17.1.1動物細胞的一般特征17.1.

2昆蟲表達系統17.1.

3哺乳動物細胞表達系統第一節制藥動物細胞的表達與特征動物細胞培養動物細胞的表達與特征17.1.1動物細胞的一般特征17.1.2昆蟲表達系統171

沒有細胞壁細胞膜細胞質細胞核細胞器17.1.1動物細胞的一般特征1、結構與功能動物細胞培養動物細胞的表達與特征沒有細胞壁17.1.1動物細胞的一般特征1、結構與功能動2

葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代謝的前提葡萄糖代謝：糖酵解為主，生成丙酮酸和乳酸，乳酸分泌到細胞外并在培養液中積累；經TCA循環，徹底氧化產生CO2和H2O。一小部分為戊糖磷酸途徑，生成四、五、七碳糖和NADPH

中間產物進入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝葡萄糖代謝旺盛，產生大量的乳酸，對細胞有毒性葡萄糖限制：增加谷氨酰胺消耗以補償，反之亦然2、細胞代謝特性—糖代謝動物細胞培養動物細胞的表達與特征葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代謝的前提2、細胞代謝特性—糖3

谷氨酰胺：脫氨、轉氨等，合成其它非必須氨基酸離體動物細胞，轉氨是主要代謝途徑；谷氨酰胺與丙酮酸發生轉氨作用，生成丙氨酸，進入培養液并積累。脫氨產生的氨，對細胞有毒性。谷氨酰胺是動物細胞的氮源，受限制時，通過增加其它氨基酸的消耗得以補償。流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整個代謝過程，避免有毒廢物積累。2、細胞代謝特性—氨基酸代謝動物細胞培養動物細胞的表達與特征谷氨酰胺：脫氨、轉氨等，合成其它非必須氨基酸2、細胞代謝特4

蛋白質合成場所：糖基化場所：內質網合成各種糖類，在粗糙內質網腔內和高爾基體進行加工修飾。不同細胞系糖基化特征不同，選擇適宜細胞系。對于分泌型蛋白，分泌泡與細胞膜融合，釋放到胞外，完成了蛋白質的分泌表達。3、蛋白質糖基化與分泌表達動物細胞培養動物細胞的表達與特征蛋白質合成場所：3、蛋白質糖基化與分泌表達動物細胞培養動5

昆蟲桿狀病毒如核多角體病毒可攜帶外源基因，感染昆蟲細胞或幼蟲（宿主），高水平表達外源蛋白質。研究進展

1983年，苜蓿尺蠖核多角體病毒—秋黏蟲細胞表達系統

1984年，家蠶核多角體病毒—家蠶幼蟲表達系統17.1.

2昆蟲表達系統動物細胞培養動物細胞的表達與特征昆蟲桿狀病毒如核多角體病毒可攜帶外源基因，感染昆蟲細胞或幼6

安全：桿狀病毒無致病性，產品安全性接受FDA認可易飼養：家蠶發育快、遺傳背景清楚高量表達：外源基因超量表達；不連續且時間短高效表達：對外源基因有很大的容量（可插入100kb的DNA）可作為重組病毒的選擇性標記，是因為外源基因的插入并不影響病毒的增殖，卻喪失合成多角體的能力。翻譯后加工：昆蟲細胞能進行一系列翻譯后的加工，與哺乳動物不同重組率低：篩選困難、周期長，需要4-10d優點與不足動物細胞培養動物細胞的表達與特征安全：桿狀病毒無致病性，產品安全性接受FDA認可優點與不7

重組率低、篩選困難、周期長，需要4-10d

研究開發的主要方向：有效的病毒表達系統決定基因表達時期啟動子，無血清培養昆蟲細胞系動物細胞培養動物細胞的表達與特征重組率低、篩選困難、周期長，需要4-10d動物細胞培養動物8

基于細胞來源：原代細胞、傳代細胞基于細胞壽命：有限細胞系、無限細胞系基于細胞的染色體數目：二倍體細胞系、異倍體細胞系基于獲得方式：工程細胞系、癌變細胞系基于生長特性：貼壁依賴性、非貼壁依賴性1、細胞系的分類動物細胞培養動物細胞的表達與特征17.1.

3哺乳動物細胞表達系統基于細胞來源：原代細胞、傳代細胞1、細胞系的分類動物細9

概念：從動物體內直接分離得到的細胞。特點：生長分裂不旺盛，與體內細胞相似應用：藥物檢測實驗，藥理研究。生產藥品：雞胚細胞，兔或鼠腎細胞、淋巴細胞。1）原代細胞動物細胞培養動物細胞的表達與特征概念：從動物體內直接分離得到的細胞。1）原代細胞動物細胞培10

概念：原代細胞轉接后培養的細胞。特點：細胞分裂增殖旺盛，二倍體核型。二倍體細胞系：原代細胞經過傳代、篩選、克隆、純化后，獲得具一定特征的細胞系。藥品生產：WI－38、MRC－5等。2）傳代細胞動物細胞培養動物細胞的表達與特征概念：原代細胞轉接后培養的細胞。2）傳代細胞動物細胞培養動11

