第三章

衛生微生物學研究和檢測方法

1.衛生微生物檢驗與醫學微生物檢驗的區別與特點?2.樣品的采集原則？3.影響采樣代表性的因素有哪些？4.怎樣使采樣具有針對性？5.樣品采集后為什么要盡快送檢？6.怎樣保護樣品中的待檢微生物？7.樣品中抑菌物質去除方法有哪些？8.樣品的處理策略（目的）與方法9.怎樣濃縮樣品中的微生物？10.環境中的微生物數量低，怎樣提高檢出率？11.怎樣進行衛生安全性評價？第一節衛生微生物學檢測特點及基本原則一、衛生微生物檢測的特點

檢測對象多致病微生物非致病微生物條件致病微生物檢測范圍廣標本來源多人：個體及群體環境健康相關產品檢測目的特殊檢測方法靈敏濃縮去除不利因素查明突發公共衛生事件的原因（定量測定和分型檢測）衛生質量監測與安全評價（衛生指示微生物）indicatormicroorganism二、衛生微生物檢測的基本原則

采集保存運送檢測基本原則樣品種類感染標本正常人體標本衛生樣品食品、化妝品、水產品、消毒及衛生用品、水、土壤、空氣等（一）樣品的采集原則代表性與針對性采樣部位采樣方法采樣時間采樣的隨機性采樣量采樣的注意事項

避免外源性污染避免對微生物的殺滅作用和引入新的抑菌物質注意加入中和劑采樣記錄影響采樣代表性的因素采樣量：采樣部位：采樣時間：避免對微生物的殺滅作用和引入新的抑菌物質（二）衛生樣品的運送原則？1.盡快送檢！！！

多快？一般不超過3～4h

為什么？減少待測微生物的死亡。防止微生物的繁殖對計數結果的影響。（二）衛生樣品的運送原則1.盡快送檢2.注意保護待檢微生物溫度、加入保護劑、運送培養氧氣、防止溶血3.注意生物安全密封，避免泄露4.完善的樣品交接實驗室收樣應按送檢單逐項核對（三）實驗室檢驗原則1、相應的硬件條件和設備2、合格的檢驗人員3、標準/公認的檢驗方法4、實驗室質量控制5、微生物檢驗優先1、相應的硬件條件和設備微生物危害度分級致病力、傳染性、當地人群的免疫水平、有無免疫制劑和特效治療藥物等危害等級Ⅰ：低個體危害，低群體危害危害等級Ⅱ：中等個體危害，有限群體危害危害等級Ⅲ：高個體危害，低群體危害危害等級Ⅳ：高個體危害，高群體危害生物安全防護水平分級

生物安全防護水平(BSL)分級生物安全防護水平BSL-1BSL-2BSL-3BSL-4protect

P1P2P3P4實驗室的生物安全防護

ABSL-1ABSL-2ABSL-3ABSL-41、相應的硬件條件和設備2、具有合格的檢驗人員人員的資質與培訓1、相應的硬件條件和設備2、具有合格的檢驗人員3、標準/公認的檢驗方法GB、規范等沒有GB或部頒標準，按上級CDC要求1、相應的硬件條件和設備2、具有合格的檢驗人員3、標準/公認的檢驗方法4、加強實驗室質量控制（質量保證體系樣品受理部門樣品檢測部門出具檢驗報告的部門監督檢查部門

第二節

衛生微生物學研究和檢測的方法

學習內容：樣品處理損傷菌的復蘇增菌與分離定量計數分型鑒定一、樣品處理均質化乳化后再行稀釋去除抑菌物質濃縮目的菌一、樣品處理（1）均質、混勻：液體樣品電動混合、手搖混合或敲打、震蕩；固體樣品滅菌乳缽內研磨均勻、高速組織搗碎機或勻漿器；油性樣品乳化+

均質為什么要均質？有利于取樣的代表性樣品內部的待測微生物釋放但混合的時間不宜太長和過猛？一、樣品處理（1）均質化（2）去除抑菌物質中和法過濾法稀釋+過濾一、樣品處理（1）均質化：（2）抑菌物質去除（3）濃縮目的菌沉淀離心法過濾法吸附沉淀法免疫磁珠法

相應的抗體連接于磁珠-菌體復合物二、損傷菌的復蘇(resuscitation)為什么要復蘇？受冷、熱、脫水干燥、輻照、高滲透壓或防腐劑、消毒劑的作用，可能引起亞致死性損傷方法

