蛋白純化層析技術和工藝放大一、離子交換層析技術二、親和層析技術三、切向流過濾技術四、工藝放大一、陰離子交換陽離子交換分辨率:1選擇性:填料的性質及所帶功能基團的數目、pH值、離子強度、洗脫條件2柱效：填料顆粒大小、層析柱裝填效果3樣品：能應用的樣品量即樣品各成分性質二、親和層析原理親和層析的策略配基與目標蛋白的特異性盡可能簡單設計洗脫方案抗體純化——基于G蛋白/A蛋白的IgG的純化1.LMWMarkers2.Mousecellculture,nonredued,diluted1:103.PoolⅠ,unboundmaterial,nonredued,diluted1:104.PoolⅡ,purifiedmouseIgG1,nonredued,diluted1:10如何除去特定的污染物三、切向流過濾技術膜過濾原理膜過濾技術，又稱膜分離技術，是使用一定孔徑的過濾介質將不同物質按照大小和形狀進行選擇性分級分離的物理分離方法。膜過濾技術的優點（1）快速高效、低能耗、硬件設備簡單易于維護；（2）易于實現全自動化操作和線性放大（3）膜分離操作條件溫和、不涉及相變，有利于保持生物活性分子的結構和穩定性。過濾技術的分類按照濾膜孔徑范圍可以分為常規過濾、微濾、超濾和反滲透等過濾技術的分類按照過濾操作方式分：死端過濾(NormalFlowFiltration,NFF)切向流過濾(Cross-flowFiltration,CFF)切向流過濾切向流過濾又稱錯流過濾，過濾過程中平行于膜的切向流不斷清洗沖刷膜表面，有效的緩解膜表面濾餅層和濃差極化層的形成，避免過濾阻力的快速增加，有利于保持穩定的過濾流速和壓力，從而實現更高的膜過濾處理量，延長濾膜壽命根據濾膜流道結構形式又可分為中空纖維柱和平板膜包過濾技術的選擇膜孔徑選擇過濾操作方式選擇切向流過濾技術選擇

膜孔徑選擇(1)如希望目標物質透過膜孔，一般選擇膜孔徑大小為目標物質直徑5-10倍以上以降低過濾阻力，提高通透性：例如重組抗體純化中，CHO細胞培養液的柱前澄清，建議使用0.2或0.45μm中空纖維微濾膜，可以保持單抗分子(150kDa)良好的膜通透性，實現高收率。膜孔徑選擇(2)如希望目標物質充分截留，一般需選擇膜孔徑小于目標物質直徑1/3–1/5：例如抗體150k的濃縮和緩沖液置換，一般選擇30k或50k超濾膜實現充分截留.(3)超濾膜用于細胞收集速度更快，操作更簡單：例如中空纖維750k超濾膜用于大腸桿菌或昆蟲細胞快速收集，取代離心機。（4）微濾膜用于蛋白澄清去除細胞碎片具有更好的目標蛋白收率：例如中空纖維0.1μm濾膜用于較難過濾的大腸桿菌裂解液澄清，保護層析柱。過濾操作方式選擇過濾常見的操作方式包括NFF死端過濾和CFF切向流過濾切向流過濾技術的選擇中空纖維柱和平板膜包的優缺點：切向流過濾技術的選擇中空纖維濾膜具有開放式流道(OpenChannel)，剪切力低且容塵量高，適合病毒和蛋白等生物大分子低剪切力的溫和超濾濃縮、可直接處理高固含量高黏度的復雜料液，如細胞菌體收集、裂解液澄清和硫酸銨沉淀收集等應用。平板膜包的篩網流道結構(ScreenChannel)，適合無固體顆粒的低黏度低濃度樣品的濃縮，如層析柱之間的緩沖液交換和濃縮等。切向流過濾技術的選擇中空纖維濾膜可以用于微濾或超濾，用于蛋白/病毒等濃縮洗濾或直接處理高固含量料液；而平板膜包常用于澄清料液的超濾濃縮，對于高固含量高黏度樣品的澄清過濾存在較大局限性，易于堵塞流道。四、

ProcessScaleup工藝放大

菌種的特性，相關論文、專利，藥典，試劑等親和層析、離子層析、疏水層析、分子篩、超濾，層析介質粒徑大小，純化步驟等載體構建優化、發酵工藝優化、純化工藝優化、檢測方法選擇等發酵工藝是否能夠放大、純化工藝是否能放大等，工藝穩定性環境安全性：廢氣廢液排放，菌種的處理，選擇有關試劑的替代品知識產權的保護，專利什么時候到期？Regulatoryrequirements了解相關法律、法規、驗證計劃、QA和QC等如何保證質量？確定分析方法、檢測方法、如何保證工藝穩定性。工藝放大（以蛋白純化為例）要考慮的問題：（1）樣品、試劑：樣品來源（原核或真核、胞內或胞外等），目標蛋白的性質（等電點、分子量、穩定性等），緩沖液（pH、溶質類型、鹽離子濃度等）（2）介質的選擇（離子、疏水、親和填料，介質的化學耐受性、強度，載量，不同批次介質的穩定性）（3）質量合格，符合GMP要求，生產成本，（4）設備選擇，驗證，（5）工藝參數：不變：柱高、線性速度、樣品濃度和組成、上樣體積（