分子克隆技術第一部分第一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五第二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五pUC19第三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五pU1301第四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五pU1301+1.5KB外源雙酶切：

BamHI+KpnI第五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五兩種載體的抽提瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量兩種載體的限制性內切酶消化目的片段的回收及亞克隆載體的去磷酸化載體與外源DNA的連接感受態細胞的制備連接子轉化感受態細胞重組子篩選及鑒定亞克隆的主要步驟第六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五質粒載體的提取第七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五是一個復制子，載體在受體細胞中能大量繁殖，其攜帶的外源基因才能在受體細胞中得到大量擴增有1到多個限制內切酶的單一識別與切割位點，便于外源基因的插入具有選擇性的遺傳標記(如抗生素抗性標記等)以此知道它是否已進入受體細胞，并據此標記將攜帶載體的細胞從其他細胞中分離出來載體必備條件第八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五質粒是攜帶外源基因進入宿主細胞、擴增或表達外源基因的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質粒的分離與提取是最常用、最基本的實驗技術。

第九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五雙鏈閉合環狀DNA分子，具有自主復制和轉錄能力，能使子代細胞保持它們恒定的拷貝數，可表達它所攜帶的遺傳信息。它可獨立游離于細胞質中，也可整合到細菌染色體上。質粒在細胞內的復制可分為嚴謹型（只在細胞周期的一定階段進行復制，一個細胞內只有1至幾個拷貝）和松弛型（細胞周期中隨時可以復制，拷貝數較多，一般在細胞內有20個以上）質粒的基本特點第十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五堿裂解法，主要包括4個步驟：細菌的培養：從平板上挑取單菌落接種于含相應抗生素的培養基中，培養至對數生長后期菌體的收集和裂解：通過離心收集菌體，NaOH/SDS處理裂解細胞染色體DNA、RNA及其它雜質的去除：堿處理后用冰冷的KAC緩沖液處理后離心質粒的純化及沉淀：苯酚氯仿抽提，乙醇或異丙醇沉淀質粒的提取第十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五SolutionI: Tris.HCl（pH7.5） 50mM EDTA 10mM RNaseA 100μg/mlSolutionII:NaOH 0.2M SDS 1%SolutionIII:Finalconcentration KAC1.32M UsingHACtoadjustpHto4.8TE(pH8.0)：Tris.HCl（pH8.0） 10mM EDTA（pH8.0）

1mM苯酚/氯仿無水乙醇或異丙醇

堿裂解法用到的試劑第十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五solutionI重懸細菌solutionII，其中的SDS破壞細胞壁、膜，使細胞內容物釋放出來，NaOH使DNA變性、堿基對打開，使宿主染色體DNA雙鏈分開，而閉合環狀的質粒DNA處于拓撲纏繞狀態，兩個環并不分開試劑的作用（一）第十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五SolutionIII中和后，宿主DNA由于很大，堿基還未來得及配對就在冰冷的條件下與SDS、蛋白質、高分子量的RNA等纏繞在一起沉淀下來，而質粒DNA由于很小且雙鏈未分開，能夠迅速配對重新形成超螺旋，處于溶解狀態。試劑的作用（二）第十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五試劑的作用（三）苯酚/氯仿：純化質粒，去除質粒溶液中殘留的蛋白質等雜質；無水乙醇或95%乙醇或異丙醇：沉淀質粒DNATE或H2O：溶解質粒DNA第十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五實驗材料攜帶pUC19質粒載體的大腸桿菌菌液攜帶含有水稻DNA片段的pU1301載體的大腸桿菌菌液。第十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五操作步驟取含有相應載體的大腸桿菌菌液于含有相應抗生素的LA培養基上涂布或劃線分離單菌落，37℃過夜培養）；用無菌牙簽或接種環挑取單菌落，接種于含有相應抗生素的LB培養基中，37℃搖床~250r/min過夜培養第十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五吸取1.5ml菌液，12000g離心2鐘，收集菌體，倒掉上清；再次吸取1.5ml菌液收集菌體，盡量將菌液倒干凈；加入300l溶液I振蕩打勻，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底打勻沉淀或碎塊）；加入300l溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘（最好不超過2分鐘）；

