分子生物學(xué)研究策略

ResearchStrategyonMolecularBiology3、基因分子生物學(xué)的基本技術(shù)3.1基因的分子雜交技術(shù)3.2基因的擴(kuò)增技術(shù)（PCR）3.3基因的突變技術(shù)（轉(zhuǎn)座技術(shù)）

3.4基因的表達(dá)技術(shù)（表達(dá)系統(tǒng)）3.5轉(zhuǎn)基因技術(shù)（轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、轉(zhuǎn)基因植物）3.6微陣列分析**基因表達(dá)系統(tǒng)1、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)2、芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)3、乳酸菌基因表達(dá)系統(tǒng)4、鏈霉菌基因表達(dá)系統(tǒng)5、酵母菌表達(dá)系統(tǒng)6、絲狀真菌表達(dá)系統(tǒng)7、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)8、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)9、植物生物反應(yīng)器1、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)（GeneExpressionsysteminE.coli）

1）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)：（1）遺傳背景清楚（2）目的基因表達(dá)水平高（3）培養(yǎng)周期短（4）抗感染能力強(qiáng)2）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì)完善現(xiàn)有的表達(dá)系統(tǒng)；重組蛋白質(zhì)的正確折疊；構(gòu)象形成；蛋白質(zhì)的分泌；菌體表面表達(dá)技術(shù)及其應(yīng)用；重組蛋白質(zhì)修飾加工。真核基因在不同表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)表達(dá)白細(xì)胞介素IL-3(成熟蛋白)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)20-30u

地衣芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)250-300u酵母菌表達(dá)系統(tǒng)20u哺如動(dòng)物細(xì)胞2u

2、芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)（GeneExpressionsysteminBacillus）

1）特點(diǎn)枯草芽孢桿菌是非致病的土壤微生物，嚴(yán)格生長(zhǎng)在有氧條件下。枯草芽孢桿菌遺傳學(xué)相當(dāng)先進(jìn)，很多噬菌體和質(zhì)粒適合用作克隆載體。芽孢桿菌可大量產(chǎn)生幾種商品酶，如-淀粉酶，蛋白酶及蘇云金桿菌的殺蟲晶體蛋白等，發(fā)酵技術(shù)發(fā)達(dá)。具有單層細(xì)胞膜組成較簡(jiǎn)單的細(xì)胞外殼。易于分離純化分泌蛋白2）枯草桿菌宿主菌株由于大腸桿菌的CaCl2轉(zhuǎn)化法對(duì)枯草芽孢桿菌無效（1）選擇可轉(zhuǎn)化的菌株*168菌株及突變體：營(yíng)養(yǎng)要求、芽孢形成和萌發(fā)、蛋白酶缺失、重組缺陷、限制/修飾系統(tǒng)缺陷、轉(zhuǎn)座子插入（2）選擇轉(zhuǎn)化的方法感受態(tài)轉(zhuǎn)化：原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化：電轉(zhuǎn)化：甘氨酸添加培養(yǎng)感受態(tài)其它方法，如轉(zhuǎn)導(dǎo)、結(jié)合轉(zhuǎn)移3）、可作為宿主的其它菌種：嗜堿芽孢桿菌Bacillusabcalophilus蛋白酶淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefacilus

-淀粉酶短芽孢桿菌Bacillusbrevis地衣芽孢桿菌Bacilluslicheniformis淀粉酶，抗真菌肽巨大芽孢桿菌Bacillusmegaterium淀粉酶短小芽孢桿菌Bacilluspumilus

蛋白酶球形芽孢桿菌Bacillussphaericus

滅蚊毒素蛋白嗜熱芽孢桿菌Bacillusstearothermophilus高溫-淀粉酶蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis

殺蟲晶體蛋白耐堿的芽孢桿菌Bacillusalcalophilic

堿性蛋白酶炭疽芽孢桿菌Bacillusanthracis4）枯草芽胞桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究的發(fā)展趨勢(shì)1、表達(dá)真核基因蛋白酶水解——缺陷型、抑制劑2、表達(dá)商業(yè)用酶克隆基因的整合3、表達(dá)殺蟲晶體蛋白提高殺蟲毒力，減少殺蟲時(shí)間，增加廣譜4、利用芽孢桿菌基因工程技術(shù)擴(kuò)大和加強(qiáng)在醫(yī)藥領(lǐng)域多個(gè)方面的應(yīng)用

