細胞培育試驗技術大全第一章細胞培育的根本原理與技術CHO細胞作為載體；細胞工程中更是離不細胞培育，雜交到了很關鍵的核心作用。第一節體外培育的概念一、根本概念體外培育〔invitroculture〕，就是將活體構造成分或活的個體從體內或其寄生體內取出，放在類似于體內生存環境的體外環境中，讓其生長和發育的方法。組織培育：是指從生物體內取出活的組織〔多指組織塊〕在體外進展培育的方法。細胞培育：是指將活細胞〔尤其是分散的細胞〕在體外進展培育的方法。器官培育：是指從生物體內取出的器官〔一般是胚胎器官〕外進展培育的方法。二、體內、外細胞的差異和分化1、差異：細胞離體后，失去了神經體液的調整和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態平衡相對穩定環境中，日久天長，易發生如下變化：分化現象減弱；形態功能趨于單一化或生存這種差異就開頭發生了。2、分化：體外培育的細胞分化力量并未完全喪失，只是環境的轉變，細胞分化的表現和在體內不同。細胞是否表現分化,關鍵在于是否存在使細胞分化的條件，如Friend細胞〔小鼠紅白血病細胞為。其次節細胞培育的一般過程一、預備工作預備工作對開展細胞培育特別重要，工作量也較大，應賜予足夠的重視，推燥與消毒，培育基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培育箱及其他儀器的檢查與調試?！惨曉囼災康亩ā踩缦稚⒓毎?、分別等〕后接入培育器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培育則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的首次培育稱為原代培育。理論上講各種動物和人體內的全部組織都可以用于培育〔尤其是胚胎組織〕的小塊，置4℃的培育液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避開接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時簡潔帶菌，為削減污染可用抗菌素處理。三、培育將取得的組織細胞接入培育瓶或培育板中的過程稱為培育。如系組織塊培育，則〔以每毫升細胞數表示〕早進入生長狀態。正常，有無污染，培育基的PH是否太酸或太堿〔由酚紅指示劑指示〕，此外對培育溫度和CO2濃度也要定時檢查。原代培育一般有一段埋伏期〔數小時到數十天不等〕，在埋伏期細胞一般不分裂“一代”。二倍體細胞一般只可能僅有不死性〔Immortality〕而無惡性?！部蓞㈤喓竺嬗嘘P章節為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細胞收集至凍存管中參加〔一般為二甲亞砜或甘油凍存管后，馬上放入37℃水中，使之在一分鐘內快速融解。然后將細胞轉入培育器皿中進展培育。影響。,超凈工作臺,三重純水蒸餾器,抽氣泵,壓力蒸氣消毒器,電熱恒溫培育箱,培育器具，CO2培育箱,恒溫水浴鍋,倒置顯微鏡,離心機,無菌過濾器,洗刷裝置,細胞計數板和電子細胞技術儀等等。第三節細胞培育的無菌環境一、無菌室無菌室的構造：一般由更衣間、緩沖間、操作間三局部組成。無菌室的消毒和防污染：為保持無菌狀態，常常消毒是必要的，通常承受每日〔使用前〕紫外照耀〔1－2小時〕，每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸〔2小時〕和每月潔爾滅擦拭地面方法。濾除菌；進出無菌室時，能使外界空氣直接對流進無菌室的操作間；等。二、超凈工作臺方向不同，可將超凈工作臺分為側流式、直流式和外流式三種類型。超凈臺的使用與保養：超凈臺的平均風速保持在0.32-0.48米/秒為宜，過大、過小均不利10－3010－15分鐘，以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態；使用完畢后，要用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈，以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。第四節常用培育器皿及清洗消毒細胞培育需要大量消耗性物品，如玻璃器皿、金屬器皿、塑料、橡膠制品、布類、紙類等，因此把握清洗、消毒學問，學會清洗、消毒方法是從事細胞培育工作必需的。一、清洗離體條件下，有害物質直接同細胞接觸，細胞對任何有害物質格外敏感，極少殘任何殘留物的要求?！惨弧巢Ａ髅蟮那逑匆话憬涍^浸泡、刷洗、浸酸、和清洗四個步驟。1、浸泡:5％鹽酸浸泡過夜；用過的玻璃器皿往往附有大量蛋白質和油脂，枯槁后不易刷洗掉，故用后應馬上浸入清水中備刷洗。2、刷洗:將浸泡后的玻璃器皿放到洗滌劑水中，用軟毛刷反復刷洗。不要留死角，并防止破壞器皿外表的光滑度。將刷洗干凈的玻璃器皿洗凈、晾干，備浸酸。3、浸酸:浸酸是將上述器皿浸泡到清潔液中，又稱酸液，通過酸液的強氧化作用去除器皿表面的可能殘留物質。浸酸不應少于六小時，一般過夜或更長。放取器皿要留神。4、沖洗:刷洗和浸酸后的器皿都必需用水充分沖洗，浸酸后器皿是否沖洗的干凈，直接影響“注水－倒空”15次以上，2－3次，晾干或烘干后包裝備用。〔二〕橡膠制品清洗的橡膠制品洗滌方法：0.5mol/LNaOH15分鐘，流水沖洗，0.5mol/LHCl15220分鐘，50℃烤干備用?！踩乘芰现破返那逑此芰现破诽攸c：質軟、易消滅劃痕；耐腐蝕力量強、但不耐熱。清洗程序：使用器皿后馬上用清水清洗，浸于自來水過夜，用紗布或棉簽和50℃清洗液刷15分鐘，流水沖洗〔15－20遍〕,蒸餾水浸洗三次，雙24小時，晾干備用?！菜摹嘲b:對細胞培育用品進展消毒前，要進展嚴密包裝，以便于消毒和貯存。常用的包裝材料：牛皮紙、硫酸紙、棉布、鋁飯盒、較大培育皿等，近幾年用鋁箔包裝，格外便利，部包扎。二、消毒和滅菌微生物污染是造成細胞培育失敗的主要緣由〔一〕物理消毒法1:紫外線是一種低能量的電磁輻射培育室消毒，用法簡潔，效果好。紫外燈的消毒效果同紫外燈的輻射強度和照耀劑量呈正相關照耀劑量和照耀時間呈正比。因此紫外燈同被照耀物的距離和照耀時間要適合。離地面230W9平方米房間，每天照耀2－3小時，期間可間隔30分鐘。燈管離地面255米，30分鐘為宜。外等操作。2:壓力蒸汽滅菌是最常用的高溫濕熱滅菌方法能造成蛋白質變性凝固而使微生物死亡。布類、物、璃器皿、屬器皿、膠和某些培育液都可以用這方法滅菌。汽消毒器中取出消毒好的物品〔不包括液體〕，應馬上放到60-70℃烤箱內烘干，再貯存備具有條件簡潔、使用便利等特點。3、高溫干熱消毒：干熱滅菌主要是將電熱烤箱內物品加熱到16090－120分鐘，殺死細菌和芽孢，到達滅菌目的。主要用于滅菌玻璃器皿〔如體積較大的燒杯、培育瓶〕、金屬器皿以及不能與蒸汽接觸的物品〔如粉劑、油劑〕。的玻璃器皿裂開。干烤箱內物品間要有空隙，物品不要靠近加熱裝置。消毒。4、過濾除菌：是將液體或氣體用微孔薄膜過濾，使大于孔徑的細菌等微生物顆粒阻留，從而到達除菌目的。在體外培育時，過濾除菌大多用于遇熱簡潔變性而失效的試劑或培育液。目前，大多試驗室承受微孔濾膜濾器除菌。關鍵步驟是安裝濾膜及無菌過濾過程。〔二〕化學消毒：潔而滅，其0.1％水溶液可對器械、皮膚、操作外表進展擦拭和浸泡消毒?！踩彩俏⑸镂廴静粐谰r的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應依據需要選擇。系統、紫外照耀、電子殺菌燈、乳酸、甲醛熏蒸等手段消毒試驗室空氣；多用潔而滅消毒滅菌或過濾除菌方法消毒培育液。其次章細胞培育液物質根底。細胞培育基其組成成分主要有：水、氨基酸、維生素、碳水化合物、無機離子及其他一些入核酸降解物、激素等。隨著動物細胞大規模培育技術的快速進展〔人用〕，基因藥物生產〔EPO、TPA等〕，臨床用單抗〔如抗人肝癌單抗、抗人肺單抗、WT3〕等。第一節水與平衡鹽溶液1、培育用水:經石英玻璃蒸餾器三次蒸餾的三蒸水或超純水凈扮裝置制備的超純水。最好用龍頭瓶貯存，2周。2、緩沖溶液、生理鹽水、平衡鹽溶液：稍后介紹。其次節細胞培育基的根本要求體外培育的細胞直接生活在培育基中，因此培育基應能滿足細胞對養分成分、促生長因子、激素、滲透壓、pH等諸多方面的要求。一、養分成分維持細胞生長的養分條件一般包括以下幾個方面：1、氨基酸：是細胞合成蛋白質的原料。全部細胞都需要12種必需氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸。此外還需要谷氨酰胺，它在細胞代謝過程中有重要作用，所含的氮是核酸中嘌令和嘧啶合成的來源，同樣也是合成三、二、一2、單糖：培育中的細胞可以進展有氧與無氧酵解，六碳糖是主要能源。