概念：是生長和壽命有限的細胞，經過若干傳代培養后失去增殖能力，老化死亡。特點：有限生長，無致瘤性，有接觸抑制性舉例：WI-38、MRC-5等用于藥品生產，曾經廣泛使用壽命：取決于細胞來源的物種和年齡、器官。人細胞最高培養次數50-60代。胚成纖維細胞：人，50代；雞胚30代；小鼠，8代。3）有限細胞系動物細胞培養動物細胞的表達與特征概念：是生長和壽命有限的細胞，經過若干傳代培養后失去增殖能12

概念：是壽命和活性不受傳代次數影響的細胞系，可連續培養特點：沒有接觸抑制性，對培養條件和營養因子要求低，倍增時間短，適合制藥工業生產理想的藥物生產細胞系4）無限細胞系動物細胞培養動物細胞的表達與特征概念：是壽命和活性不受傳代次數影響的細胞系，可連續培養4）13

概念：采用基因工程技術對宿主細胞的遺傳物質進行了修飾改造或重組，獲得具有穩定遺傳的獨特性狀的細胞系。方法：正常細胞異倍體化；融合或重組。5）工程細胞系動物細胞培養動物細胞的表達與特征

概念：采用基因工程技術對宿主細胞的遺傳物質進行了修飾改造或重組，獲得具有穩定遺傳的獨特性狀的細胞系。方法：正常細胞異倍體化；融合或重組。5）工程細胞系概念：采用基因工程技術對宿主細胞的遺傳物質進行了修飾改造或14

概念：染色體的斷裂變成異倍體，失去了正常細胞的特點，而獲得了無限增殖的能力。特點：長期培養，倍增時間短，對培養條件和生長因子等要求較低，適于大規模工業化生產。6）轉化細胞系動物細胞培養動物細胞的表達與特征概念：染色體的斷裂變成異倍體，失去了正常細胞的特點，而獲得15Namalwa：類淋巴母細胞，非整倍體，懸浮生長。英國Wellcome公司Sendai病毒誘導，大規模生產a-干擾素。

WI-38：二倍體成纖維細胞系，壽命有限。貼壁生長，對許多病毒敏感，第一個被用于制備疫苗

MRC-5：二倍體成纖維細胞系，生長較WI-38快，對逆境有一定的抗性，用于制備疫苗2、生產用的細胞系1）人源細胞系動物細胞培養動物細胞的表達與特征Namalwa：類淋巴母細胞，非整倍體，懸浮生長。英國W16CHO細胞：Chinesehamsterovary

特點：貼壁生長，也可懸浮培養，對剪切力和滲透壓有較高的忍耐能力最為普遍和成熟表達糖基化蛋白質藥物的細胞。多種衍生突變株，高表達。藥物：tPA、EPO、HBsAg、凝血因子Ⅷ、DNA

酶I等2）哺乳動物細胞系動物細胞培養動物細胞的表達與特征CHO細胞：Chinesehamsterovary2）17

骨髓瘤細胞與產生抗體的B細胞融合而構成的細胞特點：無血清培養基中高密度懸浮生長，容易轉染和生長，大量分泌和高效表達。單克隆抗體的制備。3）雜交瘤細胞系動物細胞培養動物細胞的表達與特征骨髓瘤細胞與產生抗體的B細胞融合而構成的細胞3）雜交瘤細胞18

病毒載體：逆轉錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒質粒穿梭載體：由質粒和表達篩選盒組成動物細胞中的篩選功能3、動物細胞的表達載體動物細胞培養動物細胞的表達與特征病毒載體：逆轉錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒3、動物細19

對培養條件要求苛刻：無細胞壁，對周圍環境十分敏感，理化因素易受傷害對培養基要求高：完全異養，容易利用，相對低分子量的營養物產物：接近天然結構的活性分子，產品與天然的產物一致；有潛在的血源性污染的危險工藝：難度大、產量低、成本高；分離純化簡單4、表達特點動物細胞培養動物細胞的表達與特征對培養條件要求苛刻：無細胞壁，對周圍環境十分敏感，理化因素20第十七章動物細胞培養制藥工藝第一節制藥動物細胞的表達與特征第二節基因工程動物細胞系的構建第三節動物細胞培養基制備第四節動物細胞培養技術第五節培養過程檢測與工藝控制第十七章動物細胞培養第一節制藥動物細胞的表達與特征2117.2.1表達載體的設計與構建17.2.

2轉染與培養17.2.

3篩選與鑒定

第二節基因工程動物細胞系的構建動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系17.2.1表達載體的設計與構建17.2.2轉染與培養1722

病毒載體：牛痘病毒：構建多價疫苗腺病毒、逆轉錄病毒：基因治療桿狀病毒：外源基因表達（昆蟲）質粒載體：穿梭載體，細菌體內擴增，在動物細胞中表達。1、載體類型17.2.1表達載體的設計與構建動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系病毒載體：1、載體類型17.2.1表達載體的設計與構23

基本過程：與基因工程微生物相同區別：表達原件，啟動子、終止子、增強子、選擇標記2、啟動子和復制子動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系

基本過程：與基因工程微生物相同區別：表達原件，啟動子、終止子、增強子、選擇標記2、啟動子和復制子

基本過程：與基因工程微生物相同區別：表達原件，啟動子、終止子、增強子、選擇標記基本過程：與基因工程微生物相同2、啟動子和復制子動物24

轉錄起始序列和ATG起始密碼ATG的5′端約15bp范圍側翼序列內不含堿基T在-3，-6和-9位置，偏好G堿基在-3，-6和-9位置，整個側翼序列區偏好C堿基3、轉錄起始序列動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系轉錄起始序列和ATG起始密碼3、轉錄起始序列動物細胞254、終止子動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系

終止密碼子：T(U)AA，T(U)AG，T(U)GAPolyA信號序列：不宜太長，避免能量過度消耗常用：SV40PolyA(131)、BGH的PolyA（225bp）終止序列：加尾信號序列AAT(U)AAA或連續的終止密碼

UGA、UAA和UAG，防止轉錄通讀，使轉錄在正確位點結束。增強子：在轉錄起始點上游或下游使用，有利于提高外源基因的轉錄水平。4、終止子4、終止子動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基26

轉染指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程一類是瞬時轉染，一類是穩定轉染（永久轉染）。

17.2.

