基因文庫(kù)(genelibrary)基因組文庫(kù)(genomiclibrary)cDNA文庫(kù)(cDNAlibrary)

第一節(jié)基因組文庫(kù)的構(gòu)建

定義：含有某種生物全部遺傳信息的重組DNA分子的克隆總和。一.基因組文庫(kù)的規(guī)模N—基因組文庫(kù)克隆總數(shù)P—所需機(jī)率N=f—插入片段與基因組DNA長(zhǎng)度之比

二．建立基因組文庫(kù)的一般程序

1．載體DNA片段的制備

DNA分離純化限制酶切脫磷酸化反應(yīng)

2．供體DNA片段的制備總DNA分離純化機(jī)械剪切法分離特定大小DNA片段酶法部分酶切分離特定大小DNA片段完全酶切

ln（1-P）ln（1-f）

三.

利用質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)該法簡(jiǎn)單、快速、易于操作，但僅適合一些低等真核生物和原核生物。四.

利用λ載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

1.載體DNA片段的制備方法:

左右臂DNA片段的獲得

2.供體DNA片段的制備:限制酶部分酶切，機(jī)械剪切法

3.重組DNA分子的形成：

控制克分子比率，使其形成串狀DNA分子

4.重組DNA分子的包裝

1）λDNA的包裝物的制備

使用的大腸桿菌菌株：E.coli

BHB2688(N205recA[λimm434cItsb2redEamSam/λ])-包裝蛋白E.coliBHB2690(N205recA[λimm434cItsb2redDamSam/λ])-頭部蛋白

i.

兩菌株分別培養(yǎng)，分別收集和制備，包裝前混合----本底低（對(duì)λDNA分子大小有嚴(yán)格限制），高效。ii.

兩菌株分別培養(yǎng)，混合收集和制備----操作簡(jiǎn)單，本底高，可包裝不同大小的λDNA分子。2）重組λDNA分子的包裝過程包裝制備物（-70℃）于冰上緩慢融化加入重組λDNA分子邊融化邊混合邊包裝離心除去細(xì)胞碎片λ顆粒于-70℃保存待用5.基因組文庫(kù)的擴(kuò)增

包裝的λ顆粒感染E.coli培養(yǎng)分離λ顆粒-70℃保存五.

利用COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

構(gòu)建過程與λ載體構(gòu)建過程相似:兩臂DNA片段的制備，供體DNA片段的制備，兩DNA的連接和重組DAN分子的包裝。單COS質(zhì)粒載體和雙COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)。為提高文庫(kù)質(zhì)量，可采取以下措施：

1.

雙酶切載體產(chǎn)生不同末端以避免其自身形成串狀體

2.供體DNA脫磷酸化以避免供體DNA間的連接導(dǎo)致重排

3.載體和供體DNA末端修飾以避免上述兩種情形發(fā)生載體DNAXhoIorSalI酶切補(bǔ)CT連接重組DNA供體DNASau3AI部分酶切補(bǔ)AG

4.采用文庫(kù)快速構(gòu)建法以避免擴(kuò)增文庫(kù)時(shí)DNA丟失利用單COS質(zhì)粒載體文庫(kù)利用雙COS質(zhì)粒載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

七.利用YAC載體構(gòu)建基因組文庫(kù)

1.兩臂DNA片段的制備:

pYAC4BamHI/EcoRI脫磷酸化

2.供體DNA片段的制備:

瓊脂糖凝膠-DNA樣品的制備EcoRI部分酶切脈沖場(chǎng)凝膠電泳片段回收和純化

3.DNA的連接

4.重組DAN分子的轉(zhuǎn)化:原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法

5.轉(zhuǎn)化子的保存:單菌落保存于96孔平板中酵母人工染色體構(gòu)建建立基因組文庫(kù)的載體

A鳥槍法5目的基因的克隆與基因文庫(kù)的構(gòu)建鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略鳥槍法操作的改進(jìn)鳥槍法克隆目的基因的局限性鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略

隨機(jī)克隆供體細(xì)胞的全基因組DNA片段，然后通過快速有效的篩選程序從眾多克隆中分離出含有目的基因的目的重組子，進(jìn)而獲得目的基因。鳥槍法適用于原核細(xì)菌目的基因的克隆分離

鳥槍法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略染色體DNA的切斷

超聲波處理：片段長(zhǎng)度均一，大小可控，平頭末端全酶切：

片段長(zhǎng)度不均一，粘性末端便于連接，但可能使基因斷開。部分酶切：

片段長(zhǎng)度可控，含有粘性末端，目的基因完整

與載體連接

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇多拷貝克隆載體;如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇表達(dá)型載體轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞

如果轉(zhuǎn)化子采用菌落原位雜交法或限制性酶切圖譜法篩選，則選擇大腸桿菌作為受體細(xì)胞；如果轉(zhuǎn)化子采用基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法篩選，則選擇能使目的基因表達(dá)的受體細(xì)胞篩選含有目的基因的目的重組子

菌落原位雜交法、基因產(chǎn)物功能檢測(cè)法（篩選模型的建立）鳥槍法操作的改進(jìn)使用這一改進(jìn)方法的前提條件是：目的基因的酶切圖譜已知。如果已知目的基因兩端的酶切口，可用該酶處理染色體DNA，然后與載體拼接，這樣可以保證目的基因的完整性，從而提高重組子中目的重組子的出現(xiàn)頻率

使用特征性限制性內(nèi)切酶切開染色體DNA

鳥槍法操作的改進(jìn)例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，將染色體DNA用SalI切開，瓊脂糖凝膠電泳分離，用刀片切下相當(dāng)于1.6-2.0

kb大小區(qū)域內(nèi)的凝膠塊，從此凝膠塊中回收DNA片段，然后與載體進(jìn)行拼接在連接前將DNA片段進(jìn)行分級(jí)分離

2.0kb1.6kb1.8kb鳥槍法操作的改進(jìn)凍融法濾紙法吸附法低融點(diǎn)凝膠法溶解法凝膠DNA片段回收技術(shù)

鳥槍法克隆目的基因的局限性工作量較大，需要了解目的基因的背景知識(shí)不能獲得的最小長(zhǎng)度的目的基因不能除去真核生物目的基因的內(nèi)含子結(jié)構(gòu)第二節(jié)cDNA文庫(kù)的建立定義：從一定生長(zhǎng)階段或條件的某種細(xì)胞分離到的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA后再重組和增殖所產(chǎn)生的無(wú)性繁殖系的總和。一．cDNA文庫(kù)的特點(diǎn)

1.基因特異性常來自結(jié)構(gòu)基因，因此僅代表某種生物的一小部分遺傳信息，且只代表那些正在表達(dá)的基因的遺傳信息：1—5%mRNA，80—85%rRNA，10—15%tRNA

2.器官特異性不同器官或組織的功能不一樣，因而有的結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)就具有器官特異性，故由不同器官提取的mRNA所組建的cDNA文庫(kù)也就不同4.不均勻性

在同一個(gè)cDNA文庫(kù)中，不同類型的cDNA分子的數(shù)目是大不相同的，盡管它們都是由單拷貝基因轉(zhuǎn)錄而來的。這與基因組文庫(kù)中的單拷貝基因均具有相同的克隆數(shù)相較，這是兩種文庫(kù)的另一差別。

5.各cDNA均可獲得表達(dá)（一般選用的載體都是表達(dá)型的）3.代謝或發(fā)育特異性處于不同代謝階段（或發(fā)育階段）的結(jié)構(gòu)基因表達(dá)亦不相同

二.cDNA文庫(kù)的規(guī)模N=f為某一特定cDNA（mRNA）的分子數(shù)目與全部cDNA（mRNA）分子數(shù)目之比三.建立cDNA文庫(kù)的一般程序

1.載體DNA片段的制備2.多聚（A）RNA的分離與純化3.雙鏈cDNA的合成

1）單鏈cDNA的合成：反轉(zhuǎn)錄法2）第二條cDNA的合成：堿解或酶解（RNaseH）法除去RNA分子ln(1―p)ln(1―f)

RNaseH酶解取代法cDNA法克隆目的基因的基本戰(zhàn)略mRNAcDNA第一鏈的合成

5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH

3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’cDNA第一鏈引物退火逆轉(zhuǎn)錄酶dNTPscDNA第二鏈的合成

煮沸NaOH自身引導(dǎo)法：獲得的雙鏈cDNA5’端會(huì)有幾對(duì)堿基缺失AAAAAAAAAAAAAA5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp

5’TTTTTTTTTTTTTTp5’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTOH

3’KlenowdNTPsS1cDNA第二鏈的合成

DNApoldNTPsRNaesH置換合成法：獲得的雙鏈cDNA5’端也會(huì)有幾對(duì)堿基缺失5‘ppp’5G

G

AAAAAAAAAAAAAAOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’AAAAAAAAAAAAAAp

5’5’S1AAAATTTOH3’TTTTTTTTTTTTTTp5’5’TTTTTTTTTTTTTTOH3’AAAAAAAAAAAAAA

5’5’TTTTTTTTTTTTTT

3’3’T4-DNAligasecDNA第二鏈的合成

dCTPTdT引導(dǎo)合成法：獲得的雙鏈cDNA能保留完整的5’端序列5‘ppp’5G

G

AAAAAOH

3’TTTTTp

5’3‘

HO5‘ppp’5G

G

AAAAACCCCCCCOH

3’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’5‘

pGGGGGGG3‘

HOCCCCCCCTTTTTp

5’