加入300l溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質充分沉淀；第十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五12000g離心10分鐘；吸取800l上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質）至另一個1.5ml離心管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；12000g常溫離心10分鐘；棄上清，加500l75％乙醇，浸洗片刻后離心5分鐘（注意離心管的放置方向），棄上清；加40l滅菌超純水或TE溶解；質粒的質量檢測，-20℃保存。

第十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五氨芐青霉素（ampicillin）：其主要是通過阻礙細胞壁的合成最終導致細胞的裂解。氨芐青霉素抗性基因（ampr）：合成β-內酰胺酶，在氨芐青霉素進入細胞之前將其水解(使用濃度100μg/ml)卡那霉素（Kanamycinsulfate）

：核糖體結合，抑制蛋白質的合成（使用濃度：50μg/ml)RNaseA:

C或U的3’－P與相鄰的5’－OH處切開RNA。配制：一般以10mg/ml溶于TE中，然后在沸水中煮15分鐘，分裝成小份儲存于－20℃。試驗中用到的抗生素和酶第二十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五DNA純度：吸光值檢測：檢測260nm、280nm吸光值，紫外分光光度計A260/A280=1.8－1.9；1.8最佳，低于1.8說明有蛋白質，大于1.8說明有RNA。質量檢測：瓊脂糖凝膠電泳：一般有一至三條帶（超螺旋、線型、開環三種構型），點樣孔附近無DNA帶（無染色體DNA污染）。質粒DNA質量檢測第二十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五Hoechst33258:可與納克級的DNA結合，而幾乎沒有RNA親和性，激發波長365nm，發射波長460nm。0.1μg/mlHoechst33258適用于檢測500ng/ml的DNA濃度，染料增加到1μg/ml，分析范圍可延至15μg/ml，但會降低一定的靈敏度。缺點：更易于結合AT豐富區，對DNA組成敏感。EB:與DNA組成無關，但不如Hoechst33258敏感，且能結合RNA，激發波長302nm，發射波長590nm。3.DNA的定量（1）熒光檢測儀1OD＝50g/ml DS-DNA或

1OD＝40g/ml RNAorSS－DNA（2.）分光光度計第二十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五DNA的瓊脂糖凝膠電泳

帶電荷的物質在電場中的趨向運動稱為電泳。電泳的種類多，應用非常廣泛，它已成為分子生物學技術中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優點，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。

第二十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五在pH值為8.0－8.3時，核酸分子帶負電，在電泳時由負極向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構像不同的核酸分子泳動率出現較大的差異，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。實驗原理：第二十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五影響DNA遷移速率的因素

DNA分子大小：遷移速率U與logN成反比（N為堿基對數目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNA結構重復性）。分子越大，遷移越慢。瓊脂糖濃度：logU=logU0-Kr

膠濃度，U為遷移率，U0

為DNA的自由電泳遷移率，為膠濃度，Kr為介質阻滯系數。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNAAgarose： 0.5%：1-30kb； 0.7%：0.8-12kb1.2%：0.4-7kb；1.5%：0.2-3kb.第二十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五DNA構象：一般遷移速率超螺旋環狀>線狀DNA>開環；當條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強度、離子強度及EB含量有關。所加電壓：低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應超過5V/cm堿基組成與溫度：4-30℃一般影響不大第二十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五嵌入染料的存在：降低線性DNA遷移率，(不提倡加在電泳液中)電泳緩沖液的組成及其離子強度：影響DNA的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強度過大產熱厲害，熔化凝膠并導致DNA變性，一般采用1×TAE，0.5×或1×TBE，1×TPE（均含EDTApH8.0）第二十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五實驗步驟：將洗凈、干燥的制膠板放入制膠槽中，水平放置在工作臺上；配制0.8%的瓊脂糖凝膠：稱取0.24g瓊脂糖于30ml0.5×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫熱時倒膠；凝膠凝固后，小心拔去梳子第二十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五將DNA樣品與上樣緩沖液混合后將樣品依次加入點樣孔中；將制膠板放入電泳槽中，加入電泳緩沖液，打開電泳儀，將電壓調至不高于5V/cm，使核酸樣品向正極泳動（注意點樣孔在電泳槽的負極一端）；電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5μg/ml的溴化乙錠（EB）中浸泡10－15min，在紫外透射儀上觀察電泳結果并照相記錄。第二十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍（bromophenolblue,Bb）呈藍紫色；二甲苯晴（xylenecyanol,Xc）呈藍色，它攜帶的電荷量比溴酚藍少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍慢。