2轉染與培養動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系轉染指真核細胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標志的過程27

外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中可存在多個拷貝數，產生高水平的表達

。特點：只持續幾天17.2.

2轉染與培養動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系1、瞬時轉染外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個宿主細胞中28

外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（episome）存在的表達

。特點：持續時間長。17.2.

2轉染與培養動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系2、穩定轉染外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體（29動物細胞培養轉染方法原

理應

用特

點DEAE-葡聚糖法帶正電的DEAE-葡聚糖與帶負電的核酸磷酸骨架相互作用形成復合物,通過細胞內吞作用進入細胞瞬時轉染相對簡便,結果可重復,但對細胞有一定的毒副作用,轉染時需去除血清磷酸鈣法磷酸鈣-DNA復合物吸附于細胞膜,被細胞內吞穩定轉染,瞬時轉染操作簡便,但重復性差,不適用于原代細胞及某些培養細胞陽離子脂質體法帶正電的脂質體與帶負電的核酸磷酸骨架形成復合物,被細胞內吞穩定轉染、瞬時轉染轉染效率高，重復性好，但轉染時需去除血清，轉染效果隨細胞類型變化大逆轉錄病毒介導法通過感染宿主細胞將外源基因整合到染色體中穩定轉染用于難轉染的細胞，如原代細胞，但攜帶基因不能太大，操作復雜，耗時。腺病毒介導法通過感染宿主細胞將外源基因整合到染色體中瞬時轉染特定宿主細胞可用于難轉染的細胞電穿孔法高脈沖電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜的小孔導入穩定轉染、瞬時轉染適用于所有細胞，但細胞致死率高，DNA和細胞用量大。基因槍法將DNA用顯微重金屬顆粒沉淀,再將包被好的顆粒用彈道裝置射入細胞瞬時轉染可用于人的表皮細胞、成纖維細胞、淋巴細胞系及原代細胞顯微注射法通過顯微操作將DNA直接注入靶細胞核穩定轉染瞬時轉染轉染細胞數有限，多用于基因工程改造動物細胞培養轉染方法原

理應

用特

點DEAE-30

外源基因轉染方法：化學、物理和生物的方法人工脂質體法原理：動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系脂質體是磷脂分散在水中時形成的脂質雙分子層，又稱為人工生物膜。最初，人們只是運用脂質體模擬生物膜，研究膜的構造及功能，從而發現了膜的融合及內吞作用，因而可用作外源物質進入細胞的載體。陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用將DNA分子包裹人內，形成DNA一脂復合體，也能被表面帶負電荷的細胞膜吸附，再通過膜的融合或細胞的內吞作用，偶爾也通過直接滲透作用，將DNA傳遞進入細胞，形成包涵體或進入溶酶體，其中一小部分DNA能從包涵體內釋放，并進入細胞質中，再進一步進入核內轉錄、表達。外源基因轉染方法：化學、物理和生物的方法動物細胞培養基因31

外源基因轉染方法：化學、物理和生物的方法人工脂質體法方法：動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系細胞制備：105的培養平板，CO2培養箱37℃培養20h。脂質體制備：DNA與脂質體混勻，室溫下10min。轉染培養：培養基DNA脂質體培養6-7h棄去培養基DMSO無血清培養基洗滌2-3次

血清培養基外源基因轉染方法：化學、物理和生物的方法動物細胞培養基因32

擴增培養：非選擇性培養基，1-2d，轉染DNA表達篩選培養：1:15選擇性培養基，2-4d更換培養基，篩選陽性菌株

2-3周，獲得單克隆細胞集落鑒定：對獨立集落進行穩定性、表達量、生物活性等鑒定。17.2.

3篩選與鑒定動物細胞培養基因工程動物細胞系動物細胞培養基因工程動物細胞系擴增培養：非選擇性培養基，1-2d，轉染DNA表達17.33第十七章動物細胞培養制藥工藝第一節制藥動物細胞的表達與特征第二節基因工程動物細胞系的構建第三節動物細胞培養基制備第四節動物細胞培養技術第五節培養過程檢測與工藝控制第十七章動物細胞培養第一節制藥動物細胞的表達與特征34動物細胞培養細胞培養基制備第三節動物細胞培養基制備17.3.1培養基組成成分17.3.

2培養基種類17.3.

