第十五章酶免疫技術免疫標記技術

免疫標記技術：將某種可微量可超微量測定的物質(放射性核素、酶、熒光素、化學發光劑等)標記于抗原（抗體）上制成標記物，加入到抗原抗體的反應體系中與相應的抗體（抗原）反應，以檢測標記物的有無及含量間接反映被測物的存在與多少。

酶免疫分析技術是以酶標記的抗原或抗體為主要試劑，檢測樣本中相應的抗體或抗原。將抗原抗體反應的特異性和酶催化底物的放大作用和高敏感性相結合的一種免疫檢測技術。常用標記物包括熒光素、酶和放射性同位素

三大免疫標記技術：免疫熒光技術:FITC，PE免疫酶標記技術：HRP，AP放射免疫技術:131I，32P此外，免疫標記物還有化學發光物質、凝集素、鐵蛋白和膠體金等。酶免疫技術

就是將抗原和抗體的免疫反應和酶的催化反應相結合而建立的一種新技術。酶與抗體或抗原結合后，既不改變抗體抗原反應的特異性，也不影響酶活性，即在相應而合適的作用底物參與下，表現為呈色反應。呈色反應顯示了酶的存在，從而證明發生了相應的抗體抗原反應。這是一種特異而敏感的技術，可以在細胞或亞細胞水平上示蹤抗原或抗體的所在部位，或在微克、甚至納克水平上對其進行定量。

第一節酶免疫技術的概述分為兩類

1）酶免疫組織化學技術（EIHCT）

可定性、定位

2）酶免疫測定法（EIA）

可定性、定量

－－非均相免疫酶測定法：①固相酶免疫測定：酶聯免疫吸附試驗（ELISA）應用最廣泛；②液相酶免疫測定－－均相免疫酶測定法

酶免疫技術酶免疫組化酶免疫測定均相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標本中抗原的定位

液體標本中抗原或抗體的定性和定量（不需洗滌）（需洗滌）（ELISA）一、常用的酶及底物（一）標記酶的條件：

活性高，催化反應效率高，純度高。性質穩定，易與抗原抗體偶聯，偶聯后不影響三者各自的活性。專一性強酶催化底物的顯色信號易于判斷和測量方法敏感，重復性好，簡單易行酶的底物易于配制保存，酶及底物價廉

辣根過氧化物酶（HRP）

糖蛋白（主酶）亞鐵血紅素（輔基）主酶與酶活性無關輔基是酶的活性中心RZ值：403nm（輔基）與275nm（主酶）OD值之比RZ值與酶活性無關，酶活性單位比RZ值更為重要ELISA中應用最為廣泛的標記用酶常用酶（二）常用的酶及底物HRP的底物

DH2+H2O2→→→D+2H2O

HRP真正的底物是H2O2，但人們把H2O2和供氫體DH2都稱為底物常用底物HRP的常見底物

鄰苯二胺OPD四甲基聯苯胺TMB5-氨基水楊酸5-ASA2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽ABTS常用底物堿性磷酸酶（AP）

菌源性AP腸粘膜AP

β–半乳糖苷酶（β-Gal）

用于均相酶免疫測定

常用酶OPD反應后顯橙黃色，加酸終止反應后呈棕黃色，測定波長492nm。不穩定，致癌性。TMB反應后顯藍色，加酸終止反應后變為黃色,測定波長450nm，穩定，無致癌性，ELISA中應用最廣泛的底物。HRP的常見底物

AP的底物

β-Gal的底物

對-硝基苯磷酸酯（pNPP）4-甲基傘酮基β-D半-乳糖苷（4MUG）經AP作用后的產物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405nm。

酶作用后，生成高強度熒光物，用熒光計測量。常用底物制備方法要求技術方法簡單、產率高，重復性好標記反應不影響酶和抗原或抗體的活性酶標記物穩定，不形成聚合物二、制備酶標記抗體(抗原）的方法酶免疫技術的核心組成部分