1.含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點樣孔中2.含有電泳指示劑，以指示電泳的進程上樣緩沖液：第三十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五EB：溴化乙錠，可嵌入DNA分子中，受紫外光激發而發出熒光，利用它可檢測DNA。是誘變劑，可引起插入突變，并有中度毒性，操作時應注意防護。操作時應戴手套，盡量減少臺面污染。1000×貯存液(0.5mg/mL)，使用時按1：1000稀釋配制染色液。第三十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五質粒電泳檢測：一般有一至三條帶（質粒DNA的三種構型）超螺旋線型開環第三十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五質粒電泳檢測第三十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五本科生試驗圖片第三十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五質粒載體的抽提，外源DNA的準備瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量亞克隆載體與外源DNA的限制性內切酶消化(目的片段的回收，亞克隆載體的去磷酸化)載體與外源DNA的連接感受態細胞的制備連接子轉化感受態細胞重組子的轉化及篩選、鑒定利用質粒克隆外源DNA片段的主要步驟第三十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五外源DNA克隆的要求特點不同的突出端用兩種限制酶消化后需純化質粒以提高連接效率一般酶切位點可保留,非重組克隆背景低不需CIP處理外源DNA只以一個方向插入重組質粒中相同的突出端線狀質粒DNA常需用磷酸酶（CIP）處理一般酶切位點常可保留外源DNA會以兩個方向插入重組質粒可帶有外源DNA的串聯拷貝末端為平端要求較高的DNA及連接酶不同酶切的平頭可連接非重組克隆的背景高質粒及外源DNA連接處的酶切位點消失（不同平端酶）重組質粒可能帶有外源DNA的串聯拷貝第三十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五載體及外源片段的限制酶消化:限制性內切酶切出相互匹配的粘性末端（一種酶）或不相匹配的粘性末端（不同酶消化）或平端；載體的去磷酸化:堿性磷酸酶去除載體的5’－P基團，以防載體自連；線狀載體與外源片段的連接:連接酶使雙鏈DNA5’－P與相鄰的3’－OH之間形成新的共價鍵，若質粒載體的兩條鏈都帶有5’磷酸基團，則可形成4個新的磷酸二酯鍵，但如質粒已去磷酸化，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，且產生的兩個雜交分子帶有2個單鏈切口，當雜合體導入到感受態細胞后可被修復。第三十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五限制性內切酶堿性磷酸酶連接酶幾種工具酶第三十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五有特定的識別序列，通常為4－6堿基的回文對稱序列。切割位點位于識別序列內的固定位置上，切割后在5’末端有磷酸基團，3’末端有羥基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分為3’突出端（如PstI）和5’突出端(如EcoRI)兩種其活性發揮只需Mg2＋作輔酶。II類限制性內切酶的特點第三十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五限制酶的一個活性單位（1U）：原則上指在50μl反應體系中，37℃下，經過1小時的反應將1μg的DNA完全分解所需要的酶量。限制酶的star活性：限制酶在極端非標準條件下使用時對底物DNA的特異性可能降低，即可將與原來識別的特定DNA序列不同的堿基序列切斷，這種現象叫限制酶的star活性。它的出現的頻率與酶、底物及反應條件有關。第四十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五高濃度的甘油（>5％）；酶過量（>100U/ug）；低離子強度（<25mM）；高pH(>pH8.0)；有機溶劑（DMSO，乙醇，乙二醇，二甲基乙酰胺；用其他二價陽離子代替Mg2+(Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+)不同的酶對上述因素的敏感程度不同引起星星活性的主要因素：第四十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五氯化鎂、氯化鈉/鉀、Tris鹽酸鹽、β－巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT）牛血清白蛋白（BSA）典型的限制性內切酶作用的緩沖體系成分包括：第四十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五BamHI：

