實時熒光定量PCR檢測限的統計推斷【摘要】檢測限是檢測方法的重要性能指標，用Poisson分布的概率函數分式計算一次抽樣檢測出現的結果推論總體出現該結果的概率。以實時熒光定量PCR(FQPCR)檢測乙型肝炎病毒DNA結果為例，計算可知，一次抽樣反應管的檢測結果≥4時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性()。因而檢測血清中病原體時擴增反應管中的檢測限是4拷貝/ul計算也可知，1拷貝/ul表示一次抽樣的結果為0的概率可達，結果在0拷貝/ul～4拷貝/ul的概率為，而1000拷貝/ml表示一次抽樣結果為0的概率為0。結果在905拷貝/ml～1095拷貝/ml的概率為；而100000拷貝/L表示一次抽樣結果在997000拷貝/L～1003000拷貝/L的概率為。抽樣單位ul不能隨意放大為ml甚至L。

【關鍵詞】實時熒光定量PCR；檢測限；統計推斷

StatisticalConclusionofLimitofQuqntitationinRealtimeFluorescenceQuantitativePCR

Abstract:LimitofquantiationisaimportantperformanceindexofassayofsampledrawingarecalculatedthroughpossiblityfunctionequationofPoissondistribution,thenthepossibilityofresultsemergedinpopulationisexample,inRealtimeFluorescencequantitaivePCRtoassayHBVDNA,onlywhensampledrawingresults≥4,significanceofdifference()couldbededucedbetweenpopulationandlimitofquantitationis4copies/uldenoting0inonesampledrawingis0,andPossibilityofresultsbetween905copies/mlto1095copies/mlisof100000copies/Ldenotingresultsbetween997000copies/Lto1003000copies/LinonesampledrawingisdrawingunitulcouldnotbereplacebymlorL.

Keywords：RealtimeFluorescencequantitativePCR；Limitofquantitation;Statisticalconclusion

檢測限是檢測方法的重要性能指標，只有在檢測報告中明確表達了檢測方法的檢測限，該檢測報告在各實驗間及同一項目的各種檢測方法間才可進行比較。能檢測到的最低分析物濃度為檢測系統的檢測限。當前，檢測限術語混亂，如：靈敏度(sensitivity)、分析靈敏度(analllyticalsensitivity)、定量限度(limitofquantitqtion)等［1］。每個詞語的實際含義中包含有各自的實驗方式、數據處理方式及由數據作出的推論等。我們采用統計學方法，以期得到一致的實時熒光定量PCR(Realtimefluorescencequantitativepolymerasechainreaction,FQPCR)檢測限，現介紹如下。

1文獻中FQPCR檢測限的描述

檢測乙型肝炎病毒DNA的文獻中檢測限使用了“最低檢出量”［2，3］、靈敏度［5～7］等術語，它等于已知的高拷貝HBVDNA血清10倍系列稀釋后能檢測到擴增曲線的最大稀釋倍數管濃度。表述有：陰性HBVDNA≤106拷貝/升［4］；熒光定量PCR法檢測靈敏度102拷貝/ml［5］、104拷貝/ml［6］、×102拷貝/ml［7］；HCⅡ法檢測靈敏度×105拷貝/ml［7］；103Eq/ml理論值時到達檢測極限［3］；PCRFP檢測HBVDNA的最低檢測出量1×101拷貝［2］；bDNA在105Eq/ml時到達檢測極限［3］。以上檢測限術語各不相同，且同一方法檢測HBVDNA在上述各實驗室發出同樣的“HBVDNA低于檢測下限”的報告時其實際HBVDNA拷貝數相差可達100倍。

2FQPCR檢測過程簡介

以測定血清乙型肝炎病毒DNA為例：將40μl血清樣本加40μlDNA提取液處理后，將其中2μl加入主反應液管中，在自動熱循環上進行溫度循環，自動熱循環儀記錄每一反應管在每一次溫度循環的熒光強度，記30次溫度循環后結束。在PCR循環過程中，每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數稱為Ct值。當30次循環后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號時，儀器默認Ct值為30，不計算起始拷貝。

3確定FQPCR檢測限的統計學原理

如果被檢物的含量和檢測方法的空白響應量的波動服從正態分布規律，則檢測限可用多次檢測空白的方法來確定。可信限為95%時檢測限＝x空白+空白；可信限為%時檢測限=x空白+空白。這是目前多數檢測限的確定方法。對核酸檢測方法的檢測限的理解可能與此有差別，但是原理應是一致的［1］，FQPCR檢測限也應是推論總體與空白有統計學差異的最小抽樣結果。

4FQPCR檢測限的統計推斷

假設病原體在血液等體液中的分布是隨機的，則單位體積中(如μl)病原顆粒數的分布服從Poisson分布。以Poisson分布的概率函數公式計算一次抽樣檢測出現的結果推論總體概率。從理論上來說，使用PCR測定技術測定病原體核酸序列的量可低至1個拷貝［2］。例如：血清標本中加入等量的DNA提取液，于離心管中煮沸，4℃放置，離心，吸取上清液2μl作模板進行擴增檢測(2μl上清液相當于抽樣1μl血清)［2］，其中至少有1個拷貝的HBVDNA才能有典型擴增反應，這時檢測結果是1拷貝/μl。由Poisson分布的概率函數公式可計算出1次抽樣檢測結果出現0時，推斷總體為1～9的概率見表1。

表1總體為1～9時抽樣為0的概率及總體

在FQPCR檢測HBVDNA中，當30次循環后某一待測管仍檢測不到高于基線水平的熒光信號(即當Ct≥30)，反應管檢測結果為0時，推論總體拷貝數為1～9的概率之和92，總體為其他的概率之和(此時報告0拷貝的可信限度低于50%)。總體為1時一次抽樣結果分別為1～9時的概率見表1。當一次抽樣結果≥4時，推論總體為1的概率≤33，所以對于病原體的檢測，一次抽樣反應管檢測結果≥4拷貝時，才可推論總體與0(空白)差異有顯著性()。因而上述檢測血清中病原體時一次抽樣反應管的檢測限是4拷貝/μl。當總體為1、2、3時一次抽樣結果為0的概率分別是88、34、79。如室間質量評價樣本靶值選擇1拷貝/μl、2拷貝/μl、3拷貝/μl時，無論實驗室實際檢測質量如何高，都將有%、%、%的實驗室檢測結果為0而被判為不符合，而報告結果的單位是ml甚至L。當總體為1拷貝/μl時表示一次抽樣結果為0的概率達，結果在0拷貝/μl～4拷貝/μl的概率為；而總體為1000拷貝/ml時表示一次抽樣結果為0的概率為0，結果在905拷貝/ml～1095拷貝/ml的概率為(Poisson分布總體50時近似正態分布，范圍是X±uα*√X，可信限為%時uα=3);總體為100000拷貝/L時表示一次抽樣結果在997000拷貝/L～1003000拷貝/L的概率為。文中推理以HBVDNA的FQPCR檢測為例，其他病源體核酸的FQPCR檢測也與其相同，檢測限是抽樣反應管的檢測限4拷貝/反應管；如反應管中加入模板量相當于μl血清則檢測限相當于拷貝/μl。此推斷僅是針對FQPCR技術本身的檢測限度，未就臨床上有意義的最小病源體核酸的拷貝數進行討論。

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