采用無選擇壓力培養基增菌改變培養溫度、時間

先在25～37℃修復12h，在轉入選擇性培養基活菌數測定時，降低培養溫度至30～32℃

延長培養時間：48h在選擇性培養基中加入中和劑三、增菌與分離物理方法

高溫或低溫，有氧或無氧，有或無光照化學方法改變鹽的濃度嗜鹽菌培養基7.5%氯化鈉肉湯加入抑菌劑膽鹽、煌綠、多粘菌素B等最常用：選擇性增菌與分離？衛生微生物樣品特點：

目的菌數量低

細菌受損

雜菌多數量低——濃縮細菌受損——復蘇雜菌多——選擇性增菌和分離四、定量計數方法傾注平板計數法表面涂布計數法MPN法（最可能數法）比濁計數法

顯微鏡直接計數法微菌落快速計數法傾注平板計數法測定樣品中細菌、霉菌和酵母菌等數量最常用的方法CFU/ml(或g)衛生微生物檢驗基本技術之一稀釋注意事項稀釋、加樣要精確傾注瓊脂培養基溫度約45℃左右混勻2~3個平行板選擇適宜系數度計數細菌選擇30~300cfu計數霉菌選擇30~100要設立空白對照稀釋液+培養基菌落計算方法（1）菌落計數方法肉眼觀查，必要時用放大鏡檢查，求出各稀釋度的平均菌落總數。平板菌落數的選擇一個稀釋度使用兩個平板，計算平均數其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數若片狀菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘2以代表全皿菌落數平皿內如有鏈狀菌落生長時，一條鏈，可視為一個菌落數稀釋度的選擇應選擇平均菌落數在30～300之間的稀釋度若有兩個稀釋度的菌落數均在30～300之間，則視兩者之比來決定比值小于或等于2，應報告其平均數若大于2則報告其中較小的數字平均菌落數均大于300，按稀釋度最高者報告平均菌落數均小于30，按稀釋度最低者報告均無菌落生長，以＜1乘以最低稀釋倍數報告均不在30～300之間，則以最接近30或300的平均菌落數報告菌落數的報告平均菌落數乘以稀釋倍數報告菌落數在100以內時，按其實有數報告大于100時，采用二位有效數字，也可用10的指數來表示。表面涂布計數法表面涂布計數法特點加樣量小可使用不透明培養基對細菌計數培養基成分不耐熱營養成分鑒定成分抑菌成分菌落需再進行證實試驗可避免因熱瓊脂對待檢菌的損傷表面涂布計數法注意事項涂布要均勻加量不宜過多MPN法（最可能數法）10-110-210-3查MPN表MPN法特點半定量法樣品中混有其它細菌，無法采用平板菌落計數特別適宜對菌數少的樣品進行選擇性計數目前MPN法的應用食品中的大腸菌群的計數：9管法水中的大腸菌群的計數：15管法食品中的金葡菌的計數：9管法水中的糞大腸菌群、產氣莢膜梭菌的計數顯微鏡直接計數法Breed計數法0.01ml菌液計數板方格中干燥固定亞甲蘭染色油鏡觀察計數

比濁計數法原理細菌懸液的濁度與菌數成正比方法最常用的標準比濁管是麥氏比濁管分光光度計測定法準比濁管及其相應菌數管號123456789101%BaCl2（ml）0.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01%H2SO4（ml）9.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0相當的菌數（109/ml）36912151821242730微菌落快速計數法加樣0.1～1ml→醋酸纖維素薄膜→培養基襯墊→37℃、5h→取下膜→玻片上加熱干燥→透明液中30sec→貼玻片上→加熱使其完全透明→結晶紫染色→水洗后低倍鏡下鏡檢→計數形成的微菌落→推算標本中的微生物數量。濾膜過濾法常用于水樣的檢測五、分型鑒定的方法血清學分型噬菌體分型細菌素分型耐藥譜分型質粒圖譜分型通過分析質粒的數量、大小和特征進行分型分型和鑒定的基礎是分析質粒圖譜。質粒指紋圖譜質粒酶切圖譜毒素分型