G▼GATTC CCTAA▲GKpnI: GGTAC▼C C▲CATGG第四十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五含外源DNA片段的載體(M812)（50l反應體系，用1.5mltube，冰上操作）

質粒DNA

30lBamHI(10u/μl) 1lKpnI(10u/μl)

1l

10×buffer 5lddH2O 13l分別取5l酶切產物用0.8％－1.2%凝膠檢測酶切效果

50

lTotal目的載體（Puc19)的限制性內切酶消化第四十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五電泳檢測MarkerpUC19質粒對照pUC19質粒酶切產物M812質粒對照M812質粒酶切產物點樣順序：第四十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五2011本科生酶切圖片

lane1-4,pUC19酶切產物Lane5,pUC19質粒Lane6，M812質粒Lane7-10,M812酶切產物Lane11,DL-2000

marker,1

11第四十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五造成DNA酶切不完全的主要原因有：DNA不干凈，反應體系中存在酶的抑制劑；操作不當，酶或DNA加至管壁上，反應體系沒完全混合；反應條件不合適，用錯了緩沖液或溫度不合適；酶的活力不夠第四十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五DNA樣品中抑制酶活的污染物主要有：DNA樣品中的蛋白質、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高濃度的鹽等均能抑制酶切活性解決辦法：增加酶作用的單位數（10-20U/μgDNA)增大反應體積以稀釋可能的抑制劑延長反應時間消化基因組DNA時，加入終濃度1-2.5mmol/L多聚陽離子亞精胺可改善酶切效果，其作用是結合帶負電荷的污染物。純化DNA第四十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五酶切反應的終止加入終農度為12.5mmol/L的EDTA以鰲合鎂離子而終止酶的反應多數酶在65°C10分鐘可被不可逆滅活，少數65°C不失活的酶在75°C15分鐘也能失活若酶對熱具完全抗性，可通過酚抽提乙醇沉淀來純化第四十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五pUC19酶切產物的純化：加入ddH2O150l（擴大體積），加入200μl氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻后離心10min；

吸出上清，加1/10體積3MNaAc和兩倍體積乙醇，-20℃放置15分鐘以上；12000rpm4℃冷凍離心15分鐘；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風干后溶于10lddH2O；

第五十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、安全鏡并在通風櫥中進行。苯酚是強腐蝕劑，能引起嚴重燒傷。操作時應戴手套、安全鏡、穿防護服，并在通風櫥中進行。注意第五十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五當一個體系中有多種DNA分子，而我們只需要其中的某種DNA時或者反應體系中含有目的DNA子以外的其它分子如各種工具酶、dNTPs、引物及礦物油等時，可以利用凝膠電泳分離各種DNA，然后挖膠回收目的DNA帶。回收方法主要有：