酶結合物（conjugate）酶標記物通過化學反應或免疫學反應，讓酶與抗體或抗原形成的結合物抗原要求純度高，抗原性完整抗體需要特異性好、效價高、親合力強以及比活性較高，能批量生產，易純化。

制備方法要求制備方法過碘酸鈉法（直接法）常用于HRP標記抗體或抗原

戊二醛交聯法戊二醛交聯法戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與HRP和蛋白質分子中的氨基結合。該法有一步法和二步法。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質量較均一。

標記完成后應除去反應液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度酶標記物的純化與鑒定

標記完成后應除去反應液中的游離酶、游離抗體或抗原、酶聚合物以及抗體或抗原聚合物，避免游離酶增加非特異顯色，以及游離抗體或抗原起競爭作用而降低特異性染色強度三、酶標記物的純化及鑒定常用的純化方法：1.葡聚糖凝膠G-200/G-150過柱層析純化2.50%飽和硫酸銨沉淀提純酶標記物的鑒定主要有：1、酶活性和抗體（抗原）免疫活性的鑒定

2、酶標記率的測定

（一）要求

結合抗體或抗原的容量大抗體或抗原牢固地固定在其表面不影響免疫反應性利于反應充分進行固相方法簡便易行，快速經濟固相酶免疫測定是將抗體或抗原結合到固相載體的表面，通過載體將結合狀態的酶標記物和游離的標記物分離的測定方法四、固相載體（二）固相載體的種類1．塑料制品由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形狀主要有微量反應板、小試管和小珠三種。2．微粒微顆粒是由高分子單體聚合成的微球或顆粒。

3.膜載體是一種多孔薄膜過濾材料，包括硝酸纖維素膜（NC）、玻璃纖維素膜等。

第二節酶聯免疫吸附試驗（

enzymelinkedimmunosorbantassay,ELISA）

酶聯免疫吸附試驗

(enzymelinkedimmunosorbantassay,ELISA)

是一種固相免疫測定技術。先將抗體（抗原）包被到固相載體表面，并保持其免疫活性。測定時，將待檢抗原（抗體）和酶標抗體（抗原）按不同步驟與固相載體表面吸附的抗體（抗原）發生反應，形成免疫復合物，用洗滌的方法分離抗原抗體復合物和游離的未結合成分，最后加入底物，根據底物被酶催化產生的顏色及其吸光度(A)值的大小進行定性或定量分析的方法。

底物顯色定性或定量的分析原理包被反應加入待測抗體或抗原和酶標抗原或抗體洗滌使結合在固相上的抗原抗體復合物與未結合的分離1234基本原理預期結果陽性：顯色為黃色陰性：無色1234陰性陰性陽性陽性1、雙抗體夾心法方法：用已知抗體包被，加入待檢血清，再加酶標抗體，加底物顯色應用：用于檢測大分子抗原：乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG等ELISA檢測抗原的方法雙抗體夾心法（HBsAg、HBeAg等）示意圖固相載體抗體抗原酶抗體酶標記抗體1.將抗體包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗原，則結合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗體，則結合為抗體-抗原-酶標記抗體復合物。4.酶催化底物并顯色。1、已知抗體包被于載體表面3、加酶標抗體與抗原結合4、加酶作用的底物產生顏色2、加待檢物抗原與抗體結合4、加酶作用的底物不產生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌雙抗體夾心法測抗原1、已知抗體包被于載體表面2、加待檢物無抗原與抗體結合3、加酶標抗體無抗原結合+-YYYEYEYEYYEYEYEYYYYEYEYEYYYYYYYYYYYYYYYYYY2、雙位點一步法：實質是雙抗體夾心法固體抗體和酶標抗體為針對待檢抗原上兩個不同決定簇的兩種單克隆抗體待檢抗原濃度過高時可形成“鉤狀效應”一步法

