中華絨螯蟹血淋巴液電鏡制樣技術改進

血淋細胞的種類和數量與動物的生理狀態和免疫功能密切相關。了解血淋細胞的結構和功能對理論和實踐具有重要意義。目前,在該領域內,國外研究的對象主要集中于海產種類;國內有關蝦類血淋巴細胞的結構與功能也有一些報道,而關于中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)血淋巴細胞的超微結構僅成永旭等進行了報道,但只觀察到粒性細胞。本文作者在研究的中華絨螯蟹中發現3種類型血淋巴細胞,并對其超微結構特點和功能進行研究和探討,旨在了解這3類細胞在河蟹機體中的作用和功能。1透射電鏡觀察血淋巴和血淋巴中華絨螯蟹103只,分別取自江蘇蘇州東山、淮陰、常州、宜興等地河蟹養殖場,體重30~100g。用75%酒精體表消毒后,從基部截斷第4對步足,使血淋巴自動滴于干凈的載玻片上,待血淋巴凝固后放入4%戊二醛中固定12h,用0.3mol/L磷酸緩沖液(pH7.3)清洗3次,將凝聚的血塊切成0.5~1.0mm3小塊,用1%鋨酸固定2h,再用磷酸緩沖液清洗3次,丙酮梯度脫水,Epon812環氧樹酯包埋,Reichert-Jung超薄切片機超薄切片,厚度50~80nm,醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色,日立H-600透射電鏡觀察并照像。2結果根據透射電鏡觀察結果,中華絨螯蟹血淋巴細胞可分為3類(圖版Ⅰ-1)。2.1核型mds-n/c見圖版Ⅰ-2。細胞呈球形,數目最多,直徑5.6~7.2μm,胞質中無顆粒,核質比(N/C)最大,約3/5,核呈球形,居中,幾乎占滿整個細胞,核內幾乎無常染色質分布,異染色質高度濃縮且邊緣化,分布于核膜內側,核周腔擴大;胞質很少,只有薄薄一層,但線粒體相對較多,其余細胞器較少,有核糖體和少量內質網。2.2電子致密顆粒見圖版Ⅰ-3。細胞呈不規則卵圓形,短徑5.2~7.0μm,長徑8.0~10.2μm,外周常伸出偽足,胞質中含有圓形或卵圓形的電子致密顆粒,短徑0.1~0.2μm,長徑0.3~0.4μm。有的細胞中顆粒少而分散,有的細胞中顆粒多且分布均勻。其核質比(N/C)介于無顆粒細胞和大顆粒細胞之間,約1/6,核卵圓形或腎形,常位于細胞一側。核內常染色質較多,異染色質分布均勻,胞質中有許多大小不一的空泡,內質網、高爾基體發達。2.3電子致密顆粒的制備細胞呈卵圓形,短徑6.2~8.4μm,長徑9.2~12.4μm,在3類細胞中體積最大,邊緣不規則,也常見偽足。胞質中有較大的圓形電子致密顆粒,直徑1.4~2.0μm,遠遠大于小顆粒細胞中的顆粒,數目因不同細胞而異。其核質比(N/C)最小,約1/10,核腎形,偏向細胞一側,胞質中細胞器較少,有較大的空泡(圖版Ⅰ-4)。3討論與分析3.1無份細胞的數目在有關中華絨螯蟹血淋巴細胞超微結構的報道中,沒有發現非粒性細胞,可能是由于粒性細胞和非粒性細胞的比重不同,在離心過程中被分開。本實驗未進行離心處理,直接取血淋巴液固定、脫水、包埋,所以不會因離心提取而丟失血細胞成分,因而發現無顆粒細胞的數目較多(圖版Ⅰ-2)。常規制做電鏡觀察的血細胞樣品需離心處理,并用瓊脂預包埋,目的是為了收集血細胞并將其凝聚在一起。而中華絨螯蟹血淋巴極易凝固,不需再用瓊脂將其凝集在一起。本實驗利用這一特點,不進行預包埋,也不用離心處理,而是直接雙固定,避免了制樣過程中對血細胞的人為破壞和遺失。用此方法在3年時間里分別對11批樣品進行了處理,其結果顯示一致,表明該方法具有可靠的重復性,是蟹類血細胞電鏡制樣的有效方法。用改進方法制出的樣品,雖然細胞密度不高,但能較真實地再現各類血細胞的分布情況。本電鏡觀察的結果中,血細胞的種類及各類細胞的數量基本與我們血涂片的光鏡觀察結果以及在組織中(如鰓、心肌、結締組織等)的電鏡觀察結果相同。3.2種細胞的功能目前,對甲殼動物血淋巴細胞分類與命名的一般依據是血細胞胞質中顆粒的有無,顆粒的多少以及顆粒的大小。其命名大致分為:無顆粒細胞/透明細胞、小顆粒細胞/半顆粒細胞、大顆粒細胞/顆粒細胞。依照于建平對血細胞的分類,本文將中華絨螯蟹血淋巴細胞分為3類,即無顆粒細胞、小顆粒細胞和大顆粒細胞(圖版Ⅰ-1)。根據無顆粒細胞的形態特征分析,它的細胞核內基因復制、轉錄及轉錄初產物的加工等功能很微弱,這與高等動物的中幼紅細胞結構很相似。而該細胞胞質內線粒體數目相對較多,推斷其可能承擔一種耗能較多的生理機能,如物質轉運、代謝等。此外,該細胞數目在中華絨螯蟹血淋巴中最多,它們可能擔負著血液的能量轉換功能。小顆粒細胞表面有許多偽足樣突起,可能具有運動和吞噬能力。該細胞核內常染色質較多,內質網、高爾基體發達,表明細胞合成代謝活躍(圖版Ⅰ-3)。胞質中存在電子致密顆粒,而且有許多大小不一的空泡,分布于胞質周邊。上述特征均類似高等動物的單核細胞,因而其內部顆粒可能具有初級溶酶體的功能,可吞噬和消化異物,在機體免疫中起重要作用。大顆粒細胞也有偽足樣突起,可能也具有運動或吞噬能力。其結構特征與高等動物血液中的嗜酸性粒細胞很相近,可能也具有吞噬、殺菌能力。對于小顆粒細胞和大顆粒細胞胞質中出現的空泡,Cohen認為它是胞吐作用后留下的胞斑(Exocytoticdomain)。總之,中華絨螯蟹血淋巴的3種細胞具有各自特有的功能,