1.低熔點瓊脂糖

2.透析帶電洗脫法

3.glassmilk純化

4.柱回收試劑盒DNA的回收純化：第五十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五柱式DNA膠回收試劑盒操作步驟：1.通過瓊脂糖凝膠將目的DNA帶與載體帶分開；2.紫外燈下用干凈的刀片切下含目的DNA帶的膠塊放入1.5ml離心管中；（注意：不含DNA的膠盡可能切除，在長波長的紫外燈下切膠，并盡量縮短DNA暴露在紫外光下的時間）3.按400μl/100mg膠的比例加入BindingBufferII,50-60oC水浴中10分鐘，使膠融化，每2-3分鐘混勻一次；（注意若膠的濃度較大需增加BindingBufferII的比例、增加融膠的時間，若膠塊體積較大也需增加融膠的時間）4.將融化的膠溶液轉移到套放在2ml收集管內的UNIQ-10柱中，放置2分鐘，8000rpm離心1分鐘；第五十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五5.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管內的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管內，加入500μlWashSolution,8000rpm室溫離心1分鐘；6.重復5步一次，7.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管內的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管內，12000rpm室溫離心15秒；8.將UNIQ-10柱放入一個新的1.5ml離心管內，在柱子膜中央加40μlElutionBuffer或水（pH>7.0），室溫或37oC放置2分鐘；（提高洗脫溫度到55oC-80oC有利于提高DNA的洗脫效率）9.12000rpm室溫離心1分鐘，離心管中的溶液即為回收的DNA片段第五十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五注意1.首次使用前，必須在WashSolution中加入4倍體積的無水乙醇，充分搖勻后使用，每次使用后將瓶蓋擰緊，以保持WashSolution中的乙醇含量。2.ElutionBuffer為2.0mmol/LTris-HCl,pH8.5.4oC保存。也可用PH8.0的TE或PH≥7.0的水代替。第五十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五載體去磷酸化第五十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五細菌堿性磷酸酶（BAP）,牛小腸堿性磷酸酶（CIAP）以及小蝦堿性磷酸酶（SAP）都能催化磷酸單脂鍵的水解（包括DNA、RNA、dNTP和NTP上的5’－磷酸殘基），不能催化磷酸三脂的水解。比較而言，CIAP的活性比BAP的高10－20倍,CIAP經加熱處理，容易失活但不能完全失活,若要使酶完全失活，不論是BAP還是CIAP還需要經苯酚處理。而SAP經65?C加熱15分鐘就可完全失活。活性定義：在37?C、pH9.8的條件下，1分鐘內水解對硝基苯磷酸鹽（ρ-nitrophenylphosphate)生成1μM的對硝基苯(ρ-nitrophenol)所需的酶量定義為1個活性單位（U）.堿性磷酸酶第五十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五載體去磷酸化反應體系：DNA 20lCIAP（TaKaRa） 0.5l10buffer 4.0lddH2O 15.5l37℃

或50℃反應30min以上

Total40l第五十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五去磷酸化載體的純化加0.4l0.5M的EDTA（終濃度5mM)，75℃水浴10min,使CIAP失活；加入ddH2O150l（擴大體積），加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25:24:1），顛倒混勻后離心10min；

吸出上清，加1/10體積3MNaAc和兩倍體積乙醇，-20℃放置15分鐘以上；12000rpm4℃冷凍離心15分鐘；倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風干后溶于10lddH2O（0.5mltube中）第五十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五載體與外源DNA片段的連接第六十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五連接酶使雙鏈DNA5’－P與相鄰的3’－OH之間形成新的共價鍵，若質粒載體的兩條鏈都帶有5’磷酸基團，則可形成4個新的磷酸二酯鍵，但如質粒已去磷酸化，則只能形成2個新的磷酸二酯鍵，且產生的兩個雜交分子帶有2個單鏈切口，當雜合體導入到感受態細胞后可被修復。第六十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五大腸桿菌連接酶T4噬菌體連接酶。連接酶第六十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五各種連接酶特性的比較：T4DNALigase

E.coliDNALigaseT4RNALigaseLigasesofthermophilicbacteria最適pH輔酶7.2-7.8ATP7.5-8.0NAD7.2-8.4ATPNAD平滑末端可能*不能NODNA5’P末端和RNA3’OH末端可能可能不能NORNA5’P末端和DNA3’OH末端可能不能不能NORNA和RNA少數可能不能可能NO第六十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五外源DNA 4l目的載體DNA 4l10buffer 1lT4ligase(1U/l) 1l

連接反應體系：16oC水浴保溫過夜Total10l第六十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五感受態細胞的制備及質粒的轉化轉化是指將質粒或以它為載體構建的重組子導入細菌的過程。將連接產物轉化到感受態細胞中，實現重組克隆的增殖，便于后續分子操作。可以采用多種方法篩選和鑒定目的克隆。

