產過程細胞培養檢查（1）染色體檢查可根據制品特性及生產工藝，擬定與否進行生產過程中細胞培養的染色體檢查。普通含有活細胞的制品或下游純化工藝局限性的制品，應對所用細胞培養進行染色體檢查及評價。（見本規程“染色體檢查及鑒定原則”）但如采用已建株的人二倍體細胞生產，則不規定進行染色體核型檢查。（2）細胞鑒別實驗按本規程“細胞檢定”中細胞鑒別實驗進行。對于每個制品生產用細胞每年應最少進行一次該項檢定。（3）無菌檢查依法檢查，應符合規定（附錄XIIA）。（4）支原體檢查依法檢查，應符合規定（附錄XIIB）。（5）正常細胞外源病毒因子檢測制備病毒類制品時，于接種病毒的當天或在持續傳代的最后一次接種病毒時，留取此批細胞的5%(或不少于500ml)的細胞不接種病毒，換維持液作為正常細胞對照。與接種病毒的細胞在相似條件下培養，并按附錄ⅫC生產用細胞外源因子檢查項進行檢測。四、重組細胞的特殊規定重組細胞系通過DNA重組技術獲得的含有特定基因序列的細胞系，因此重組細胞系的建立應含有細胞基質構建辦法的有關資料，如細胞融合、轉染、篩選、集落分離、克隆、基因擴增及培養條件或培養液的適應性等方面的資料。細胞庫細胞的檢查應按本規程‘細胞的檢定’的規定進行，但還應進行下述檢查：1細胞基質的穩定性生產者須含有該細胞用于生產的目的基因的穩定性資料，涉及：重組細胞的遺傳穩定性、目的基因體現穩定性、目的產品持續生產的穩定性，以及一定條件下保存時細胞生產目的產品能力的穩定性等資料。2鑒別實驗除按本規程“細胞鑒別實驗”進行外，還應通過檢測目的蛋白基因或蛋白進行鑒別實驗。3重組細胞產物的外源病毒因子檢測應按本規程“細胞形態觀察及紅細胞吸附實驗”和“不同細胞傳代培養法檢病毒因子”的規定對細胞裂解物或收獲液及生產用培養基進行外源病毒因子的檢測。五、原代細胞的規定原代細胞應來源于健康的動物臟器組織或胚胎，涉及猴腎、地鼠腎、沙鼠腎、家兔腎、狗腎或動物的胎兒和其它組織以及雞胚和鵪鶉胚等正常組織，以適宜的消化液消化、分散組織細胞進行培養，原代細胞不能建立細胞庫，只能限于原始培養的細胞或傳代少數幾代內（普通1-5代內）使用，無法事先標定。因此，只能嚴格規范管理和操作方法，以確保以原代細胞為基質所生產的制品質量。（一）動物組織來源和其它材料1．動物組織來源應符合“凡例”的有關規定。對多個動物都應有明確健康狀況和干凈級別規定。2．生產或檢定用猴多采用非洲綠猴、恒河猴等，我國以恒河猴為主。應為正常健康猴，以籠養或小群混養。動物用于制備細胞前，應有6周以上的檢疫期，檢疫期中出現病猴或混入新猴，應重新檢疫。從外面新引入猴群應作結核菌素實驗及猴皰疹I型病毒(B病毒)的檢查。胎猴腎可用于生產，對其母猴應進行檢疫。（二）原代細胞培養物的檢查用于細胞制備的動物剖檢應正常，取留的器官組織亦應正常，如有異常，不能用于制備細胞。1．細胞培養原材料檢查及細胞培養操作按本規程“原材料的選擇”及“細胞培養操作的環境規定”進行。2．細胞培養物的檢查（1）細胞形態檢查細胞在接種病毒或用于生產前，其培養物均應進行外觀檢查和鏡檢，應無任何可疑、異常和病變，否則不得用于生產。（2）對照細胞檢查每批消化所得原代細胞留取5%(或最少500ml)懸液，不接種病毒，細胞濃度和解決均與生產制品過程相似，最少觀察14天，并作下列各項檢查，成果均應為陰性。①無菌檢查依法檢查，應符合規定（附錄XIIA）。②支原體檢查依法檢查，應符合規定（附錄XIIB）。③外源病毒污染的檢查對觀察到期的細胞，按本規程4（1）項“細胞形態觀察及血吸附實驗”和4（2）項“不同細胞傳代培養法檢測病毒因子”項進行外源病毒污染檢測。④原代細胞培養物特定病毒檢查原代猴腎細胞培養應檢查SV40病毒、猴艾滋病毒和B病毒。