多重耐藥銅綠假單胞菌β－內酰胺類相關耐藥基因研究【摘要】目的調查我院2005年臨床分離多重耐藥銅綠假單胞菌(PA)的耐藥性分析并探討其耐藥基因的存在狀況。方法對31株臨床分離的銅綠假單胞菌用紙片擴散法檢測其藥敏表型，采用聚合酶鏈反應(PCR)法檢測β-內酰胺酶編碼基因和外膜通道蛋白OprD2基因，并與相關藥敏表型比較。結果31株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的耐藥率為48．4%~100%；β-內酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。結論本院多重耐藥銅綠假單胞菌對β-內酰胺酶類抗生素的耐藥主要與外膜通道蛋白OprD2基因缺失有關。

【關鍵詞】銅綠假單胞菌；多重耐藥；β-內酰胺酶；聚合酶鏈反應；基因型

【Abstract】ObjectiveTosurveythedistributionofaminoglycoside-modifyingenzymegenesinmultidrug-resistantpseudomonasaeruginosaisolatedinourhospitalin2005．MethodsTheantibioticsusceptibilityof31differentantibioticsofwastestedbyK-Bmethod，and31multi-drugresistantstrainswerescreened;β-lactamasegenesandtheoutermembraneproteinOprD2geneweredetectedbypolymerasechainreaction(PCR).ResultsResistantratesof31strainsofagainst16kindsofantibioticrangedfrom48．4%to100%;thedetectionrateofβ-lactamasegenePER，VIM，DHA，IMP，TEMandOXA-10was6．4%，3．2%，3．2%，3．2%，3．2%and3．2%respectively，andnoneofthe31strainspossessedgenesofGES，SHVandVER，31isolateofPAlosttheoutermembraneproteinOprD2Resistancetoβ-lactamcompoundsinofourhospitalisrelatedtolosttheoutermembraneprotein.

【Keywords】Pseudomonasaeruginosa;Multidrugresistance;β-Lactamases;Polymerasechainreaction;Genes

銅綠假單胞菌(pseudomonasaeruginosa，PA)是一種重要的條件致病菌，常常引起呼吸道感染、菌血癥、肺炎、泌尿系統感染、燒傷感染和囊性纖維化繼發感染等多種疾病。2002年全國細菌耐藥性監測網調查顯示：PA的分離率為10．3%，僅次于大腸埃希菌而居第二位[1]。由于臨床上抗生素的大量使用，銅綠假單胞菌呈現出天然或獲得性多重耐藥性(multidrugresistance，MDR)，給治療造成困難。近年來，銅綠假單胞菌對3、4代頭孢和亞胺培南在內的多種β內酰胺類抗生素及氨基糖苷類抗生素耐藥率一直處于一個比較高的水平，并呈現逐年上升的趨勢[1-3]。為了解臨床分離多重耐藥的PA中耐藥情況，收集了本院2005年1~12月臨床分離的31株PA，對其進行耐藥性的檢測，并采用分子生物學技術檢測其耐藥相關基因，結果報告如下。

1材料

1．1菌株來源于本院2005年1~12月臨床分離的多重耐藥銅綠假單胞菌(MDRP)31株。所有標本均采用法國生物梅里埃公司細菌鑒定儀鑒定菌種。

1．2質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均購自衛生部臨床檢驗中心。

1．3MH培養基采用英國Oxoid公司產品。

1．4抗生素及藥敏紙片頭孢他啶(30μg/片，CAZ)、頭孢曲松(30μg/片，CRO)、亞胺培南(10μg/片，IMP)、克拉維酸(2mmol/L，CA)、氯唑西林(2mmol/L)、美羅培南(10μg/片，MER)、2-巰基丙酸紙片均購自英國Oxoid公司。

1．5微生物鑒定系統VITEK-32法國生物梅里埃公司產品。

1．6儀器DNA擴增儀為美國PE公司產品。

1．7PCR檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

2方法

2．1細菌培養、鑒定和保存細菌培養根據臨床檢驗操作規程按常規方法進行，采用VITEK-32全自動微生物鑒定系統鑒定結果；將細菌接種于半固體培養基中，37℃培養24h后置-80℃冰箱保存，以備進行分子學檢測。

2．2抗生素敏感試驗采用紙片擴散法(K-B法)，結果根據美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)2004年版標準進行判斷。