3培養基質量控制動物細胞培養細胞培養基制備第三節動物細胞培養基制備17.35糖類、必需氨基酸、維生素、無機鹽類、生長因子及激素、結合蛋白質、貼附與伸展因子及其它附加成分等。17.3.1培養基組成成分動物細胞對培養基的要求高，不同細胞系的要求也不盡相同，要盡可能提供與體內生活條件接近的培養環境。動物細胞培養細胞培養基制備糖類、必需氨基酸、維生素、無機鹽類、生長因子及激素、結合蛋白36

糖類提供細胞生長的碳源和能源，分解后釋放出能量ATP。不同細胞對葡萄糖利用相似，在無氧條件下還產生乳酸等有機酸。不能利用：多糖、雙糖、寡糖等聚合物。利用：單糖單體化合物。主要是葡萄糖1、糖類動物細胞培養細胞培養基制備糖類提供細胞生長的碳源和能源，分解后釋放出能量ATP。不37

氮源作用：主要是構成含氮化合物不能利用：多肽、蛋白質等高分子聚合物。利用：氨基酸等單體化合物。

12種是必需氨基酸：Arg、Cys、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val。必須在培養基中添加，才能滿足細胞的生長2、氨基酸動物細胞培養細胞培養基制備氮源作用：主要是構成含氮化合物2、氨基酸動物細胞培養細胞38

作用：一類微量的小分子有機物，既不是細胞的物質基礎，也不是能量物質，但對代謝和生長起調節和控制作用。水溶性維生素：B族維生素和維生素C

脂溶性維生素：維生素A、D、E、K四種。3、維生素動物細胞培養細胞培養基制備作用：一類微量的小分子有機物，既不是細胞的物質基礎，也不是39

作用：細胞代謝所需酶的輔基，調節酶活性，細胞構成成分參與生理活動。維持水平衡、保持滲透壓和酸堿平衡。胞外無機鹽對維持正常生長環境很重要。4、無機鹽類動物細胞培養細胞培養基制備作用：細胞代謝所需酶的輔基，調節酶活性，細胞構成成分4、無40

激素：調節細胞的生長（刺激作用），胰島素。貼附因子：細胞的貼壁生長必需，如膠原。脂類化合物：不飽和脂肪酸，如亞油酸、固醇等。載體蛋白：鐵離子。5、激素與附加成分動物細胞培養細胞培養基制備激素：調節細胞的生長（刺激作用），胰島素。5、激素與附加成4117.3.

2培養基種類

天然培養基合成培養基無血清培養基動物細胞培養細胞培養基制備17.3.2培養基種類天然培養基動物細胞培養細胞培養基制42

概念：直接取自于動物組織提取液或體液作為培養基種類：血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液特點：營養價值高，許多細胞系和原代及傳代培養缺點：成分復雜，不穩定，來源受到限制，不宜大量生產使用。具有血源性污染的可能性，病毒、支原體污染分離純化：增加難度。增加成本：工業化生產使用受限。1、天然培養基動物細胞培養細胞培養基制備概念：直接取自于動物組織提取液或體液作為培養基1、天然培養43

概念：用化學成分明確的試劑配制的培養基。組成：糖、氨基酸、無機鹽、維生素及其他成分。特點：組分穩定，容易配制。缺點：培養基中須添加5％-20％血清，才能培養。已有幾十種合成培養基，大部分已商品化。如MEM、BME、DMEM、IMEM、HAMF12、PRMI1640、M1992、合成培養基動物細胞培養細胞培養基制備概念：用化學成分明確的試劑配制的培養基。2、合成培養基動44血清成分與作用

含有基本的營養成分：補充合成培養基成分的不足脂肪酸和微量元素：細胞生長所必需，磷脂質、膽固醇、前列腺素E，銅、鋅、鈷、鉬、硒。激素和生長因子：細胞增殖、分化，胰島素、胰島素樣生長因子、表皮生長因子、皮質醇、雌二醇。貼附和伸展因子：細胞貼壁所需，纖維結合蛋白、軟骨素、膠原等。載體蛋白：白蛋白、轉鐵蛋白，金屬、激素、維生素和脂類結合，帶入細胞動物細胞培養細胞培養基制備血清成分與作用含有基本的營養成分：補充合成培養基成分的不45血清成分與作用

蛋白酶抑制劑：降解細胞死亡釋放的蛋白質；消除毒素和金屬的毒性。蛋白質：抗機械剪切，保護細胞免于損傷的作用緩沖物質：K、Na、Cl、Fe、Ca、葡萄糖等，穩定pH和滲透壓來源：胎牛血清、新生牛或成牛血清、馬血清、雞血清、羊血清及人血清。應用于許多細胞系和原代及傳代細胞培養。動物細胞培養細胞培養基制備血清成分與作用蛋白酶抑制劑：降解細胞死亡釋放的蛋白質；消46

概念：不添加血清、使細胞能在體外生長繁殖的的合成培養基。組成：合成培養基基礎之上，添加激素與生長因子、結合蛋白、貼壁與伸展因子、低分子量營養因子。特點：提高了培養的質量，避免血清帶來的麻煩，產品純化容易，組分穩定，大量配制。商品化的培養基：3、無血清培養基動物細胞培養細胞培養基制備概念：不添加血清、使細胞能在體外生長繁殖的的合成培養基。34717.3.