此外六碳糖也是合成某些氨基酸、脂肪、核酸的原料。細胞對葡萄糖的吸取力量最高，半乳糖最低。體外培育動物細胞時，幾乎全部的培育基或培育液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。3、維生素：主要扮演輔酶、輔基的角色，必不行少。生物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆B12都是培育基常有的成分。4、無機離子與微量元素：細胞生長除需要鈉、鉀、鈣、鎂、氮和磷等根本元素，還需要微量元素，如鐵、鋅、硒、銅、錳、鉬、釩等。二、促生長因子及激素已證明：各種激素、生長因子對于維持細胞的功能、保持細胞的狀態〔分化或未分化具有格外重要的作用。有些激素對很多細胞生長有促生長作用，如胰島的松可促進表皮細胞的生長，泌乳素有促進乳腺上皮細胞生長作用等。三、滲透壓細胞必需生活在等滲環境中，大多數培育細胞對滲透壓有肯定耐受性。人血漿290mOsm/kg,可視為培育人體細胞的抱負滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對于大多數哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的范圍都適宜。四、pH氣體也是細胞生存的必需條件之一，所需氣體豐要是氧和二氧化碳。氧參與三羧酸可獵取能量，但多數細胞缺氧不能生存。在開放培育時，一般置細胞于95％空氣加5％二氧維持培育基的HH值約在℃在酸，PHNaHCO3簡潔分解為二氧化碳，很不穩定，致使緩沖系統難以準確地掌握。故這一緩沖系統適合密閉培育。HEPES結合碳酸氫鈉使用，可供給更有效的緩pHpH值。造成pHCO2，在封閉式培育過程中CO2與水結合產生碳酸，培pH很快下降。為解決這一問題，合成培育基中使用了NaHCO-CO

緩沖系統，并承受3 22O2NaHCO3處于平衡狀態。五、無毒、無污染體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗力量，因此培育基應到達無化學物質污染、無微生物污染〔如細菌、真菌、支原體、病毒等〕、無其他對細胞產生損傷作用的生物活性物質污染〔如抗體、補體〕。對于自然培育基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培育基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應格外干凈，配制后應嚴格過濾除菌。第三節自然細胞培育基自然培育基是指來自動物體液或利用組織分別提取的一類培育基，如血漿、血清、淋巴液、不行少。一、血清(serum)細胞培育的進展，培育基的質量又是關鍵，而培育基的主要成份中動物血清對細胞的生長生殖發揮著重要甚至是難以替代的作用制品質量提高的重要環節。1、血清種類:某種細胞時使用其他動物血清更適宜。24小時之內的生牛；小牛血清取自誕生10－30天的小牛。明顯，胎分最少。2:理條件和養分條件不同而異。血清中含有各種血漿蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生長因的成分和作用的爭論雖有很大進展，但仍存在一些問題。主要是：第一:血清的成份可能有幾百種之多，目前對其準確的成份、含量及其作用機制仍不清楚，難；其次:血清都是批量生產，各批量之間差異很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保證每批血清的相像性極為困難，從而使試驗的標準化和連續性受到限制；第三:不能排解血清中含有易變物質，這被認為是“瓶中惡化”的緣由之一。3、血清主要作用：供給根本養分物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必需的物質。供給激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素〔氫化可的松、地塞米松〕、類固醇激素〔雌二醇、睪酮、孕酮〕等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。供給促接觸和伸展因子使細胞貼壁免受機械損傷。對培育中的細胞起到某些保護作用要作用。血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如SeO3,硒等。4、細胞培育中使用血清的缺點缺點：某些細胞的生長〔成纖維細胞〕同時抑制另一類細胞生長〔表皮細胞〕?！踩缟踔猎斐杉毎劳觥游飩€體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持全都。性。血清的使用使得試驗和生產的標準化困難中分別純化工作很難完成。之一。5、血清的質量標準:血清質量凹凸取決于兩方面因素：一是取材對象，二是取材過程。用于備出的血清要經過嚴格的質量鑒定WHO中的要求：牛血清必需來自有文件證明無牛海綿狀腦病的牛群或國家。并應具備適當的監測系統。有些國家還要求牛血清來自未用過反芻動物蛋白飼料的牛群。證明所用牛血清中不含對所生產疫苗病毒的抑制物。血清要通過濾膜過濾除菌，保證無菌。無細菌、霉菌、支原體和病毒的污染，有些國家要求無細菌噬菌體污染。對細胞有良好的支持生殖作用。我國在對牛血清的質量2023年版《中國生物制品主要原輔料質控標準》中提出比較嚴格的支持細胞增殖檢查。血清質量的鑒定一般包括以下幾個方面：理化性質：如滲透壓、pH值、蛋白電泳圖譜、蛋白含量、激素水平、內毒素等。蛋白含量〔不低于35-45g/L〕〔20g/L)量越高。血紅蛋白也是越低越好。微生物檢測：包括細菌、真菌、支原體、病毒等。特別是對支原體、病毒的檢測，支原體是22u細胞也能生長生殖，但會影響試驗結果。檢測支原體的方法很多，如培育法PCR法、熒光染色法、電鏡觀看法等。率、貼瓶率測定法和連續傳代培育法?？寺⌒纬陕蕼y定：一般以懸浮生長的細胞為培育對象，按有限稀釋法做克隆化培育，將不同批號的血清配制成不同濃度的培育基，細胞也稀釋成不同濃度，接種到96孔板，每孔200ul就可看出不同批號血清間的區分。比較低的濃度，更能觀看出血清質量間的微小差異。貼瓶率測定：是以貼壁細胞為培育對象，將細胞稀釋至低密度，接種至平皿，每皿200或100個細胞，以不同濃度的血清培育基培育，培育肯定時間后棄培育基，染色后統計集落數，計算出集落數占接種細胞數的百分比，同樣再與標準血清比較，推斷血清質量凹凸。35％濃度，上，觀看細胞生長狀況，并將每次的計數結果與標準血清的測試結果比較。沉淀或極少沉淀，比較粘稠。如覺察血清渾濁、不透亮、含很多沉淀物，說明血清污染或血則應連續培育某些細胞，觀看細胞生長狀況。6、血清的使用與儲存:正確的使用及保存血清，才能使血清發揮應有的作用。使用前處理：大局部血清在使用前必需滅活處理，即56℃30分鐘。滅活的目的是去除血清儲存條件：血清一般儲存于－20℃，同時應避開反復凍融。購置大包裝的血清后，首先要滅活處理，然后分裝成小包裝，儲存于－20℃，使用前溶化。溶化時最好現置于4℃。溶化4℃不宜長時間存放，應盡快使用。5－2010％。過多血清簡潔使培育中的細胞發生變化，特別是一些二倍體的無限細胞系，快速生長之后簡潔發生惡性轉化。選購血清時，最好先從供給商處索取樣品進展試驗，選定一批后就要保存足夠使用61年的量，直至用另一批經過預先試驗的樣品代替。二、胚胎浸出液胚胎浸出液(embryonicextract)是早期動物細胞培育中應用的自然培育基，現已很少使用。三、水解乳蛋白水解乳蛋白(lactalbuminhydrolysate)為乳白蛋白經蛋白酶和肽酶水解的產物，含有豐富的氨基酸，是常用的自然培育基，可用于很多細胞和原代細胞的培育。第四節合成細胞培育基有肯定的配方，是一種抱負的培育基。目前合成培育基多達10多余種，有的培育基仍在不的消滅極大的促進了組織培育技術的普及進展。一、根本組分根本培育基包括四大類物質：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。無機鹽：CaCl

KClMgSO

NaClNaHCO

NaHPO