方法：用已知抗體包被，加入待測血清，再加酶標抗原，酶標抗原與待檢物競爭與包被物結合。加底物顯色。

應用：用于只有一個抗原決定簇的小分子半抗原（藥物、激素等）3、競爭法洗滌洗滌競爭法測抗原+-YYYYYYEYYEYYYYEYYEYEYEYE2、加待檢物抗原與酶標抗原競爭與抗體結合3、加酶作用的底物不顯色或顯色弱3、加酶作用的底物顯色1、已知抗體包被于載體表面1、已知抗體包被于載體表面2、加待測物和酶標抗原，酶標抗原與抗體結合YE1、間接法方法

用已知抗原包被，加入待測血清，再加酶標的抗人IgG（抗抗體或二抗）加底物顯色。優點一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體應用

常用于HCV抗體、HIV抗體和梅毒螺旋體抗體等的測定ELISA檢測抗體的方法1、已知抗原吸附于載體表面2、加待檢物無抗體與抗原結合3、加酶標抗Ig與抗體結合4、加酶作用的底物產生顏色1、已知抗體吸附于載體表面2、加待檢物有抗體與抗原結合3、加酶標的抗Ig抗體4、加酶作用的底物不產生顏色洗滌洗滌洗滌洗滌間接法測抗體-YEYYYEYEYYYEYYEYYEYYEYYEYEY+2、雙抗原夾心法原理：類似雙抗體夾心法操作步驟：類似應用：乙型肝炎表面抗體ELISA檢測抗體的方法雙抗原夾心法（抗-HBs等）示意圖1.將抗原包被在固相載體上。2.如樣品中含有抗體，則結合為抗原抗體復合物。3.再加入酶標記抗原，則結合為抗原-抗體-酶標記抗原復合物。4.酶催化底物并顯色。酶抗原酶標記抗原抗體抗原固相載體3、競爭法原理：類似檢測抗原的競爭法

應用：乙型肝炎病毒核心抗體(HBcAb)和乙型肝炎病毒e抗體(HBeAb)的檢測ELISA檢測抗體的方法4、捕獲法

應用：

病原體急性感染診斷中的IgM型抗體

甲型肝炎HAV-IgM抗體

乙型肝炎病毒核心HBc-IgM抗體ELISA檢測抗體的方法固相抗人lgM抗體E標本（含抗體）抗原底物EE捕獲法檢測lgM抗體洗滌洗滌洗滌洗滌捕獲法原理+-EYEYEYEYEYYYYYYY

1、固相化抗人

IgMYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY1、固相化抗人

IgM2、加待測物特異性IgM與非特異性IgM和抗人IgM結合3、加特異性抗原，與特異性抗體結合4、加酶標抗體與特異性抗原結合，加底物顯色2、加待測物只有非特異性IgM和抗人IgM結合3、加特異性抗原，不能與非特異性IgM結合4、加酶標抗體無抗原結合，加底物不顯色在應用此法時需注意RF(IgM類)及其他非特異IgM的干擾。RF(IgM類)既能與固相載體上的IgM第二抗體結合，又能與隨后加入的酶標抗體（IgG）結合，從而導致假陽性結果。此外，非特異性IgM在第一步時可與特異性IgM競爭結合固相抗體，從而影響檢測的靈敏度三、ELISA的關鍵技術（一）各種試劑的制備1．抗原和抗體2．包被與封閉

包被(coating)是將抗原或抗體固定在固相載體上的過程。封閉(blocking)就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。(用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清消除固相載體表面未結合的位點，消除非特異性吸附)

3．酶標結合物的制備

（二）最適工作濃度的選擇各類血清抗原稀釋度1：501：1001：2001：4001：800強陽性1.201.040.840.680.42弱陽性0.640.410.300.220.19陰性0.230.130.080.060.05稀釋液0..080.020.020.020.04間接法測抗體中包被抗原最適工作濃度的選擇

（三）測定方法的標準化

1．加樣應力求準確，并注意不可產生氣泡。2．溫育注意反應的溫度和時間應按規定的要求，整塊反應板的溫度應一致。3．洗滌

洗滌有手工洗滌和洗板機洗滌兩種方法，若用洗板機洗滌要適當增加洗滌次數。4．顯色要控制好顯色時間。四、評價與應用

評價ELISA的方法具有高度的特異性和靈敏度，操作方便快速，試劑穩定，對環境無污染，儀器、設備要求簡單，實驗結果既可以用肉眼觀察作定性分析，也可以用酶標儀進行定性、定量分析，已經成為臨床免疫檢驗中的常用技術。