3培養基質量控制

培養用水質緩沖液生理鹽水和平衡鹽溶液其他成分配制動物細胞培養細胞培養基制備17.3.3培養基質量控制培養用水質動物細胞培養細胞培養48

必需使用純凈水配制培養基水存放時間不宜超過2周普通水必需除去各類元素、有毒或有害物質及微生物和熱源，達到純凈水標準。1、培養用水質動物細胞培養細胞培養基制備必需使用純凈水配制培養基1、培養用水質動物細胞培養細胞培養49

弱酸與弱酸鹽：碳酸氫鈉/碳酸體系弱堿與弱堿鹽：磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉體系作用：pH恒定。2、緩沖液動物細胞培養細胞培養基制備弱酸與弱酸鹽：碳酸氫鈉/碳酸體系2、緩沖液動物細胞培養細50

生理鹽水：調節滲透壓的鹽溶液，0.9%NaCl等滲能力平衡鹽溶液：BSS

由生理鹽水，緩沖劑與指示劑、無機鹽、葡萄糖等成分。作用：滿足細胞對鹽離子營養的要求；pH和滲透壓的環境要求；直觀觀察pH。加入酚紅指示劑，酸性黃色、中性櫻桃紅、堿性紫紅色。3、生理鹽水和平衡鹽溶液動物細胞培養細胞培養基制備生理鹽水：調節滲透壓的鹽溶液，0.9%NaCl等滲能力351

用量：使用L-型氨基酸，對于DL-混合型氨基酸，使用量應該加倍。谷氨酰胺很不穩定：單獨配制溶液。

Gln濃度：100倍濃縮液，－20℃保存一般培養液中含量為1～4mmol/L。4、氨基酸的配制動物細胞培養細胞培養基制備用量：使用L-型氨基酸，對于DL-混合型氨基酸，使用量應該52

不含葡萄糖的溶液常規高壓滅菌。含葡萄糖時，采用過濾除菌；或115℃，15min

血清使用：需要滅活（56℃，30min），過濾滅菌，按一定比例加入。4℃保存。出現沉淀、混濁時，要重新配制。5、培養基的滅菌動物細胞培養細胞培養基制備不含葡萄糖的溶液常規高壓滅菌。5、培養基的滅菌動物細胞培53第十七章動物細胞培養制藥工藝第一節制藥動物細胞的表達與特征第二節基因工程動物細胞系的構建第三節動物細胞培養基制備第四節動物細胞培養技術第五節培養過程檢測與工藝控制第十七章動物細胞培養第一節制藥動物細胞的表達與特征54動物細胞培養第四節動物細胞培養技術動物細胞培養技術17.4.1動物細胞生長和基質依賴性17.4.

2動物細胞培養基本過程17.4.

3動物細胞大規模培養方法17.4.

4動物細胞培養操作方式動物細胞培養第四節動物細胞培養技術動物細胞培養技術17.55動物細胞培養動物細胞培養技術17.4.1動物細胞生長和基質依賴性

生長基質接觸抑制貼壁依賴性細胞非貼壁依賴性細胞兼性貼壁細胞動物細胞培養動物細胞培養技術17.4.1動物細胞生長和基質依56

概念：改變介質表面特性，促進細胞貼附的物質。作用：為介質表面提供適量帶電荷，細胞被吸附在介質上，實現貼壁生長。原理：細胞、玻璃和塑料介質表面帶負電荷；要使細胞貼壁，必須進行二價陽離子、糖蛋白或其它試劑交聯，使之表面帶正電荷。天然生長介質：胞外基質成分，膠原。人工生長介質：多聚賴氨酸1、生長基質動物細胞培養動物細胞培養技術概念：改變介質表面特性，促進細胞貼附的物質。1、生長基質57

概念：細胞在生長基質上分裂增殖，逐漸匯集成片，當每個細胞與其周圍的細胞互相接觸時，細胞就停止增殖。特點：保持充足的營養，細胞仍可存活一段時間，但細胞密度不再增加。有：大多數細胞無：少數懸浮培養細胞（癌細胞）2、接觸抑制培養基中的生長因子耗盡時也會產生生長抑制，所以將正常細胞因相互接觸而抑制分裂的現象改稱為密度依賴性的生長抑制。細胞膜上有糖類和蛋白質共同構成的糖蛋白，也叫做糖被，他在細胞上起識別作用。當細胞增殖到一定程度，也就是互相挨在一起的時候，糖蛋白識別了這種信息，就會使細胞停止繼續繁殖，這種現象就叫做接觸抑制。動物細胞培養動物細胞培養技術概念：細胞在生長基質上分裂增殖，逐漸匯集成片，當每個2、58

概念：生長需要在適量帶電荷的固體或半固體支持表面，細胞自身分泌或人為在培養基中加入貼附因子，使細胞依附在支持物表面，才能生長和增殖。大多數動物細胞都屬于此類，細胞對培養用器皿的附著能力的不同就是細胞貼壁性能代表了細胞的活力。3、貼壁依賴性細胞動物細胞培養動物細胞培養技術概念：生長需要在適量帶電荷的固體或半固體支持表面，細胞自身594、非貼壁依賴性細胞動物細胞培養動物細胞培養技術4、非貼壁依賴性細胞

概念：生長不依賴于固體支持物表面，可在培養液中懸浮生長，有時被稱為懸浮細胞。血液、淋巴細胞、腫瘤細胞和某些轉化細胞屬于此類，生長干擾素的Namalwa細胞。4、非貼壁依賴性細胞動物細胞培養動物細胞培養技術4、非貼壁60

概念：對支持物的依賴性不嚴格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。如：CHO細胞、BHK細胞。理想的藥物生產細胞系5、兼性貼壁依賴性細胞動物細胞培養動物細胞培養技術概念：對支持物的依賴性不嚴格，既可貼壁生長，也可懸浮生長。6117.4.