。對調整細胞滲透壓、某些酶的活性及溶2 4 3 2 4液的酸堿度都是必需的。(L型)。它需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特別的作用，對細胞的培育特別重要，能促進各—磷酸腺苷、二磷氨酰胺在溶液中很不穩定，故4150%，使用中最好單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前參加培育液中。代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是不行缺少的，對具有合成膠原力量的細胞更為重要。碳水化合物：是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核作為必含的能源物質。95％的葡萄糖轉變為乳酸，這降低了養分物質的代謝效率，降低培育基pH值，增加滲透NADH轉運系統蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統活性低而不能將糖酵解產生的H氧化磷酸化為氫酶將糖酵解產生的丙酮酸與H反響生產乳酸和另一個可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導致糖酵解與TCA循環的失衡。因此體外培方可應用。策略。很多動物細胞如CHO、BHK和雜交瘤細胞對養分物質葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其的重要方向。法。除了以上與細胞生長有關的物質以外，培育基中一般還要參加酚紅〔當溶液酸性時pH小于6.8pH8.4呈紅色〕，pH指示劑。在較為簡單的培育液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化復原劑(如谷胱甘肽)等。有的培育液還直接承受了三磷酸腺苷和輔酶A。二、常用細胞培育基(1)MEM細胞培育基系列(2)DMEM細胞培育基系列(3)RPMI-1640細胞培育基系列(4)199細胞培育基系列(5)水解乳蛋白細胞培育基(6)歐氏平衡鹽(7)F-10,F-12細胞培育基系列(8)其它類型細胞培育基三、干粉培育基的配制配制培育基要留意以下問題：認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必需添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些依據試驗需要打算。3配制是要保證充分溶解，NaHCO、谷氨酰胺等物質都要等培育基完全溶解之后才能添加。配制所用的水應是三蒸水，離子濃度很低。3所用器皿應嚴格消毒。配制好的培育基應馬上過濾，無菌保存于4度。液體培育基主要是為了科研工作的便利而設計的培育基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時可制成無內毒素等的溶液，可節約科研人員的工作量。配制方法在一個盡可能接近總體積的容器中參加比預期培育基總體積少5％的雙蒸水。在室溫〔2030℃〕的水中參加干粉培育基，輕輕攪拌，不要加熱。水洗包裝袋的內部，轉移全部的痕量干粉到容器內。NaHCO3到培育基中。用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。留意不要過分攪拌。通過緩慢攪拌參加1NNaOH1NHCLpHpH值在過濾時會上升0.10.3，pHpH0.20.3。培育基在過濾前要保持密封。第五節無血清技術及其培育基大趨勢。承受無血清培育可降低生產本錢，簡化分別純化步驟，避開病毒污染造成的危害。無血清培育基(serumfreemedium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間〔〕的無血清培育基，可滿足眾多廠商的需求。一、無血清培育基的根本配方:根本成分為根底培育基及添加組分兩大局部。連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。添加組分包括以下幾大類物質：(1〕壁和擴展因子，一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。(2〕促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是很多細胞必不行少的，如胰島素。(3〕酶抑制劑：培育貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培育基中必不行少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，到達保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。(4〕結合蛋白和轉運蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，清白蛋白。(5)微量元素：硒是最常見的。二、使用方法:目前，血清仍是動物細胞培育中最根本的的添加物，尤其是在原代培育或者從10%削減到5%，3%，1%，直至無血清培育。在降低過程中要留意觀看細胞形態是否發這些細胞一般不再連續保存，很少有細胞能夠長期培育于無血清培育基而不發生轉變的。細證細胞的特性不發生變化。為了使細胞適應無血清培育，關鍵的是使所培育細胞：處于對數生長中期>90%活細胞率適應時以較高的起始細胞接種有兩種方法使細胞適應無血清培育基〔SFM〕:1、直接適應——細胞從添加血清的培育基轉換到無血清培育基〔SFM〕中。應當:2.5×105~3.5×105細胞/ml1×106~3×106細胞/ml472×106~4×106細胞/ml時，細胞完全適應了無血清培育3~51×106~3×106細胞/ml90％時，貯備的適應了無血清培育基的細胞培育物應當再次傳代培育。2、連續適應——分好幾步把細胞從添加血清的培育基轉換到無血清培育基〔SFM〕中，與直接適應相比較，連續適應趨向對于細胞更加溫順一些。2倍正常接種密度接種生長活潑的細胞培育物到75%有血清培育基：25％SFM混合培育基中，傳代培育。當細胞密度>5×105細胞/ml2×1053×105細胞/ml細胞密度，在有血清培育基：SFM50∶50的混合培育基中傳代培育。2×1063×106細胞/ml細胞密度，2575%SFM中傳代培育。1×1063×106細胞/ml〔46天〕，在100％SFM培育基中傳代培育。351×1063×106細胞/ml90％時，貯備的適應了無血清培育基的細胞培育物應當再次傳代培育。SFM/有血清混合培育基中進展幾次傳代。在適應過程中，最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要留意，與有血SFM包含格外少的蛋白質，因而更易于受外界因素的影響。細胞培育適應替代血清：很多細胞利用連續適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培育基和包含有替代血清的培育基1∶1〔v∶v〕的混合培育基培育細胞。通過以下的混合培育基的方式，連續幾代削減當前培育基的量：1∶2，1∶4，1∶16100％替代培育基。每次適23次。FBS轉換到替代血清。一開頭就使用一樣于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發生，423次的傳代，使生長率恢復到以前的水平。能否成功的關鍵因素之一。三、使用無血清培育基的優點增加確定性性能更加全都簡潔進展純化和下游加工細胞功能的準確評估增加生長和/或產量生理反響性的較好比照增加細胞內中介物的檢測第六節無蛋白培育基與限定化學成分培育基一、無蛋白培育基〔proteinfreemidium,PFM〕：即不含有動物蛋白的培育基。無血清培育基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉鐵蛋白、牛血清白蛋白等要應用于人體，假設再生長過程中使用了含有動物蛋白質的培育基，純化過程就比較簡單，最終要到達肯定的質量標準也有肯定的難度合多種細胞生長的無蛋白培育基。二、限定化學成分培育基(chemicaldefinedmedium,CDM)：是指培育基中的素有成分都是明功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培育基更有利于分析細胞的分泌產物。目293細胞、CHOCDM問世，上海恒利安生物科技生產的水解乳蛋白培育基就屬于CDM。第七節其他細胞培育用液pH調整液等。一、平衡鹽溶液〔balancedsaltsolution,BSS〕：主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用pH穩定及供給簡潔的養分。主要用于取材時組織塊的漂洗、BSSRinger。D-Hank”sHank”s的一個主要區分Ca2+、Mg2+D-Hank”s常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較3高的適合于2s平衡液僅含有LO，35%CO2CO2培育相，溶液將快速變酸，使用時應留意。