第六十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五感受態細胞的制備體外連接的DNA重組分子導入合適的受體細胞才能大量增殖。為了提高受體菌攝取外源DNA的能力，提高轉化效率以獲得更多的轉化子，人們摸索出了不同的方法處理細菌，使其處于感受態。目前主要采用電轉化法和CaCl2法將外源DNA導入受體細胞中，因此需要相應地制備電轉化感受態細胞和CaCl2感受態細胞。第六十六頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五將外源DNA導入大腸桿菌主要有兩種方法：CaCl2法：利用冰冷的CaCl2處理對數生長期的細胞，可以誘導其產生短暫的“感受態”，易于攝取外源DNA。106～107轉化子/gDNA。電轉化法：利用瞬間高壓在細胞上打孔。因而需用冰冷的超純水多次洗滌處于對數生長前期的細胞，以使細胞懸浮液中應含有盡量少的導電離子。109～1010轉化子/gDNA；第六十七頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五所有操作均應在無菌條件和冰上進行；所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率。操作注意事項第六十八頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五前夜接種受體菌（DH5），挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜（約16小時）；取1ml過夜培養物于100ml添加有20mMMgCl2的LB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3小時（300rpm）；將0.1MCaCl2溶液置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；CaCl2感受態細胞的制備（一）第六十九頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入100l預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入100l預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，4℃下4000rpm冷凍離心10分鐘；棄去上清，加入20l預冷0.1MCaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮；細胞懸浮液可立即用于轉化實驗,48小時內使用，可以暫時保存在4℃.長時間保存，需添加冷凍保護劑（15%～20%甘油）后超低溫冷凍貯存備用（－70℃）。CaCl2感受態細胞的制備（二）第七十頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五操作注意事項

密切注視細菌的生長狀態和密度，盡量使用對數生長期的細胞（一般通過檢測OD600來控制。DH5菌株OD600為0.5時細胞密度是5×107/ml）；所有操作均應在無菌條件和冰上進行；所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率。第七十一頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五轉化步驟

制備選擇性培養基平板：在融化的250mlLA培養基中250lAmp，250lX-gal，25lIPTG，混勻后倒入滅菌培養皿中；取出3管制備好的感受態細胞，放在冰上融化；3管感受態細胞分別加DNA連接產物、標準超螺旋質粒DNA（陽性對照）及不加入任何DNA（陰性對照），用移液器輕輕吸打均勻，在冰上放置30分鐘；第七十二頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五熱擊：將離心管放置42℃水浴，熱擊90秒，注意：勿搖動離心管；冰鎮：快速將離心管轉移至冰浴，放置1－2分鐘；復蘇：每管加400lSOC培養基，在37℃搖床溫和搖動溫育45分鐘，使細菌復蘇；第七十三頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五布皿：取適當體積均勻涂布于含有IPTG、X-gal、抗生素（Amp）的LA平板；培養：倒置培養皿，于37℃培養12－16小時

即可觀察到藍白相間的菌落（其中白色菌落為含有外源插入片段的轉化子，藍色菌落是載體自連的轉化子）第七十四頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五注意：利用氨芐青霉素抗性篩選轉化子時，轉化細胞鋪平板的密度要低（90mm平板上不得超過105個菌落），同時37℃培養不應超過20小時，具氨芐青霉素抗性的轉化體可將－內酰胺酶分泌到培養基中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而導致對氨芐青霉素敏感的衛星菌落的出現。第七十五頁，共八十三頁，編輯于2023年，星期五電轉化感受態細胞的制備（一）前夜接種受體菌（DH5），挑取單菌落于LB培養基中37℃搖床培養過夜（約16小時）；取1ml過夜培養物于100mlLB培養基中，在37℃搖床上劇烈振蕩培養約2.5-3小時（300rpm）；將菌液迅速置于冰上，同時10%的甘油置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作吸取1.5ml培養好的菌液至1.5ml離心管中，在冰上冷卻10分鐘；