2動物細胞培養基本過程

原代細胞分離與培養傳代細胞培養細胞系的保存與復蘇動物細胞培養動物細胞培養技術17.4.2動物細胞培養基本過程原代細胞分離與培養動物細621、原代細胞分離與培養動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離心或過濾培養液稀釋細胞洗滌接種培養

從體內取出組織或器官經過粉碎、消化而獲得單細胞進行體外接種培養。

37℃消化，胰蛋白酶，膠原酶消化液濃度：0.1-0.3mg/ml動物細胞培養動物細胞培養技術1、原代細胞分離與培養動物組織或器官洗滌粉碎酶解消化離63動物細胞培養動物細胞培養技術動物細胞培養動物細胞培養技術64動物細胞培養動物細胞培養技術動物細胞培養動物細胞培養技術65動物細胞培養動物細胞培養技術動物細胞培養動物細胞培養技術66動物細胞培養動物細胞培養技術動物細胞培養動物細胞培養技術67動物細胞培養動物細胞培養技術動物細胞培養動物細胞培養技術68動物細胞培養動物細胞培養技術動物細胞培養動物細胞培養技術692、傳代培養--過程

概念：對長滿表面的細胞進行消化分離，接種到新的培養基上，進行新一輪培養。傳代時期：剛剛全部匯合的細胞。過早產量低，過晚健康狀態不佳。消化方法：過程與原代細胞相同。用30－50倍體積的0.25％胰蛋白酶和EDTA對細胞塊消化，消化后再培養。要注意消化程度，細胞對酶的反應不同，有的敏感，掌握好適宜的消化時間和方法，不要過度，獲得細胞濃度均勻，生長速度一致的傳代細胞。防止細胞系之間、非細胞生物的污染。動物細胞培養動物細胞培養技術2、傳代培養--過程概念：對長滿表面的細胞進行消化分離，703、細胞系的建立動物細胞培養動物細胞培養技術一旦獲得了穩定的有一定特性的細胞系，就建立細胞庫，進行長期保存。根據藥品生產的有關規定，必須建立原始細胞庫和生產用細胞庫或工作細胞庫。WCB1QCWCB2QCQC原始培養物MCBQC內容：細胞活性檢測、無菌實驗、核型、DNA分析、同工酶分析、支原體試驗、其他外源物試驗、穩定性和基因型分析等，工作細胞庫必須與主細胞庫完全一致。3、細胞系的建立動物細胞培養動物細胞培養技術一旦獲得了穩定714、細胞系的凍存與復蘇動物細胞培養動物細胞培養技術

概念：細胞混懸于凍存液中，以一定的速度將細胞懸液降至-70℃以下，常于液氮下保存。冷凍保護液：含10％血清的培養液，附加10％甘油或10%DMSO，降低冰點，減少細胞內外冰晶的形成，減少在凍存過程中對細胞的損傷。方法：

選用指數期細胞；貼壁細胞須消化，制備成單細胞懸液，離心，制成106/ml；分裝至保存管中，注明細胞名稱和日期；降溫：冷凍速度-1℃/min，當溫度降至-25℃時，可加速冷凍。4、細胞系的凍存與復蘇動物細胞培養動物細胞培養技術概念：724、細胞系的凍存與復蘇

概念：以一定的復溫速度將凍存細胞恢復至常溫。方法：取出凍存管，立即放置于37～40℃水浴中，快速融化，應在1min內完成；在保護劑存在下，慢凍快融是保存復蘇細胞的要領。必須要帶護目鏡和手套。動物細胞培養動物細胞培養技術4、細胞系的凍存與復蘇概念：以一定的復溫速度將凍存細胞恢7317.4.

3動物細胞大規模培養方法

單層貼壁培養懸浮培養微囊培養微載體培養動物細胞培養動物細胞培養技術17.4.3動物細胞大規模培養方法單層貼壁培養動物細胞培741、單層貼壁培養

概念：細胞貼附于一定的固體支持表面上，形成單層細胞的培養方法。大多數動物細胞屬于貼壁依賴性，貼壁培養是動物細胞培養的一種重要方法。生長過程：接種，細胞經過吸附、接觸而貼附于基質表面；進行生長、分裂繁殖，很快進入對數期。數天就長滿整個表面，形成致密單層細胞。動物細胞培養動物細胞培養技術1、單層貼壁培養概念：細胞貼附于一定的固體支持表面上，形成75單層貼壁培養—特點

培養容器：轉瓶、玻璃珠、微載體和中空纖維等。滾瓶是為早期培養所采用，結構簡單，投資少，重復性好。優點：容易更換培養液，灌注培養時，能達到高細胞密度；有利于產物的分泌表達，可改變培養液與細胞的比例。缺點：操作較繁雜勞動強度大檢測受到限制培養條件難以均一傳質和傳氧差占用空間大，產量低，放大培養是瓶頸。動物細胞培養動物細胞培養技術單層貼壁培養—特點培養容器：轉瓶、玻璃珠、微載體和中空762、懸浮培養

概念：細胞在反應器內游離懸浮在培養液中生長的培養過程。優點：操作簡單，培養條件相對均一傳質和傳氧較好，容易放大培養。缺點：細胞體積小密度低培養病毒易失去標記而降低免疫能力。適用范圍：懸浮細胞，兼性貼壁細胞，雜交瘤。借鑒微生物發酵理論和經驗，發揮動物細胞的特性。培養容器：通氣式攪拌和氣升式生物反應器動物細胞培養動物細胞培養技術2、懸浮培養概念：細胞在反應器內游離懸浮在培養液中生長的773、微囊培養