Ca2+Mg2+，應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶〔Trypsin〕EDTA溶液，有時也用膠原酶〔collagenase〕溶液。1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的力量表示，常見有1：125和1：250，即一份胰125250份酪蛋白。組織培育用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca2+、Mg2+及血清的平衡鹽溶液〔如前面的D-Hank”s〕，由于這些物質會對胰酶pH8-9，配制胰酶溶液應將液體調至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調只pH7.5，也可不調。使用細胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細胞清洗液〔100ml細胞清洗液加0.5g胰酶〕，4度保存。2、EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別結實的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進展消化。EDTA溶液的使用濃度0.02%，配制時應加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。3因此不簡潔對細胞產生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或202300U/L,作用的最正確pH6.5Ca2+、Mg2+PBS。三、pH調整液:HEPESNaHCO3溶液。1、NaHCO3

是培育基中必需添加的成分，一般狀況下按說明書的要求準確添5%CO2pH5%CO2的環境發生交換到達平衡，所使用的培育基就不能依據說明書所要求參加NaHCO3。此時常5.6%7.4%NaHCO3溶液調整培育基，使之到達所要求的pH環境。2、HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性，主要作用pH快速變動。在開放式培育條件下，觀看細胞時培育基脫離了5%CO2的環境，CO2氣體快速逸出，pHHEPESpH7.0左右。一般在HEPES。四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉0.007-0.008g/100ml,0.01g/100ml100PBS或培育基配制。五、谷氨酰胺補充液:谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培育基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定簡潔降解，4750%，所以都是在使用前添加。配制好的培育液〔含谷氨酰胺〕在42周以上時，要重參加原來量的谷氨0.002mol/L。100200mmol/L〔29.22g/L〕，30℃，完全20100ml培育液中參加0.5~2ml1~4mmol/L。六、二肽谷氨酰胺〔L-丙氨酰-L-谷氨酰胺〕在細胞培育液中L-谷氨酰胺是大局部細胞培育基的根本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩定的氨基酸，在中性的水溶液中會自發降解；需要頻繁地補加L-谷氨酰胺。因而在培育操作過程中常常：頻繁翻開蓋子，增加了破壞無菌狀態的可能性；過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培育基中氨的毒性水平。二肽谷氨酰胺在細胞培育中穩定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!二肽谷氨酰胺在細胞內被氨肽酶〔E.C.3.4.11.2〕所水解，產生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大局部細胞系統中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是最優替代物，它無需適應；既可用于貼壁細胞培育，也適合于懸浮細胞的培育。第三章細胞培育的根本方法第一節培育細胞的細胞生物學一、根本概念通常，體外培育的生物成分無外乎兩種構造形式：其一是小塊組織或稱為組織塊〔tissueblock〕，一般稱為外植塊；(isolatedcell)或者分散的細胞(dissociatedcell)。分散的過程通常在培育液或平衡鹽溶液中進展(cellsuspension)。狹義的細胞培育(cellculture)主要是指分別〔散〕細胞培育，廣義的細胞培育的概念還包括單〔個〕細胞培育(singlecellculture)。一種是群體培育〔massculture〕，將含有肯定數量細胞的懸液置于培育瓶中，讓細胞貼壁生長，集合〔confluence〕后形成均勻的單細胞層；另一種是克隆培育〔clonalculture〕，將高度稀釋的游離細胞懸液參加培育瓶中，各個細胞〔clone〕。一個細胞克隆中的全部細胞均來源于同一個祖先細胞。3細胞和Vero細胞等生產技術，用于生產多種人用、動物疫苗。其中二倍體細胞〔70KMB17和2BS〕對多種病毒具有廣泛的敏感性，用其制備病毒性疫苗可以抑制使用原代細胞時在其培育物中可能存在的各種潛在致病因子的危急當前病毒性疫苗生產較為抱負的細胞基質。Vero1962Chiba大學的Yasumura2n60，高倍體率約為1.7%，可持續地進展培育，不含任何污染因子。通常使用199培育基添5%胎牛血清進展培育。該細胞可用于多種病毒的增殖，已被WHO批準廣泛用于人用、動物用疫苗生產。二、體外培育細胞的分型〔一〕貼附型：大多數培育細胞貼附生長，屬于貼壁依靠性細胞，大致分成以下四型：1、成纖維細胞型：胞體呈梭型或不規章三角形，中心有卵圓形核，胞質突起，生長時呈放血管內皮等常呈本型狀態。培育中細胞的形態與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。2、上皮型細胞：細胞呈扁平不規章多角形，中心有圓形核，細胞彼此嚴密相連成單層膜。胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態。3、游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質常突起，呈活潑游走或變形運動，方向不規章。此型細胞不穩定，有時難以和其他細胞相區分。4、多型細胞型：有一些細胞，如神經細胞難以確定其規律和穩定的形態，可統歸于此類。〔二〕懸浮型:見于少數特別的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞簡潔大量生殖。三、培育細胞的生長和增殖過程:體內細胞生長在動態平衡環境中，而組織培育細胞的生存環境是培育瓶、皿或其它容器，生存空間和養分是有限的。當細胞增殖到達肯定密度后，則需要分別出一局部細胞和更養分液，否則將影響細胞的連續生存，這一過程叫傳代〔Passage或Subculture〕。每次傳代以后，細胞的生長和增殖過程都會受肯定的影響。另在培育中有著一系列與體內不同的生存特點?！惨弧撑嘤毎凇睱ifeSpanofCultureCells〕:所謂培育細胞生命期，是指細胞在培育30～50150～300個細胞增殖周期，能維待一年左右的生存時間，最終年輕凋亡〔Apoptosis〕。如供體為成,程中，大致都經受以下三個階段：1、原代培育〔PrimaryCulture〕期：也稱初代培育，即從體內取出組織接種培育到第一次14周。此期細胞呈活潑的移動，可見細胞分裂，但不旺盛。初代培育細胞與體內原組織在形態構造和功能活動上相像性大。細胞群是異質的〔Heterogeneous〕，也即各細胞的遺傳性狀互不一樣，細胞相互依存性強。2、傳代期：初代培育細胞一經傳代后便改稱做細胞系〔CellLine〕。在全生命期中此期的持的細胞稱二倍體細胞系〔DiploidCellLine〕。為保持二倍體細胞性質，細胞應在初代培育期10～50次左右，細胞增殖漸漸緩慢，以至完全停頓，細胞進入第三期。3在細胞生命期階段，少數狀況下，在以上三期任何一點〔多發生在傳代末或衰退期〕，由于某種因素的影響，細胞可能發生自發轉化〔SpontaneousTransformation〕。