應用1.病原微生物測定2.激素測定3.藥物測定4.腫瘤標志物5.蛋白質測定固相的抗原或抗體

酶標記物（酶結合物）

酶反應的底物

三個必要試劑

試劑盒組成用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定

酶標記物與相應的抗原或抗體結合后，標記酶的活性會發生改變，不用分離結合和游離酶標記物，通過測定標記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理一、均相酶免疫測定第三節其他酶免疫技術最具代表性的兩種技術酶放大免疫測定技術EMITenzyme-mutipliedimmunoassaytechnique

克隆酶供體免疫分析

CEDIAclonedenzymedonorimmunoassay

均相酶免疫測定均相酶免疫測定：1.EMIT(酶擴大免疫測定技術):2.克隆酶供體免疫測定：位阻EDEDEAEAEDAbAb活性酶標本中AgEMIT示意圖CEDIA示意圖

均相酶免疫測定主要用于藥物和小分子物質的檢測。非均相免疫測定中的ELISA應用更為廣泛，ELISA廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝三對”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細菌如結核桿菌、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質檢測，如各種免疫球蛋白、補體、腫瘤標志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等）。第三節膜載體的酶免疫技術屬于ELISA的一種類型，與前述的ELISA有所不同的是用吸附蛋白質能力很強的硝酸纖維素膜（NC膜）代替了聚苯乙烯反應板來作為固相載體，酶作用底物后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。

硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜具有很強的靜電吸附力,在中性條件下即可有效地吸附蛋白質等生物大分子。將免疫物質吸附于纖維素膜后，就可利用纖維素膜作為固相載體進行抗原抗體反應。底物經酶反應后形成有色沉淀，使固相膜染色。一、斑點酶免疫吸附試驗斑點酶免疫試驗

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ELISPOT20世紀80年代，國外的科研工作者根據ELISA技術的基本原理，建立了體外檢測特異性抗體分泌B細胞和細胞因子分泌T細胞的酶聯免疫斑點試驗(enzymelinkedimmunospot,ELISPOT)。ELISPOT結果判斷二、斑點酶免疫滲濾試驗是將NC膜封于塑料小盒中，先在塑料小盒NC膜中滴加已知抗體，干燥后封閉，再依次加入待測標本、酶標抗體，最后加入底物，陽性時可在膜上出現有色斑點。

亦稱酶聯免疫電轉移印斑法（EITB），或稱為Westernblot。分三個階段進行：1.為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-AGE）。抗原等蛋白樣品經SDS處理后帶陰電荷，在聚丙烯胺凝膠中從陰極向陽泳動，分子量越小，泳動速度就越快。此階段分離效果肉眼不可見（只有在染色后才顯出電泳區帶）；2.為電轉移。將在凝膠中已經分離的條帶轉移至硝酸纖維素膜上，選用低電壓（100V）和大電流（1～2A），通電45min轉移即可完成。此分階段分離的蛋白質條帶肉眼仍不可見；3.為酶免疫定位。將印有蛋白質條帶的硝酸纖維素膜（相當于包被了抗原的固相載體）依次與特異性抗體和酶標第二抗體作用后，加入能形成不溶性顯色物的酶反應底物，使區帶染色。三、免疫印跡試驗免疫印跡法——Westernblot法原理Westernblot——抗原表位可能被破壞而漏檢（一）生物素和親和素的特點1．生物素(biotin，B)第四節生物素-親和素系統酶聯免疫吸附試驗BAS-ELISA

2．親和素(avidin，A)

3．鏈霉親和素(streptavidin，SA)

