分子生物學研究之所以從20世紀中葉開始得到高速發展，其中最主要的原因就是現代分子生物學研究方法、特別是基因操作和基因工程技術的進步。DNA分子的切割與連接核酸分子雜交凝膠電泳細胞轉化核酸序列分析基因的人工合成基因操作基因的定點突變PCR擴增等核心技術目前一頁\總數四十四頁\編于五點基因工程誕生的基礎1、理論上的三大成就2、技術上的二大發明目前二頁\總數四十四頁\編于五點三大成就

：1.40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；1928FrederickGriffith&1944Oswald

AveryTransformationofStreptococcuspneumoniae1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細菌實驗目前三頁\總數四十四頁\編于五點2.50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklin拍出了第一張能反映DNA美麗雙螺旋結構的X射線照片MauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&Wilkins目前四頁\總數四十四頁\編于五點Descriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatson三位科學家因為對這一成果的貢獻，共享1962年的諾貝爾生物學獎目前五頁\總數四十四頁\編于五點ConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway目前六頁\總數四十四頁\編于五點3.50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。JacobandMonod目前七頁\總數四十四頁\編于五點但是，如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術，科學家就無法對這類物質進行直接的生化分析。

目前八頁\總數四十四頁\編于五點兩大技術保證：1.DNA的體外切割和連接1962年Arber發現限制性核酸內切酶，1967Gellert發現了DNA連接酶（DNAligase）目前九頁\總數四十四頁\編于五點一把特殊的剪刀

—限制性內切酶的發現

阿爾伯(Arber)、史密斯(Smith)和內森斯(Nathans)，

獲1978年諾貝爾生理學和醫學獎目前十頁\總數四十四頁\編于五點HerbertBoyer,StanleyCohen1972年獲得第一個重組DNA分子(實現不同來源DNA的重組)HerbertBoyer目前十一頁\總數四十四頁\編于五點1972-PaulBergProducedfirstrecombinantDNAusingEcoRIEcoRIrecognitionsitesλphageDNAEcoRIcutsDNAintofragmentsStickyendSV40DNAThetwofragmentssticktogetherbybasepairingDNAligaseRecombinantDNA目前十二頁\總數四十四頁\編于五點1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies目前十三頁\總數四十四頁\編于五點2.DNA的核苷酸序列分析技術DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學和生物化學的基礎上創立并發站起來的一門重要的DNA技術學，這門技術，對于從分子水平上研究基因的結構與功能的關系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值。目前十四頁\總數四十四頁\編于五點Generalprocessofgeneengineering1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子。3.將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。4.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經得到擴增的目的基因。目前十五頁\總數四十四頁\編于五點5.將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現功能表達，研究核酸序列與蛋白質功能之間的關系。目前十六頁\總數四十四頁\編于五點

目的基因基因載體重組體分切接轉篩表總體技術路線目前十七頁\總數四十四頁\編于五點分（離目的基因）切（割目的基因和載體）接（連目的基因和載體）

轉（化宿主細胞）篩（選陽性克?。┍恚ㄟ_目的基因）目前十八頁\總數四十四頁\編于五點第一節核酸的分離純化目前十九頁\總數四十四頁\編于五點主要內容

前言一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級結構的完整性（二）防止核酸的生物降解二、分離提取核酸的主要步驟（一）細胞的破碎（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除（三）核酸的沉淀

(四）核酸的濃度測定（五）核酸的保存目前二十頁\總數四十四頁\編于五點

核酸（nucleicacid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質基礎。無論是進行核酸結構還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。核酸樣品質量將直接關系到實驗的成敗。前言目前二十一頁\總數四十四頁\編于五點一、核酸分離、純化原則（一）保持核酸分子一級結構的完整性

1意義遺傳信息全部儲存在一級結構之中，核酸的—級結構還決定其高級結構的形式以及和其他生物大分子結合的方式。

2分離核酸原則：

1）溫度不要過高；

2）控制一定的pH值范圍(pH值5-9);

3）保持一定的離子強度;

4）減少物理因素對核酸降解的機械剪切力.目前二十二頁\總數四十四頁\編于五點（二）防止核酸的生物降解細胞內或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結構。所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。目前二十三頁\總數四十四頁\編于五點1DNA酶抑制劑1）金屬離子螯合劑：

DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉；2）陰離于型表面活性劑：如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質變性，并與變性蛋白結合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。目前二十四頁\總數四十四頁\編于五點2RNA酶（RNAase)抑制劑

RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。

(1)皂土（bentonite

）作用機制：皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。目前二十五頁\總數四十四頁\編于五點

(2)DEPC(二乙基焦碳酸鹽)(C2H5OCOOCOOC2H5)

粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。

作用機制：與蛋白質中His結合使蛋白變性。

使用注意：

1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環。但濃度比使蛋白質變性的濃度大100～1000倍。

2）容易降解，保存在4℃或液氮中；

3）提RNA時，0.1%DEPC浸泡器皿37℃2h。

4）劇毒。目前二十六頁\總數四十四頁\編于五點（3)肝素（4）復合硅酸鹽（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧釩核糖核苷復合物(Vanadyl-RibonucleosideComplex,VRC)目前二十七頁\總數四十四頁\編于五點二分離提取核酸的主要步驟（一）細胞的破碎

1高速組織搗碎機搗碎

2玻璃勻漿器勻漿

3超聲波處理法

4液氮研磨法

5化學處理法(SDS、LDS，吐溫80等）

6生化法（溶菌酶、纖維素酶等）目前二十八頁\總數四十四頁\編于五點（二）核蛋白的解聚、變性蛋白的去除核酸與蛋白質的結合力主要是正負靜電吸力(核酸與堿性蛋白的結合)、氫鍵和非極性的范德華力。分離核酸最困難的是將與核酸緊密結合的蛋白質分開，同時避免核酸降解。目前二十九頁\總數四十四頁\編于五點常用方法：

1加入濃鹽溶液（如NaCl）核酸-蛋白質加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚；

2加入SDSSDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質上游離出來的功能；

目前三十頁\總數四十四頁\編于五點

3酚/氯仿抽提

酚／氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。目前三十一頁\總數四十四頁\編于五點

1）使用注意酚通常是透明無色的結晶，如果酚結晶呈現粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。

2）安全操作酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應戴手套。使用酚時應注意目前三十二頁\總數四十四頁\編于五點（三）核酸的沉淀沉淀是濃縮核酸最常用的方法。優點：①改變核酸的溶解緩沖液；②重新調整核酸的濃度；③去除溶液中某些鹽離子與雜質。目前三十三頁\總數四十四頁\編于五點1核酸沉淀的鹽類及濃度目前三十四頁\總數四十四頁\編于五點2有機沉淀劑

（1）乙醇優點：

對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發除去，不影響以后實驗。缺點：

需要量大，一般要求低溫操作。目前三十五頁\總數四十四頁\編于五點（2）異丙醇優點：需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。缺點：易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀．異丙醇難以揮發除去。所以，最后用70％乙醇漂洗數次。目前三十六頁\總數四十四頁\編于五點（3）聚乙二醇（PEG）優點：可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質量的DNA片段。應用6000相對分子質量的PEG進行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。注意：PEG沉淀一般需要加入0.5mol/L的NaCl或10mmol/L的MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG。目前三十七頁\總數四十四頁\編于五點（4）精胺

精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNA。

原理是：精胺與DNA結合后，使DNA在溶液中結構凝縮而發生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質雜質與DNA分開，達到純化DNA的目的。目前三十八頁\總數四十四頁\編于五點3核酸沉淀的溫度和時間一般強調，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0℃冰水，10-15min，DNA樣品足可達到實驗要求。目前三十九頁\總數四十四頁\編于五點(四）核酸的濃度測定

1紫外分光光度法測定DNA和RNA的含量

前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應大于0.25μg/ml。

結論：在波長260nm紫外光下，1OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50μg/ml；單鏈DNA為37μg/ml；RNA為40ug/ml。目前四十頁\總數四十四頁\編于五點DNA或RNA鏈上堿基的苯環結構在紫光區具有較強吸收，其吸收峰在260nm處。波長為260nm時，DNA或RNA的光密度OD260不僅與總含量有關，也隨構型而有差異。

對標準樣品來說，濃度為1μg/ml時，DNA鈉鹽的OD260＝0.02

當OD260＝1時，dsDNA濃度約為50μg/ml

ssDNA濃度約為37μg/ml

RNA濃度約為40μg/ml

目前四十