微囊培養：在無菌條件下將擬培養的細胞、生物活性物質及生長介質共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再將微囊放入培養系統內進行懸浮培養。適用于貼壁和非貼壁培養。動物細胞培養動物細胞培養技術1.4%海藻酸鈉溶液多聚賴氨酸攪拌式或氣升式反應器系統3、微囊培養微囊培養：在無菌條件下將擬培養的細胞、生物783、微囊培養

微囊法：親水半透膜把細胞包埋在微囊內。培養結束后，收獲微囊，破微囊，純化抗體，純化工藝簡單，應用前景廣。多聚賴氨酸/海藻酸固定細胞：凝膠載體的表面被多聚賴氨酸覆蓋，形成一層多孔可透薄膜，再使凝膠載體液化，便可制成微囊產品的純度高。雜交瘤細胞與海藻酸鈉溶液混合，經微囊發生器，微球滴入氯化鈣溶液中，形成凝膠，然后用聚氨基酸處理，使微球表面成膜，再用檸檬酸去鈣離子，球內海藻酸鈉成液態，細胞在在微囊內懸浮。動物細胞培養動物細胞培養技術3、微囊培養微囊法：親水半透膜把細胞包埋在微囊內。動物793、微囊培養

微囊法優點：可防止細胞在培養過程中受到物理損傷能從囊中自由出入半透膜，從而提高細胞密度和產物含量，并方便分離純化處理。缺點:

微囊制作復雜,成功率不高微囊內死亡的細胞會污染正常產物收集產物必須破壁,不能實現生產連續化

動物細胞培養動物細胞培養技術3、微囊培養微囊法優點：動物細胞培養動物細胞培養技術804、微載體培養

微載體：是指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。特點：微載體的大小：增大單位體積內表面積，對細胞的生長非常有利。使微載體直徑盡可能小，最好控制在100-200μm之間。微載體的密度：一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細胞的貼附及生長，密度可逐漸增大。微載體的表面電荷：據研究，控制細胞貼壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質。若電荷密度太低，細胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會產生“毒性”效應。

微載體動物細胞培養動物細胞培養技術4、微載體培養微載體：是指直徑在60-250μm，能適用81微載體培養

概念：細胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培養液中的培養過程。優點：細胞生長的環境均一培養基利用率高重復性好減少了勞動強度，容易放大。兼具貼壁和懸浮培養的雙重優點種類：微載體，多孔微載體。應用：工業化生產干擾素、疫苗和尿激酶原。動物細胞培養動物細胞培養技術微載體培養概念：細胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培82原理：是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中，作為載體，使細胞在微載體表面附著生長，同時通過持續攪動使微載體始終保持懸浮狀態。貼壁依賴性細胞在微載體表面上的增殖，要經歷黏附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵。黏附主要是靠靜電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面黏附，主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

原理動物細胞培養動物細胞培養技術原理：是將對細胞無害的顆粒-微載體加入到培養容器的培養液中，83微載體培養操作要點

培養初期：保證培養基與微球體處于穩定的pH與溫度水平，接種細胞至終體積1/3的培養液中。貼壁階段（3-8d）后，緩慢加入培養液至工作體積，并且增加攪拌速度保證完全均質混合。培養維持期：進行細胞計數、葡萄糖測定及細胞形態鏡檢。隨著細胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經過3d左右，培養液開始呈酸性，需換液：停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養液，緩慢加入新鮮培養液（37℃），重新開始攪拌。

收獲細胞：微載體培養的放大：動物細胞培養動物細胞培養技術微載體培養操作要點培養初期：保證培養基與微球體處于穩定的84微載體培養操作要點

培養初期貼壁階段培養維持期：收獲細胞：排干培養液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應的酶，快速攪拌（75-125r/min）20-30min。然后解離收集細胞及其產品。

微載體培養的放大：可以通過增加微載體的含量或培養體積進行

動物細胞培養動物細胞培養技術微載體培養操作要點培養初期動物細胞培養動物細胞培養技術851、分批式操作

已用于攪拌式反應器或氣升式反應器培養雜交瘤細胞，生產單克隆抗體。分批培養雜交瘤和骨髓瘤細胞的周期為3～5天，細胞密度達2～5×105/ml。單克隆抗體的產量約10～100mg/L。在大規模攪拌反應器中，細胞密度較低，最終達5×106，而在750～1500cm2的轉瓶生產中，細胞密度達1～2×108。17.4.