常用的方法有三種：BA法BAB法ABC法HBsAg陽性對照HBeAg陽性對照HBeAg陽性對照陽性對照HBeAb（競爭法）HBcAb（競爭法）陽性對照可分為兩類乙、丙、丁主要為血液傳播，無季節性，已、庚型：多散發，常轉為慢性甲型和戊型：消化道感染，有季節性，可暴發流行，不易轉成慢性乙型肝炎對全球的影響WHOandCDCfactsheets,availableatand全球有一半人口居住于乙肝病毒感染高發區全球人口達60億

20億人口感染過乙肝病毒的確切證據乙肝病毒感染者達3-4億其中25–40%死于肝硬化或肝癌HBV發病率8%-High2-7%-Intermediate

<2%-Low

乙型肝炎病毒感染地理分布HBsAg流行率的地區分布江西山西重慶HBsAg流行率黑龍江吉林遼寧內蒙古北京天津河北山東江蘇上海浙江臺灣福建廣東海南廣西云南貴州四川西藏新疆青海甘肅

寧夏陜西河南湖北湖南安徽1995年全國病毒性肝炎血清流行病學調查

8%2%~7%中度流行區高流行區

在1992年到1995年所做的除港澳臺地區之外的全國調查中，一般人群中乙肝病毒的攜帶率為9．7％，也就是1．26億。2005年3月8日公布的最新醫學統計，我國乙肝病毒攜帶者已經達到1.3億人，

我國乙肝攜帶率10％以上。全世界HBV攜帶者有2億，其中大半在中國。乙肝的危害性比甲肝大，是我國當前最廣泛、危害最嚴重的一種傳染病。經濟水平較低、衛生條件較差是乙肝流行的基礎。大部分乙肝病人經治療后能痊愈，少數病程遷延或轉為慢性，其中一部分可發展為肝硬化甚至肝癌；極少數病人病程發展迅猛，肝細胞出現大面積壞死，成為重型肝炎；另有一些肝炎感染者則成為無癥狀的病毒攜帶者。中國各類乙肝病人每年平均醫療費慢性乙肝代償性肝硬化失代償肝硬化肝細胞癌

1176.4671531.04514073.76839208.923GuanZQ,etal.JClinGastroenterol,2004,38(Suppl):S175-178我國每年因慢性乙肝(包括肝硬化、肝癌)直接經濟損失約1122.8億人民幣乙肝類別

每年平均醫療費(元)

２００５年中華醫學會發布了我國首次乙肝患者認知現狀調查。調查顯示：約有６０％的患者在得了乙肝后徹底改變了自己的生活習慣。在家庭中，乙肝病人和子女或是伴侶的關系，都因為疾病發生了變化。４７％的患者擔心單位如果發現他們患有乙肝后會丟失工作，５２％的患者由于乙肝失去了獲得理想工作和學習的機會?！爸袊腋蔚谝话浮保海玻硽q的張先著參加安徽蕪湖公務員考試筆試、面試成績排名第一。由于在體檢中查出感染乙肝病毒，蕪湖市人事局宣布他體檢不合格、不予錄取。２００３年１１月１０日，張先著正式向法院提出行政訴訟。２００５年４月，蕪湖市新蕪區法院作出張先著勝訴的一審判決，５月蕪湖中院作出維持原判的裁定。