2．3PCR擴增模板制備挑取菌落置入含100μl生理鹽水的0．5ml離心管內，15000轉/min離心5min，去上清。加0．05%非離子去污劑NP4050μl、200ng/ml的蛋白酶K2μl混勻，55℃水浴1h，然后95℃水浴5min，最后10000轉/min離心30s，取上清做PCR擴增的模板。

2．4基因檢測均為PCR法。PCR擴增產物500bp熱循環參數均為：93℃預變性2min，然后93℃60s→55℃60s→72℃60s，循環35個周期，最后一個72℃延長至5min，其余均為：93℃預變性2min，然后93℃30s→55℃30s→72℃60s，循環35個周期，最后一個72℃延長至5min。各種靶基因的目的產物長度見表1。

2．5擴增產物檢測擴增產物在1．5%瓊脂糖凝膠(含0．5μg/ml溴化乙錠)120V電泳30~40min，全自動凝膠圖像成像儀觀察，出現與陽性模板分子量相同的條帶即為陽性，PCR檢測陽性對照DNA，由無錫市克隆遺傳技術研究所微生物DNA收集與保存室提供，擴增條件同上。

3結果

3．1藥敏試驗結果31株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的藥敏率見表2。

3．2基因檢測結果β內酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。

4討論

研究發現，PA對β內酰胺類抗生素存在多種耐藥機制，如外膜滲透性降低、泵出機制、由染色體編碼持續高產AmpC酶、產超廣譜β內酰胺酶以及能水解卡巴培能碳氫酶烯的金屬酶等。IMP是目前用于治療革蘭陰性桿菌感染具有最強抑菌效能的抗生素，對產ESBLs及AmpC酶的革蘭陰性桿菌均有效。IMP耐藥的PA在臨床上具有更大的危險性。

近年來隨著研究的深入，國內外學者在PA菌臨床分離株中發現了多種β內酰胺酶和碳青霉烯酶基因如TEM、SHV[6，7]、OXA、VEB-1、PER[8，9]、GES、持續高產AmpC酶、IMP[10]、VIM[11]、SPM[12]等。在我國上海、杭州、石家莊、溫州相繼發現了VEB-1、OXA-10、IMP、PER-1、TEM-1、SHV基因[6，8，10]。這些基因所表達的產物可以水解青霉素類、頭孢菌素類、單酰胺類和碳青霉烯類抗生素。

本組菌株中，表型耐亞胺培南的共31株(占100%)，其中外膜通道蛋白OprD2基因缺失為100%；VIM、IPM基因各發現1株，各占3．2%。PA對亞胺培南耐藥的主要原因為產IMP、VIM、SPM、GIM型金屬β-內酰胺酶、GES-2型β-內酰胺酶和外膜蛋白OprD2缺失等。β內酰胺類抗生素對PA的作用靶位是細菌內膜上的PBP2，該類藥物要達到其作用靶位必須首先經過外膜通道進入周漿間隙。如果菌株外膜蛋白通道減少或缺失，藥物難以到達其作用靶位，細菌將產生耐藥。因此，OprD2被認為是亞胺培南擴散的通道[11]。VIM、IMP是金屬β-內酰胺酶，可快速水解青霉素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗菌藥物。通過本組實驗研究可以表明PA對亞胺培南耐藥的主要原因是特異性通道OprD2缺失引起外膜通透性降低，從而阻礙抗菌藥物進入菌體內到達細菌作用靶位。

OXA、TEM、SHV、PER、GES陽性均可引起PA對β內酰胺酶類抗菌藥物的廣泛耐藥。本組菌株中PER的陽性率為6．4%，TEM、OXA-10的陽性率為3．2%，而GES、SHV基因未檢出，這些基因的陽性率與國內其他地區的檢測結果有差別[6，8，10]。導致此種結果出現的原因應與本地區抗菌藥物的使用情況有密切關系。

總之，PA的耐藥機制極為復雜，它對某一類抗菌藥物的耐藥往往不是由單一因素造成，而常是幾種機制協同作用的結果；它對不同抗菌藥物的耐藥機制也不完全相同，并不斷有新的耐藥機制出現。即使是同一種菌不同地區、不同時期其耐藥性和耐藥基因狀況也不相同。本實驗結果證明聊城地區的PA對各類抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，且耐藥基因陽性率較有報道的國內其他地區高。OprD2基因缺失應該是本組菌株耐藥的主要原因，此情況應引起臨床醫生和院內感染科的高度重視，但也不排除同時存在其他耐藥機制的可能，有待進一步研究。

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