4動物細胞培養操作方式動物細胞培養動物細胞培養技術1、分批式操作已用于攪拌式反應器或氣升式反應器培養雜交瘤細862、流加式操作

最常見的流加物質是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物質。通過流加控制，可實現高密度培養。雜交瘤細胞培養，細胞密度可達1.4×107，生產抗體的產量比分批操作提高幾～10倍，可達500mg/L。由于培養體積不斷變化，流加對過程的控制能力仍然有限在實際生產中應用少。動物細胞培養動物細胞培養技術2、流加式操作最常見的流加物質是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和873、半連續式操作

動物細胞培養生產藥物中經常采用。已應用于大規模生產乙肝表面抗原、t-PA等基因工程產物。半連續操作特別適用于分泌表達型細胞，如雜交瘤細胞的培養，尤其是微載體系統。微載體系統培養基因工程CHO細胞，待細胞長滿載體后，反復收獲細胞的分泌產物乙肝表面抗原，制備乙肝疫苗。該方式操作簡單，使細胞密度和產量維持在較高水平，能在較長時間內進行持續生產，反復收獲產物，生產效率高，是動物細胞培養生產藥物中經常被采用的方式。動物細胞培養動物細胞培養技術3、半連續式操作動物細胞培養生產藥物中經常采用。已應用于大884、罐流操作

概念：是一種細胞被截留在反應器內的連續操作方式。在培養后期不斷的加入新鮮培養基，同時以同樣的流量排出部分培養基，借助于出口介質過濾把細胞滯留在反應器內的培養方式。是最受推崇的用動物細胞生產藥物的方式。罐流體系的分類全部截留:100％截留細胞，如固定化包埋細胞，可通過中空纖維、平板膜、凝膠顆粒和微囊等實現；部分截留:使用微載體系統、貼壁系統、分離懸浮系統等實現。流化床包埋培養人鼠雜交瘤細胞，整個反應器有效濃度達4×108/ml，單位體積產量提高200～300倍。動物細胞培養動物細胞培養技術4、罐流操作概念：是一種細胞被截留在反應器內的連續操作方894、罐流操作

優點：全部截留

大大提高了細胞生長密度和產物濃度。利用培養基，降低細胞代謝廢物，細胞生長良好。產物為分泌蛋白質，滯留時間短，避免了產物的聚合、降解等產量和活性形式的變化，有利于純化。中空纖維生物反應器、固定床或流化床反應器、膜生物反應器等的唯一可操作方式。缺點：要求復雜儀器設備控制灌流操作過程，由于過濾器容易堵塞，從而限制培養次數。動物細胞培養動物細胞培養技術4、罐流操作優點：動物細胞培養動物細胞培養技術902、罐流操作優缺點

提高細胞培養密度，和產物濃度。可控制培養液處于低廢物的水平，細胞生長好，延長培養周期。產物為分泌蛋白質，滯留時間短，避免了產物的聚合、降解等產量和活性形式的變化，有利于純化。缺點：要求復雜儀器設備控制灌流操作過程，由于過濾器容易堵塞，從而限制培養次數。動物細胞培養動物細胞培養技術2、罐流操作優缺點提高細胞培養密度，和產物濃度。動物細胞91第十七章動物細胞培養制藥工藝第一節制藥動物細胞的表達與特征第二節基因工程動物細胞系的構建第三節動物細胞培養基制備第四節動物細胞培養技術第五節培養過程檢測與工藝控制第十七章動物細胞培養第一節制藥動物細胞的表達與特征92

生長環境參數：溫度、pH、溶氧、轉速、液流量培養基成分變化參數：葡萄糖消耗率、乳酸生成率、銨離子濃度生長狀態參數：形態變化、活性高低、密度大小目標產物生產率：產物合成與積累速度，分泌微生物的污染參數動物細胞培養過程檢測與工藝生長環境參數：溫度、pH、溶氧、轉速、液流量動物細胞培養過9317.5.1細胞活性與形態檢測

17.5.

2微生物污染的檢測與防止17.5.

3培養基成分的檢測與代謝控制第五節培養過程檢測與工藝控制17.5.4攪拌剪切的檢測與控制動物細胞培養過程檢測與工藝17.5.1細胞活性與形態檢測17.5.2微生物污染的檢941、細胞數目與活性的檢測動物細胞培養過程檢測與工藝17.5.1細胞活性與形態檢測

離線分析：血細胞計數板或分光光度計，確定反應器中的細胞數目。

在線分析：近紅外線傳感器，可把細胞計數和活性控制結合在一起細胞活性：組織化學染色法和細胞形態的觀察檢測細胞活性。臺盼籃染色排除法，MTT比色分析1、細胞數目與活性的檢測動物細胞培養過程檢測與工藝17.5.952、細胞凋亡

概念：細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件下，受內在遺傳機制的控制自動結束生命的過程。凋亡細胞排斥活體染料，臺盼籃不能檢測。光學顯微鏡：直接形態觀察凋亡小體熒光顯微鏡：熒光染料染色，觀察細胞核的形態動物細胞培養過程檢測與工藝細胞死亡有兩種形式，即凋亡和壞死，其形態學和生化變化完全不同。壞死：細胞受到嚴重傷害時快速膨脹，染色質凝聚，而死亡，細胞直接裂解，壞死過程不受細胞自主控制。2、細胞凋亡概念：細胞凋亡是指細胞在一定的生理或病理條件96

細菌污染：肉湯培養基于37℃恒溫培養，檢查。支原體污染：染色、培養和共培養，至少同時使用兩種方法。使用抗生素、卡那霉素、金霉素處理培養物。特異性的支原體血清、高溫、支原體去除劑。高溫處理，支原體和細胞的耐熱性不同，支原體敏感。17.5.

2微生物污染的檢測與防止動物細胞培養過程檢測與工藝細菌污染：肉湯培養基于37℃恒溫培養，檢查。17.5.297

營養的消耗：葡萄糖和谷氨酰胺的減少為指標副產物的積累：乳酸和銨離子的增加近紅外測量技術可實現葡萄糖的在線檢測控制銨離子濃度低于2-4mmol/L。乳酸低于60mmol/L17.