２００５年１月１９日，全國《公務員錄用體檢通用標準（試行）》正式實施，特別明確了：乙肝病原攜帶者在體檢標準中是合格的。

一、生物學特性（一）形態與結構：DNA病毒

乙肝患者的血清用電鏡觀察可看到三種不同形態的顆粒：大球形顆粒（Dane顆粒）：完整的HBV病毒，有三層結構,具有傳染性外衣殼=包膜(脂質雙層+蛋白質)HBsAg等內衣殼：HBcAg、HBeAg內部：DNA---環狀雙鏈、DNA多聚酶小球形顆粒：過剩的外衣殼，無傳染性管形顆粒：聚合在一起的小球形顆粒，無傳染性約電子顯微鏡下可以觀察到乙肝病毒3種不同的形態：大球形顆粒，小球形顆粒和管形顆粒。管形顆粒小球形顆粒大球形顆粒（二）、抗原組成：（1）表面抗原（HBsAg）：又稱澳抗，是人體感染乙肝病毒的標志。HBsAg不僅存在于血清中，而且在體液和分泌物中也有：唾液、尿液、乳汁、汗液、淚水、鼻咽腔分泌物、精液和陰道分泌中。HBsAg有不同亞型，各亞型之間有共同抗原決定簇a，此外還有二組亞型抗原決定簇：d/y，w/r，按不同組合構成：adw，adr，ayw，ayr。亞型頒有明顯的區域性，也與種族有關。我國漢族以adr為主。HBV感染后，大部分人無臨床表現，但在血中可檢出HBsAg，這類人通常稱為HBsAg攜帶者。其中大部分將持續數年或數十年甚至終生攜帶HBsAg而無癥狀。小部分人在平衡打破后可發展為在急性或慢性乙肝患者，甚至肝硬化或肝癌Pre-S1，Pre-S2抗原性比HBsAg更強，可使機體產生相應抗體，其中抗-PreS2為中和抗體，表示病性好轉，是趨向痊愈的預兆。（2）表面抗體（抗-HBs）：是一種保護性抗體。此抗體出現是HBV感染終止和人體的免疫力產生的標志

常在HBsAg轉陰后數月出現表面抗體，若HBsAg陽性持續半年或一年以上則為HBV慢性攜帶者

核心抗原（HBcAg）：位于內衣殼，不易檢測。（3）核心抗體（抗-HBc）：乙肝感染的標志，表示病毒在肝內持續復制但此抗體無保護性（4）e抗原（HBeAg）：隱藏于HBcAg中。乙肝病毒在體內復制和血清具有較強

傳染性的標志（5）e抗體(抗-HBe)：傳染性降低，復制速度減慢?！按笕枴保篐BsAg、HBeAg、抗-HBc陽性“小三陽”：HBsAg、抗-HBe、抗-HBc陽性二、致病性與免疫性1.傳染源：乙肝病人及無癥狀攜帶者。其血清具有高度傳染性：極微量的（10-9～10-6ml）含HBV的血液即可引起感染2.傳播途徑：血源傳播（輸血、注射、外科或牙科、公用剃刀、內鏡）密切接觸（性接觸、唾液、蚊蟲叮咬）垂直傳播中國乙型肝炎的主要傳播途徑母嬰圍產期傳播是我國乙肝主要的傳播途徑之一，在我國人群中約35－40％乙肝表面抗原攜帶者是由母嬰圍產期傳播引起的。全國病毒性肝炎血清流行病學調查顯示，我國人群HBV感染率隨年齡增長而上升，提示除母嬰傳播外，還存在水平傳播。莊輝，中華流行病學雜志2004年5月第25卷第5期：376乙肝有家庭聚集傾向致病機制：乙肝病毒在肝細胞內復制，但對肝細胞無直接損害作用，主要是由其抗原成分誘發機體免疫而導免疫損傷

乙肝患者的原發性肝癌發生率高于正常人群，HBsAg陽性較正常人發生肝癌的危險性高217倍。HBV抗原抗體系統檢測臨床意義HBsAgHBeAg抗-HBe抗-HBc抗-HBs臨床意義IgMIgG+-----感染或無癥狀攜帶者++-+--急性乙型肝炎（有傳染）（大三陽）++--+-慢性乙型肝炎（有傳染）（大三陽）+-++-急性肝炎趨向恢復（小三陽）--+-++恢復期（傳染性低）-----+既往感染或接種疫苗------未感染，無免疫力三、微生物學檢查：乙肝兩對半：HBsAg抗-HBsHBeAg抗-HBe

抗-HBc注意：抗原和抗體不能同時為陽性5.防治原則：A、對具有傳染性的患者應隔離治療，病人餐具、用具消毒處理

B、可接種乙肝疫苗（3次）1．RZ表示A.酶活性B.催化效率C.標記率D.酶純度E.效價2．用于標記的辣根過氧化物酶，其RZ值應大于A.2.4