轉化的標志之〔Immortality〕〔Malignancy〕即細胞獲長久性增殖力量，這樣的細胞群體稱無限細胞系〔InfiniteCellLine〕，也稱連續細〔ContinuousCellLine〕胞獲不死性后，核型大多變成異倍體〔Heteroploid〕。細胞轉化亦可用人工方法誘發，轉化后的細胞也可能具有惡性性質。細胞永生性和惡性性非同一性狀?！捕辰M織培育細胞一代生存期全部體外培育細胞，包括初代培育及各種細胞系，當生長〔實際上細胞接種數量大時細胞增殖速度比稀有時要快。連續細胞系和會縮短傳代時間。所謂細胞“一代”的一種習慣說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細153次。它與細胞世代〔Generation〕或倍增〔Doubling〕不同；在細胞一代中3～6次。細胞傳一代后，一般要經過以下三個階段：1、埋伏期〔LatentPhase〕：細胞接種培育后，先經過一個在培育液中呈懸浮狀態的懸浮期。此時細胞胞質回縮，胞體呈圓球形。接著是細胞附著或貼附于底物外表上，稱貼壁，懸浮10～2410～30分鐘即可貼附。細胞貼附現象是一個格外簡單和與多種因素相關的過程。支持物能影響有一些特別物質如纖維連接素〔Fibronectin〕，又稱LETS〔LargerExternalTransformationSubstance〕，細胞外表蛋白〔CellSurfaceProtein：CSP〕等也參與貼附過程。這些物質都〔如有的則來自培育基中的血。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質條件之一。入生長和增殖期。細胞處在埋伏期時，可有運動活動，根本無增殖，少見分裂相。細胞埋伏期與細胞接種密度、細胞種類和培育基性質等親熱相關。初代培育細胞埋伏期長，約24～96小時或更長，連續細胞系和腫瘤細胞埋伏期短，僅6～24小時；細胞接種密度大時埋伏期短。當細胞分裂相開頭消滅并漸漸增多時，標志細胞已進入指數增生期。2、指數增生期〔LogarithmicgrowthPhase〕：這是細胞增值最旺盛的階段，細胞分裂相增分裂〔MitoticIndex：MI〕1000個細胞中的分裂相數。體外培育細胞分裂指數受細胞種類、培育液成分、pH、培育箱溫度等多種因素的影響。一般細胞的分裂指數介于0.1%～0.5%，初代細胞分裂指數低，連續細胞和腫瘤細胞分裂指數可高達3%～5%pH3～5天后，隨細胞數量不斷增多、生長空間漸趨削減、最終細胞相互接觸集合成片。細胞相互接觸后，如培育的是正常細胞，由于細胞的相互接觸能抑制細胞的運動，這種現象稱接觸抑制〔ContactInhibition〕。而惡性細胞則無接觸抑制現象，因此接觸抑制向三維空間擴展，使細胞發生積存〔Piledup〕。細胞接觸集合成片后，雖發生接觸抑制，生密度抑制〔DensityInhibition〕，導致細胞分裂停頓。因此細胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念，不應混淆。3、停滯期〔StagnatePhase〕：細胞數量達飽和密度后，細胞遂停頓增殖，進入停滯期。此時細胞數量不再增加，故也稱平頂期〔Plateau〕。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動，繼而培育液中養分漸趨耗盡，代謝產物積存、pH降低。此時需做分別培育即傳代，否則細胞會中毒，發生形態轉變，重則從底物脫落死亡，故傳代應越早越好。傳代過晚〔已有中毒跡象〕能影響下一代細胞的機能狀態。在這種狀況下，雖進展了傳代，因細胞已受損，需要恢復，至少還要再傳1～2兩代，通過換液淘汰掉死細胞和使受損稍微的細胞得以恢復后，才能再用。結果反而耽誤了時間，這是在試驗中應特別留意的。四、原代培育:即第一次培育，是指將培育物放置在體外生長環境中持續培育，中途不分割培育物的培育過程。有幾方面含義：培育物一經接種到培育器皿〔瓶〕中就不在分割，任其生長生殖；原代培育中的“代”并非細胞的“代”數，由于培育過程中細胞經屢次分裂已經產生多代子細胞；原代培育過程中不分割培育物不等于不更換培育液，也不等于不更換培育器皿。是指正常細胞在某種因子的作用下發生突變而具有癌性的細胞HeLa1951HenriettaLacks的婦女身上取下的宮頸癌細胞培育而成。此細胞系始終延用至今。10代左右就不易傳下去了，細胞的生長就會消滅停滯，大局部細胞年輕死亡。但是有極少數的細胞能夠度過“危機”而連續傳下去，這些存活的細胞一般能夠40～50,在培育過程中其50代以后又會消滅“危機”，不能再傳下去。但是有局部細胞的遺傳物質發生了轉變，并且帶有癌變的特點，有可能在培育條件下無限制地傳代下去，這種傳代細胞稱為細胞系。原代培育是建立各種細胞系〔株〕必經的階段，其是否成功與組織污染與否、供體年齡、培育且受供體年齡安康狀況的影響而導致批間差異大等缺陷纖維細胞及豬腎、猴腎、地鼠腎等原代細胞。驟，在全部的操作過程中，都必需保持培育物及生長環境的無菌。長而形成細胞單層，這種培育方式稱為單層細胞培育〔monolayerculture〕，又叫貼壁培育〔adherentculture〕。少數狀況下，培育的細胞沒有貼壁依靠性，可通過特地設備使細胞始終處于懸狀態而在體外生長，這種形式稱為懸浮培育〔suspensionculture〕。如何讓接種的細胞盡快貼壁，是打算培育成功的關鍵步驟：取決于適當的生長基質外表；培育；105個/ml左右。五、傳代培育:當原代培育成功以后，隨著培育時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間〔瓶〔passage〕〔subculture〕。對單層培育而言，80%集合或剛集合的細胞是較抱負的傳代階段。體外培育技術中所謂的傳“代”概念并不等于細胞生物學中“親代細胞”與“子代細胞”中“代”的概念。傳代培育的實質就是分割后再一次培育，可以相對地衡量培育物的培育年齡。六、生長曲線:細胞接種入培育瓶后，先進入2-24h的延遲期〔lagperiod〕，然后進入指數〔即對數期g〔即平臺期〔lhase〕。每種細胞系〔cellline〕的這些生長期〔growthphase〕都是特征性的，只要環境條件保持恒定，每一次測定結果應當是可重復的。其次節細胞分別技術一、從原代組織中分別細胞將組織塊分別〔散〕成細胞懸液的方法有多種，最常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法。從原代組織中獲得單細胞懸液的一般方法是酶解聚。細胞暴露在酶中的時間要盡可能的短，以保持最大的活性。以下步驟可以解聚整個組織，獲得較高產量的有活性細胞。1、胰蛋白酶(Trypsin)3~4mm2到3次。將盛有組織碎片的容器置于冰上，去除殘留的上清液。參加0.25％溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液中的胰蛋白酶〔100mg1ml胰蛋白酶〕。4618小時，使幾乎沒有胰蛋白酶活性的酶盡可能滲透進去。37℃孵育包含殘留胰蛋白酶的組織碎片2030分鐘。在大豆胰蛋白酶抑制劑。通過無菌不銹鋼絲網〔100～200mm〕過濾，分散全部剩余組織。計數和接種細胞，進展培育。2、膠原酶(Collagenase)用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mm小片，用Hanks”平衡液〔HBSS〕清洗組織碎片幾次。參加膠原酶〔50～200單位/mlHBSS中〕。374183mMCaCl2增加解離效率。需要進一步的解聚，在碎片中參加穎的膠原酶。HBSS中清洗懸液幾次。再一次在培育基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進展培育。3、Dispase用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4mmDispase〔0.6～2.4單位/ml溶解在無鈣鎂的平衡鹽溶液〕在3720分鐘到幾個小時。果需要進一步的解聚，在碎片中參加穎的Dispase。通過離心在平衡鹽溶液中清洗懸液幾次。再一次在培育基中懸浮細胞，計數和接種細胞，進展培育。:這一步驟并不意味著對于全部細胞系的廣泛應用90％對于無血清培育基，降低胰蛋白酶使用量。1、移棄使用過的細胞培育基。2、使用不包含有鈣鎂的平衡鹽溶液或EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸.)清洗細胞〔看表確定正確的清洗溶液〕。在培育瓶對著細胞的一面參加清洗溶液，通過12分鐘清洗細胞層，然后去除清洗液。32～3ml/25cm2(見表)37515細胞分別需要的時間因細胞系不同而有所變化。認真監測細胞分別過程，避開細胞受損傷。