脈沖場凝膠電泳分子分型

六、其他分子生物學方法PCR核酸雜交G+C含量測定基因芯片(genechips)蛋白質芯片（proteinchips）第三節衛生指示微生物指示微生物定義與分類indicatormicroorganism定義：是在常規衛生監測中，用以指示樣品衛生狀況及安全性的微生物。指示微生物分類①菌落總數、霉菌和酵母菌數評價被檢樣品的一般衛生質量、污染程度和安全性②大腸菌群、糞鏈球菌、產氣莢膜梭菌等評價檢品受人、畜糞便的污染狀況間接反映腸道病原微生物存在的可能性③某些特定環境不應檢出的菌類(如特定菌、某些致病菌、或其它指示性微生物)④病毒（包括噬菌體）間接反映腸道病毒存在的可能性。一、指示微生物的選擇（1）總則（選擇標準）數量大、易檢出檢驗方法簡單、經濟、方便；有一定的代表性，其數量變化能反映樣品衛生狀況及安全性，即數量越大，污染越嚴重，安全性越低。二、指示微生物的選擇（2）糞便污染指示菌的選擇原則①是人及溫血動物腸道的正常菌群，且數量大②在外環境中存活時間與腸道致病菌大致相似或稍長③排出體外后，在外環境中不繁殖④在污染的樣品中易檢出，未污染的樣品中不易檢出⑤對常用飲用水消毒劑（如氯、臭氧）的抵抗力應該不低于或略強于腸道致病菌⑥檢驗方法簡便，易于定量計數。三、檢測指示微生物反映樣品衛生安全性的原因①致病微生物種類繁多，檢測方法多，不可能分別檢測各種微生物②分離、鑒定需時長，不能滿足實際需要③分離、鑒定費用高，技術要求高④致病微生物的數量少，而檢測方法的靈敏度不高，可能導致假陰性結果。通常以檢測指示微生物間接反映樣品的安全性四、常用的指示微生物1.菌落總數2.糞便污染指示菌3.致病菌4.腸道病毒的指標微生物

1.菌落總數定義是指被檢樣品的單位重量(g)、容積(ml)、表面積(cm2)或體積(m3)內，所含有的能在某種培養基上經一定條件、一定時間培養后長出的菌落數量。所得菌落總數只包括那些能在普通營養瓊脂中發育、嗜中溫、需氧和兼性厭氧的細菌，不包括厭氧菌、微需氧菌、嗜冷菌及一些有特殊營養要求的細菌。1.菌落總數定義單位：cfu/g、cfu/ml、cfu/cm2

、cfu/m31.菌落總數定義單位種類細菌菌落總數霉菌菌落總數酵母菌菌落總數1.菌落總數定義單位種類衛生意義用于判定檢樣被微生物污染的程度，是某些樣品的衛生限量標準。

1.菌落總數定義單位種類衛生意義測定方法標準平板傾注法表面涂布法細菌總數的檢測

檢樣（25g或ml）↓做成幾個適當倍數的稀釋液↓選擇2～3個適宜稀釋度各以1ml分別加入無菌平皿內（每個稀釋度兩個平皿）↓每皿內加入適量平板計數瓊脂36±1℃↓48±2h菌落計數↓報告平板傾注計數稀釋加板、培養計數細菌菌落總數檢樣↓做成幾個適當倍數的稀釋液↓選擇2～3個適宜稀釋度各取0.1ml或適量，置于裝有培養基的平皿中央（每個稀釋度兩個平皿）↓用L玻棒遍涂均勻36±1℃↓48±2h菌落計數↓報告表面涂布計數法

2.糞便污染指示菌包括大腸菌群、耐熱大腸菌群大腸桿菌糞鏈球菌產氣莢膜梭菌大腸菌群、耐熱大腸菌群大腸菌群（coliformgroup）

定義：是一群能在37℃、24h內發酵乳糖產酸產氣的、需氧或兼性厭氧的、革蘭陰性的無芽胞桿菌。主要包括四個屬埃希菌屬(Escherichae)克雷伯菌屬(Klebsiella)腸桿菌屬(Enterobacter)枸櫞酸桿菌屬（Citrobacter）耐熱大腸菌群（糞大腸菌群）在44.5℃仍能生長的大腸菌群大腸桿菌普遍存在于人和動物的腸道內新鮮糞便中可達109/g若在環境中發現，可認為被人和動物的糞便污染由于大腸桿菌的鑒定方法比較復雜，用“大腸菌群”代替“大腸桿菌”但近年來隨著新方法建立，大腸桿菌的應用越來越多如美國環境保護署（EnvironmentalProtectionAgency，EPA）2000年頒布對大腸桿菌數進行測定。

大腸菌群類型及衛生意義總大腸菌群37℃生長的大腸菌群耐熱大腸菌群44.5℃仍能生長的大腸菌群指示意義：作為被人、畜糞便污染的評價指標

大腸桿菌＞耐熱大腸桿菌＞總大腸菌群大腸菌群的檢驗方法多管發酵法（最可能數法，MPN）濾膜法紙片法MPN值的獲得2.查MPN值