應用Vero或原代綠猴腎細胞、兔腎細胞檢查。地鼠腎原代細胞應用BHK21細胞培養檢查，觀察細胞形態，如有可疑應在同種細胞上盲傳一代繼續觀察。六、檢定用細胞的規定檢定用細胞是指生物制品制造過程中用于檢定的細胞，涉及原代細胞、持續傳代細胞或二倍體細胞，以及經特定基因修飾過的細胞。檢定用細胞的質量對檢定成果的鑒定含有重要的影響，因此，為確保檢定成果的有效性、可靠性及真實性，國家藥品檢定檢定機構和生物制品生產公司檢定部門所用的檢定用細胞應符合下列規定：（一）細胞資料檢定用細胞應含有明確的正當來源，及有關的來源證明資料。如使用傳代細胞系/株，應建立細胞庫體系，即主細胞庫及工作細胞庫，如細胞使用量較少，可建立單一細胞庫。各制品應根據其特性以及確保檢測成果的可靠性基礎上，在該細胞允許的最高限定代次內，規定對應檢定用細胞的代次范疇（應在擬定細胞代次的±1代范疇內）。檢定時從工作細胞庫復蘇細胞后，不能再回凍。應具體統計檢定用細胞建庫的過程，涉及細胞培養所用原材料的來源、批號，細胞生長液的配制辦法、使用濃度等，統計細胞的傳代及凍存過程，并建立細胞凍存及使用臺賬。（二）細胞檢定生物制品檢定用細胞應最少進行下列1-3項檢定，根據檢定用細胞用途的不同，還應按照4項下的有關規定進行有關的檢定。1、細胞鑒別實驗按本規程一（三）1項進行，或其它相適應的辦法，應確認為本細胞而無其它細胞的交叉污染。2、無菌檢查依法檢查，應符合規定（附錄XIIA）。3、支原體檢測依法檢查，應符合規定（附錄XIIB）。4.外源病毒污染檢查用于待檢樣品外源病毒污染檢查所用的細胞，應采用本規程一（三）4（2）項及4（3）項雞胚接種檢查，應無外源病毒污染。5、其它檢測：（1）致瘤性檢查：對于待檢樣品致瘤性檢查時所用的陽性對照細胞，應采用本規程一（三）5項進行檢查，應含有致瘤性。（2）病毒敏感性檢查：用于活病毒類待檢樣品病毒效價測定的檢定用細胞，應進行此項檢查，證明所用細胞含有足夠的對應病毒敏感性。（3）細胞功效檢查：用于待檢樣品生物學活性、效力或效價測定的檢定用細胞，應進行此項檢查，證明所用細胞能夠有效評價待檢樣品質量。附錄 逆轉錄酶活性檢查法

附錄IXM逆轉錄酶活性檢查法本法系以雀麥草花葉病毒RNA為模板，采用RT-PCR法擴增特定片段并用ELISA法檢測特異片段與探針的雜交信號，從而測定供試品中的逆轉錄酶活性。試劑(1)供試品稀釋液(A液)每1LA液含三羥甲基氨基甲烷－鹽酸（Tris-HCl,）25mmol,氯化鉀50mmol,二硫蘇糖醇(DTT)5mmol,四甲基乙二胺（EDTA）,TritonX-10025ml,甘油500ml。(2)供試品保存液(Ｂ液)每1LA液中含1mg亮抑蛋白酶肽、抑胃肽及1mg抑蛋白酶肽。(3)引物及探針序列上游引物：5’-Biotin-CGTGGTTGACACGCAGACCTCTTAC-3’下游引物：5’-TCAACACTGTACGGCACCCGCATTC-3’探針：5’-NH2ATTATCTGGCCTTTGAGAGTTACTCTTTG-3’(4)模板雀麥草花葉病毒RNA(BMVRNA)(5)反轉錄緩沖液每1L反轉錄緩沖液含Tris-HCl50mmol,氯化鉀40mmol,氯化鎂6mmol,DTT10mmol，脫氧核糖核苷酸200μmol,下游引物×10－3mmol。(6)擴增緩沖液每1L擴增緩沖液含Tris-HCl25mmol,氯化鉀40mmol,氯化鎂2mmol,脫氧腺嘌呤核糖核苷酸200μmol、脫氧胞嘧啶核糖核苷酸200μmol、脫氧鳥嘌呤核糖核苷酸200μmol及脫氧尿嘧啶核糖核苷酸200μmol,上、下游引物各×10－3mmol，核糖核酸酶A0.8g，TaqDNA聚合酶6×104U，尿嘧啶N－糖基化酶（UNG）4×104U