對難于從培育瓶基層分別的細胞系，可以輕小扣打，以加速分別過程。4、當細胞完全分別時，垂直放置培育瓶，讓細胞流到培育瓶的底部。在培育瓶中參加完全培育基，通過移液管在單層細胞外表反復吹打來分散細胞。計數并再次培育細胞。5、對于無血清培育基，參加大豆胰蛋白酶抑制劑。通常使用1∶1〔v∶v〕0.25mg/ml胰蛋白酶抑制劑到胰蛋白酶中將抑制胰蛋白酶活性。第三節細胞的凍存與復蘇為了防止因污染或技術緣由使長期培育功虧一簣(－70℃~－196℃)70均己停頓，即代謝處于完全停頓狀態，故可以長期保存。細胞低溫保存的關鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細胞的嚴峻損傷。的老化和轉化，需要凍存哺乳細胞。凍存細胞前，細胞應當特性化并檢查是否污染。有幾種一般培育基用來凍存細胞。對于包含有血清的培育基，成分可能如下：10％甘油的完全培育基，包含10％二甲基亞砜〔DMSO〕的完全培育基，505010％甘油的穎培育基，或505010％二甲基亞砜的穎培育基。對于無血清培育基，一些一般的培育基成分可能是：50507.5％二甲基亞砜的穎的無血清培育基，或7.510BSA的穎無血清培育基。1、懸浮細胞計數將要凍存的活細胞。細胞應當處于對數生長期。以大約200～400g5分鐘沉淀細胞，使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。1×1075×107細胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培育基中再次懸浮細胞，或者以0.5×1071×1027在無血清培育基中，再次懸浮細胞。分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開頭冷凍步驟。細胞以1℃/分鐘進展冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進展或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。2、貼壁細胞使用分別試劑從基層分別細胞，分別時盡可能溫順，使對細胞的損傷削減到最小。在完全生長培育基中，再次懸浮分別細胞，確定有活力細胞數。200g5分鐘沉淀細胞。使用移液管移去上清到最小體積，不要攪亂細胞。5×1061×106細胞/ml密度，在凍存液中懸浮細胞。分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內開頭冷凍步驟。細胞以1℃/分鐘進展冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進展或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉移到液氮中貯存。二、凍存細胞的復蘇:凍存細胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細胞要快速溶化，并直接參加完全生長培育基中。假設細胞對凍存劑〔DMSO或甘油〕敏感，離心去除凍存培育基，然后參加完全生長培育基中。1、直接鋪板方法取出貯存細胞，37℃水浴中快速溶化。直接用完全生長培育基鋪板細胞。1ml10~20ml完全生長培育基。進展活細胞計數，細胞接種應當至少在3×105活細胞/ml。培育細胞1224小時，更換穎的完全生長培育基，去除凍存劑。2、離心方法取出貯存細胞，37℃水浴中快速溶化。12ml25ml完全生長培育基，輕輕混勻。80xg23分鐘。棄去上清。在完全生長培育基輕輕再次懸浮細胞，并且進展活細胞計數。3×105活細胞/ml。三、細胞的分化、年輕與死亡1:一個成年人全身細胞總數約1012200多種不同類型的細胞：所以，通常把發育過程中，細胞后代在形態、構造和功能上發生差異的過程稱為細胞分化。細胞分化發生在胚胎階段，也發生在胎兒誕生以后，乃至成人階段。例如，人體血細胞的產生和分化，這個過程在人的一生中始終持續著。由旺盛生長不斷分裂的細胞，轉入分化，通常從細胞周期中G1期開頭時一個確定的點G0點“逃逸”動各不一樣。2、細胞的年輕:體外細胞培育試驗證明：50次后年輕死亡,20次后年輕死亡(與具體年齡有關);14--28次后年輕死亡,90--125次后年輕死亡。細胞年輕過程中會發生一系列的變化，包括：蛋白質合成速度降低，已有蛋白質構造變化，“自由基損傷假說”。3、細胞凋亡:細胞的死亡是個體存活的正常現象，常見的細胞死亡形式有3種：壞死、凋亡于其它兩種細胞死亡機理，如殺傷T細胞的細胞毒性作用。還有一種狀況，一局部細胞的死亡是生物個體正常生命活動〔代謝、生長、發育、分化〕的一個必要局部；似乎帶有“犧牲局部，保全整體”的意味。這種狀況下的細胞死亡，明顯地受遺傳掌握，稱為細胞凋亡。凋亡〔Apoptosis〕則是程序性的、正常的細胞死亡，是機體去除無用的或者不想要的細胞的手段。它與細胞壞死是兩個截然不同的過程，無論從形態學、合征〔HIV〕、重癥肝炎與退行性神經疾病，如老年性癡呆癥〔Alzheimer”sdisease〕、帕金〔Parkinson”sdisease〕胞凋亡與壞死的區分壞死：形態學特征-膜完整性喪失，胞漿和線粒體膨脹，全細胞裂解。生化特征-離子內環境失調：非能量依靠性的〔被動過程，在4°C也可以發生〕，隨機消化DNA〔DNA彌散狀態〕，PostlyticDNA斷裂。生理學特征-影響群組細胞：由非生理學因素引起〔如補體攻擊、代謝中毒、缺氧等〕，被巨噬細胞吞噬，四周有明顯的炎癥反響。凋亡：形態學特征-胞膜出芽，但保持完整，染色體聚攏在核膜周邊，胞漿收縮、細胞核凝集，最終細胞分裂為凋亡小體，Bcl-2家族蛋白導致線粒體膜通透性增加。生化特征--ATP依靠性的〔主動過程，在4°C不能發生〕，以核小體為單位剪切DNA〔電泳顯示為AcA,〔細胞色素c，Caspases級聯活化，膜對稱性轉變〔PS外翻〕生理學特征--只影響單個細胞，由生理學刺激誘導〔如生長因子缺乏、激素環境轉變等〕，被接近細胞和巨噬細胞吞噬，無炎癥反響。第四節細胞計數及活力測定計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數一樣。在細胞群體中總有一些因各種緣由而死亡的細胞后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。某些酶與特定的試劑發生顯色反響，也可測定細胞相對數和相對活力。二、儀器、用品與試劑1、儀器與用品：一般顯微鏡、血球計數板、試管、吸管、酶標儀〔或分光光度計〕2、試劑：0.4％臺盼蘭，0.5％四甲基偶氮唑鹽〔MTT〕、酸化異丙醇3、材料：細胞懸液三、操作步驟〔一〕細胞計數1、將血球計數板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數板上。2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液布滿蓋片和計數板之間。33分鐘。4細胞數/ml＝4大格細胞總數/4×1000010%以上，說明分散不好，需重制備細胞懸液?！捕臣毎盍?0.5ml參加試管中。20.5ml0.4%23分鐘。3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透亮狀。活力測定可以和細胞計數合起來進展，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用?！踩矼TT法測細胞相對數和相對活力MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞四周。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。l1000rpm10分鐘，棄上清液。20.5－1mlMTT，吹打成懸液。3、372小時。44—5ml酸化異丙醇〔定容〕。打勻。5、1000rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計570nm比色，酸化異丙醇調零點。留意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞確定數。第五節細胞的分裂指數一、原理：體外培育細胞生長、分裂生殖的力量，可用分裂指數來表示。它與生長曲線有肯定的重要依據。二、儀器、用品與試劑1、儀器與用品：CO2培育箱、一般顯微鏡、細胞培育血、蓋玻片、吸管2、試劑：培育液、胰酶、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液三、操作步驟1、消化細胞，將細胞懸液接至內含蓋玻片的培育皿中。2、CO48小時，使細胞長在蓋片上。23、取出蓋片，按以下挨次操作：PBS3分鐘→甲醇：冰醋酸=3：130分鐘→Giemsa10分鐘→自來水沖洗。4、蓋片晾干后反扣在載玻片上，鏡檢。5、計算:分裂指數=分裂細胞數/總細胞數×100%四、留意事項;操作時動作要輕，以免使蓋片上的細胞脫落。第六節細胞周期的測定一、原理:細胞周期指細胞一個世代所經受的時間。從一次細胞分裂完畢到下一次分裂完畢為一個周期。細胞周期反響了細胞增殖速度。BrdU滲入測定細胞周期的方法。BrdU〔5-溴脫氧尿嘧啶核苷〕參加培育基后，可做為細胞DNA復制的原料，經過兩個細胞BrdUDNAl/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺果僅經受了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。二、儀器、用品與試劑1、儀器、用品：同常規細胞培育2、試劑：BrdU〔1.0mg/ml〕，甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液三、操作步驟1、細胞生長至指數期時，向培育液中參加BrdU10μg/ml。2、44ml0.1μg。3、48小時后常規消化細胞至離心管中，留意培育上清的漂移細胞也要收集到離心管中。4、常規染色體制片〔見第三局部：染色體技術〕。5562×SSC6cm30分鐘。62×SSC液，流水沖洗。7、Giemsa10分鐘，流水沖洗，晾干。8100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數。9、計算：細胞周期〔Tc〕=48/{〔M1+2M2+3M3+4M4〕/100}〔小時〕第七節培育物的污染及防止該視為污染。依據這一概念，組織培育污染物應包括生物〔真菌、細菌、病毒和支原體〕、化學物質〔影響細胞生存、非細胞所需的化學成分〕、細胞〔非同種的其他細胞〕。其中一微生物最為多見。另外，隨著使用細胞種類增多，不同細胞穿插污染，尤其是Hela細胞的污染也時有發生，從而造成細胞不純。一、污染途徑污染物，特別是微生物常通過以下途徑進入培育體系，造成污染1、空氣：空氣是微生物及塵埃顆粒傳播的主要途徑。空氣流淌性大，假設培育操作場地于染進入操作面，造成污染。2、器材：各種培育器皿、器械消毒不徹底和洗刷不干凈導致污染，另外需要對培育箱進展定期消毒，防止形成污染3、操作：試驗操作無菌觀念不強，技術不嫻熟，使用污染的器皿或封瓶不嚴等，都可以造穿插污染。4、血清：有些血清在生產時就已經被支原體或病毒等污染，變成了污染。5、組織樣本：原代培育的污染多數來源于組織樣本；取材時碘酒消毒后脫碘不徹底，可造成碘混入組織，細胞或培育液中，影響細胞細胞生長。二、污染對培育細胞的影響及污染的檢測類象削減，細胞變得粗糙，輪廓增加細胞漿消滅顆粒、污染較嚴峻，細胞增值停頓，分裂象消逝，細胞質中消滅大量積存物，細胞變圓、脫壁。〔一〕細菌污染對培育細胞的影響及污染物的檢測作用，其生殖處于抑制狀態，細胞生長不受明顯影響，污染狀況用倒置顯微鏡觀看不易推斷。疑心培育細胞有細菌污染時，取10ml10005分鐘，沉淀中參加無抗2ml,將細胞放培育箱培育。假設培育無真的細菌污染，24小時內可以獲得陽性結果。當污染的細菌量比較大或者細菌增殖到肯定基數時，大約每20分鐘一代，會使培育系統中很快產生大量細菌，后者不僅可液外觀渾濁，肉眼就可以推斷。細菌污染大多數可以轉變培育液pH，使培育液變渾濁、染有效。〔二〕真菌污染對細胞的影響及污染物的檢測微生物污染中以真菌最多，真菌種類繁多，形態各異，但是污染后易于覺察，大多呈白色或菌污染有效?！踩持гw污染對細胞影響及污染物的檢測細胞培育〔特別是傳代細胞〕被支原體污染是個世界性問題,是細胞培育最常見的、干擾試驗結果的一種污染。但由于不易被覺察，有些污染的細胞仍在被應用。爭論說明，95％以〔〕〔A.laidlawii〕但能夠污染細胞的支原體種類是很多的11%的細胞受到支原體污染。〔一些支原體在人體是正常菌群〕發生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細胞手到多方面潛在影響DNA合成，抑制細胞生長等。胞培育基和器材要保證無菌；在細胞培育基中參加適量的抗生素。來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如-內酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對多粘菌素〔polymycin〕、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環素類、大環內酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑?！菜摹臣毎┎逦廴緦毎挠绊懠拔廴疚锏臋z測污染的細胞。三、污染的預防：防止污染，預防是關鍵，預防措施應當貫穿整個細胞培育的始終。1、器皿預備中的預防：用于細胞培育的器皿應當嚴格消毒，做到真正干凈；應當無菌的物品，要做到消毒嚴格、真正無菌；器皿的運輸、貯存過程中，要嚴格操作，防范污染。2、開頭操作前的預防：應當按廠家規定，定期清洗或更換超凈臺的空氣濾網，請專職人員燈消毒；操作應戴口罩，消毒雙手。3、操作過程中的預防；主要包括：超凈臺內放置的全部培育瓶瓶口不能與風向相逆，不允經過酒精燈燒灼，并在火焰附件工作；吸取培育液、細胞懸液等液體時，應專管專用，防止面整理好，并消毒擦拭工作面，關閉超凈臺。4、其他預防：及早凍存培育物；重要的細胞株傳代工作應有兩個人獨立進展；購入的未滅5630分鐘使血清的補體和支原體滅活外來的污染源；定期消毒培育箱。四、污染的排解:培育的細胞一旦污染應準時處理，防止污染其他細胞。通常選高壓滅菌被污染物，挽救細胞恢復正常。常用的排解微生物污染的方法有以下幾種：1、抗生素排解法：抗生素是細胞培育中殺滅細菌的主要手段。各種抗生素性質不同，對微生素處理，固然，一些有價值的細胞被污染后，仍需要用抗生素挽救，在這種狀況下，可采5－1024－48小時，再換入常規的培育液，有時可以奏效。2、加溫除菌：依據支原體耐熱性能差的特點。有人將受支原體污染的細胞置于41度中作5－10小時〔18小時〕41度對細胞本身應有較大影響，故在處理前，應先進展預試驗，確定最大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。3、動物體內接種：受微生物污染的腫瘤細胞可以接種到同種動物皮下或腹腔，借動物體內。4、與巨噬細胞共培育：在良好的體外培育條件下巨噬細胞可以存活7－10天，并可以分泌吞噬微生物并將其消化。利用96孔板將極少培育細胞與巨噬細胞共培育，可以在高度稀釋方法與抗生素聯合應用效果更佳。第四章動物細胞大規模培育技術第一節大規模培育技術應用簡介20世界60-70年月，就已創立了可用于大規模培育動物細胞的微載體培育系統和中空纖維細胞培育技術。細胞培育的原理與方法日臻完善，動物細胞大規模培育技術趨于成熟。所謂動物細胞大規模培育技術〔large-scaleculturetechnology〕是指在人工條件下〔設定ph、溫度、溶氧等〕，在細胞生物反響器〔bioreactor〕中高密度大量培育動物細胞用于生細胞及人二倍體細胞、cho〔中華倉鼠卵巢〕細胞、BHK-21(倉鼠腎細胞)、Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞，是貼壁依靠的成纖維細胞)等，并已成功生產了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產品。在過去幾十年來，該技術經有了很大進展，從使用轉瓶(rollerbottle)、CellCube等貼壁細胞培育，進展為生物反響器〔Bioreactor〕進展大規模細胞培育。第一代細胞培育技術核心量生產簡潔導致產品質量的不均一性；三是難以對同批生產進展生產和質量掌握。足所需細胞數量及其分泌產物。因而必需為工業化生產開創一種的技術方法。自70年月等。八十年月以來，人們漸漸開頭以生物反響器培育代替鼠腹水的方法獲得單克隆抗體。pH和溶氧〔DO〕的最正確掌握。細胞生物反響器可通過微機有序地定量地pH值和溶氧水平，使系統始終處于最正確狀態，以滿足動物細胞的生長對pH體中氧氣和氮氣的比例來實現掌握DO/〔CO2/NaHCO3〕pH值是一種較好的方法。〔glycosylated〕的蛋白質來說，動物細胞培育是首選的生產方式。60AVRIBHK21中將口蹄疫病毒培育成功后200ml800ml30L和100LEagle”s5%成年牛血清和蛋白胨。1967年以后，Wellcome〔Cooper動物保健〕集團分布于歐洲、非洲和南美洲8個國5000L的細胞罐大規模培育技術。αβ干擾素、血纖維蛋白溶酶原激活劑、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促紅細胞素、松弛素、生長激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿激酶、激肽釋放酶及200種單克隆抗體等。其中，口蹄疫疫苗是動物細胞大規模培育方法生產的主要產品之一。1983Wellcome公司就已能夠利用動物細胞進展大規模培育生產GenentechSV40乳動物細胞內進展高效表達，已生產出乙型肝炎疫苗。英國Wellcome公司承受8000LNamalwa細胞生產αCelltech公司用氣升式生物反響器生α、βγ干擾素；10000L氣升式生物反響器中培育雜交瘤細胞生產單克隆抗體。美國Endotronic公司用中空纖維生物反響器大規模培育動物細胞生產出免疫球蛋白G、A、M和尿激酶、人生長激素等。其次節大規模培育常用方法培育。一、動物細胞生長特性及培育溫度1、細胞生長緩慢，易污染，培育需用抗生素2、細胞大，無細胞壁，機械強度低，環境適應性差3、需氧少，不耐受強力通風與攪拌4、群體生長效應，貼壁生長〔錨地依靠性〕5、培育過程產品分布細胞內外，本錢高650代即退化死亡依據在體外培育時對生長基質依靠性差異，動物細胞可分為兩類：貼壁依靠型細胞：需要附著于帶適量電荷的固體或半固體外表才能生長，大多數動物細胞，包括非淋巴組織細胞和很多異倍體細胞均屬于這一類。胞及某些轉化細胞。培育細胞的最適溫度相當于各種細胞或組織取材機體的正常溫度最適溫度為35~37℃。偏離這一溫度，細胞正常的代謝和生長將會受到影響，甚至死亡。總的來說，培育細胞對低溫的耐力比高溫高。溫度不超過39℃時，細胞代謝強度與溫度成正比；細胞培育置于39~40℃環境中1h，即受到肯定損傷，但仍能恢復；當溫度達43℃以上時，很多細胞將死亡。當溫度下降到30~20℃時，細胞代謝降低，因而與培育基之間物初始的培育溫度時，它們原有的形態和代謝也隨之恢復到原有水平。二、貼壁培育〔attachmentculture〕是指細胞貼附在肯定的固相外表進展的培育。1、生長特性：貼壁依靠型細胞在培育時要貼附于培育〔瓶〕器皿壁上，細胞一經貼壁就迅速鋪展，然后開頭有絲分裂，并很快進入對數生長期。一般數天后就鋪滿培育外表，并形成致密的細胞單層。2、貼壁培育的優點：液。簡潔承受灌注培育，從而到達提高細胞密度的目的；因細胞固定外表，不需過濾系統。當細胞貼壁于生長基質時，很多細胞將更有效的表達一種產品。同一設備可承受不同的培育液/細胞的比例。適用于全部類型細胞。3、貼壁培育的缺點：與懸浮培育法相比擴大培育比較困難，投資大；占地面積大；不能有效監測細胞的生長；4、細胞貼壁的外表：要求具有凈陽電荷和高度外表活性。對微載體而言還要求具肯定電荷密度；假設為有機物外表，必需具有親水性，并帶陽電荷。5、貼壁培育系統：主要有轉瓶、中空纖維〔后面專題介紹〕、玻璃珠、微載體系統〔后面介紹〕等。筒形培育器-轉瓶中，培育過程中轉瓶不斷旋轉，使細胞交替接觸培育液和空氣，從而供給較好的傳質和傳熱條件。點。但也有其缺點：勞動強度大，占地空間大，單位體積供給細胞生長的外表積小，細胞生長密度低，培育時監測和掌握環境條件受到限制等?，F在使用的轉瓶培育系統包括二氧化碳培育箱和轉瓶機兩類。反響器貼壁培育此種培育方式中，細胞貼附于固定的外表生長，不由于攪拌而跟隨培育液長狀況，故多用于制備用量較小、價值高的生物藥品。CelliGenCelliGenPlusTMBioflo30006高外表積與體積比〔1200cm2/g〕，利于獲得高細胞密度?；@式攪拌系統和載體培育是目前貼壁細胞培育使用最多方式，用于雜交瘤細胞、Hela細胞、293細胞、CHO細胞及其它細胞培育。此種方式培育細胞，細胞接種后貼壁快。三、懸浮培育〔suspensionculture〕：是指細胞在反響器中自由懸浮生長的過程。主要用于非貼壁依靠型細胞培育，如雜交瘤細胞等；是在微生物發酵的根底上發通起來的。無血清懸浮培育是用人源或動物來源的蛋白或激素代替動物血清的一種細胞培育方式，它能削減后期純化工作，提高產品質量，正漸漸成為動物細胞大規模培育的爭論方向。四、固定化培育〔immobilizationculture〕：是將動物細胞與水不溶性載體結合起來，再進展培育。上述兩大類細胞都適用，具有細胞生長密度高，抗剪切力和抗污染力量強等優點，細胞易于產物分開，有利于產物分別純化。制備方法很多，包括吸附法、共價貼附法、離子/共價交聯法、包埋法、微囊法等。用固體吸附劑將細胞吸附在其外表而使細胞固定化的方法稱為吸附。力低，細胞易脫落。微載體培育和中空纖維培育是該方法的代表，稍后特地介紹。2、共價貼附法:利用共價鍵將動物細胞與固相載體結合的固定化方法稱為共價貼附法〔attachmentbycovalentbonding〕。此法可削減細胞的泄漏，但須引入化學試劑，對細胞活性有影響，且因貼附而導致集中限制小，細胞得不到保護。3、離子/共價交聯法:雙功能試劑處理細胞懸浮液，會在細胞間形成橋而絮結產生交交聯作用，此固定化細胞方法稱為離子/共價交聯法〔cross-linkingbycovalentbonding〕。交聯試劑會使一些細胞死亡，也會產生集中限制。4、包埋法:將細胞包埋在多孔載體內部制成固定化細胞的方法稱為包埋法〔entrapment〕。優點是：步驟簡便、條件溫順、負荷量大、細胞泄漏少，抗機械剪切。缺點是：集中限制，蛋白。5、微囊法〔microencapsulation〕:是用一層親水的半透膜將細胞包圍在珠狀的微囊里，細培育相像，能保護細胞少受損傷，故細胞生長好、密度高。微囊直徑掌握在200-400μm為宜。制備中應留意：溫順、快速、不損傷細胞，盡量在液體和生理條件下操作；所用試劑和膜材料對細胞無毒害；膜的孔徑可掌握，必需使養分物和代謝物自由通過；膜應有足夠機械強度抵抗培育中攪拌。五、抗凋亡策略在細胞大規模培育中的應用在大規模培育生物反響器中細胞的死亡中80%是凋亡所導致,而不是以前所認為的壞死。而延長細胞死亡，可以極大提高生物反響器生產重組蛋白的產量。Caspase4氨基酸序列，并在識別序列CCaspase割活化自身而導致信號放大，并作用于下游CaspaseCaspase家族的級聯放大，最終作用于效應蛋白，引起細胞凋亡。所以在大規模培育時干擾細胞在培育中凋亡的發生亡的力量，有利于提高細胞的培育密度、延長細胞的培育周期，從而提高目標產品的產量2-3倍。1、養分物質抗凋亡如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡緣由亡。2、基因抗凋亡細胞凋亡的機制。Bcl-2基因是目前最為有效的抗凋亡基因，在多種細胞系中均表現出很強的抗凋亡活性。3、化學方法抗凋亡凋亡發生時細胞很多部位發生生化物質的轉變caspase則發生在凋亡效應階段，這在絕大多數細胞死亡中是一樣的。因此,阻擋這些生化物質的轉變可能阻擋或至少延遲細胞凋亡的發生，運用化學物質可抑制信號效應階段的發生，被認為是抗調亡策略之一。第三節大規模培育技術的操作方式深層培育可分為：分批式、流加式、半連續式、連續式、連續式和灌注式五種。一、分批式培育〔batchculture〕是細胞規模培育進展進程中較早期承受的方式，也是其積存到適當的時間，一次性收獲細胞、產物、培育基的操作方式。該方式的特點:操作簡潔。培育周期短，染菌和細胞突變的風險小。反響器系統屬于封閉式，培育過程中與外部環境沒有物料交換，除了掌握溫度、pH值和通氣外，不進展其他任何掌握，因此操作簡潔，簡潔把握；添加任何養分成分,因此可直觀的反映細胞生長代謝的過程,是動物細胞工藝根底條件或“小試“爭論常用的手段；養操作是傳統的、常用的方法，其工業反響器(Genetech)12023L。分批培育過程中，細胞的生長分為五個階段：延滯期、對數生長期、減速期、平穩期和衰退期，見圖1。分批培育的周期時間多在3-5天，細胞生長動力學表現為細胞先經受對數生長期〔48-72h〕細胞密度到達最高值后，由于養分物質耗劫或代謝毒副產物的累積細胞生長亡后進展。二、流加式培育〔feedingculture〕1、流加式培育是在批式培育的根底上，承受機械攪拌式生物反響器系統，懸浮培育細胞或以懸浮微載體培育貼壁細胞，細胞初始接種的培育基體積一般為終體積的1/2～1/3，在培目標蛋白。2、流加培育特點：的代謝產物抑制水平。高。流加培育過程須把握細胞生長動力學，能量代謝動力學，爭論細胞環境變化時的瞬間行為。流加培育細胞培育基的設計和培育條件與環境優化，是整個培育工藝中的主要內容。和把握，可承受工藝參數的直接放大。