3、乳酸菌基因表達(dá)系統(tǒng)（GeneExpressionsysteminLacticAcidBacteria）

1）特點(diǎn)：乳酸菌指發(fā)酵糖類主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱。大多數(shù)不運(yùn)動(dòng)，少數(shù)以周毛運(yùn)動(dòng)。菌體常排列成鏈。在其發(fā)酵產(chǎn)物中只有乳酸的稱為同型乳酸發(fā)酵，而產(chǎn)物中除乳酸外還有較多乙酸、乙醇、CO２等物質(zhì)的稱為異型乳酸發(fā)酵。有微好氧菌和專性厭氧菌。LacticAcidBacteriaGenera:StreptococcusLeuconostocPediococcusLactobacillusEnterococcusLactococcusAlltheabovegeneragrowinchains.Manyareusedforthefoodindustry.2）理想乳酸菌表達(dá)載體的特征：1、穩(wěn)定的遺傳、傳代能力（復(fù)制子）2、具有顯性的轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記（Emr）3、啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄是可以調(diào)控4、具有多克隆酶切位點(diǎn)3）研究進(jìn)展（1）食品發(fā)酵方面的應(yīng)用（2）乳酸菌菌種鑒定REA（RestrictionEndonucleaseAnalysis）16SrRNA（PCR）SDS（3）抗微生物和食品腐敗（4）細(xì)胞表面層和外多糖利用生物異構(gòu)化方法從亞油酸生產(chǎn)具有生理活性的共軛亞油酸（CLA）異構(gòu)體單體。篩選到一株產(chǎn)生9順,11反共軛亞油酸的乳桿菌L1，建立了亞油酸制備技術(shù)，CLA小試發(fā)酵工藝，共軛亞油酸的HPLC純化分離和毛細(xì)管電泳鑒定技術(shù)。

（5）蛋白質(zhì)降解、多肽降解和脂降解（6）分子遺傳學(xué)基因克隆表達(dá)調(diào)控染色體分析

InsulinGeneinsertedintoPlasmid

RecombinantDNAAbsorbedbyBacteria

BacteriaProducesInsulin

InsulinReadytobeAdministeredtoDiabeticPatients

（7）益生菌（PROBIOTICS）LactobacillusandBifidobacterium食品級(jí)基因修飾菌是指被導(dǎo)入源于同種或公認(rèn)的安全的食品級(jí)微生物的基因，因此具有某種優(yōu)良性狀的用于發(fā)酵食品生產(chǎn)的微生物。1、功能性基因必須源于同種菌或公認(rèn)的安全的食品級(jí)微生物；2、載體必須是食品級(jí)的，不得含有非食品級(jí)的功能性DNA片段；3、選擇性標(biāo)記不得選用各種抗生素抗性標(biāo)記。應(yīng)選用食品級(jí)的標(biāo)記基因，如糖類利用標(biāo)記、營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記等；4、宿主菌的遺傳特性清楚且穩(wěn)定，具有足夠的安全性，應(yīng)選用適當(dāng)?shù)姆肿由飳W(xué)方法如DNA序列分析、雜交等確定宿主菌的遺傳組成。食品級(jí)載反體不但是撲GRAS艘微生物，窩而且不依鴉靠抗生素距抗性作為圾選擇標(biāo)記室，因而更月為安全，宇在食品、錢醫(yī)藥方面隔具有廣泛遭的應(yīng)用潛保力。乳酸菌的朵食品級(jí)高效誘導(dǎo)塑分泌表達(dá)NIC父E系統(tǒng)是赤可控制的拆蛋白質(zhì)尚生產(chǎn)的最理鳳想的系統(tǒng)。4、鏈粒霉菌基份因表達(dá)拍系統(tǒng)（Ge牌ne夏Exp抓res尖sio棚ns釘yst播em仁inStre訓(xùn)ptom堂yces）1）特點(diǎn)大多數(shù)來換自于土壤能形成劍孢子的檢革蘭氏備陽性菌有復(fù)雜的蘇形態(tài)（以咬無中隔分枝菌絲方出式生長(zhǎng)）鏟和生理生命周期產(chǎn)生多屢種次級(jí)蔽代謝產(chǎn)飼物基因組是疫大腸桿菌主的兩倍，GC含量園高，平均輩為74%2）鏈霉另菌的載體（1）抖高拷貝挽載體pIJ1筒01承40-8危00拷激貝硫鏈辛絲菌素（酒tsr）藝，新霉素往（neo嗎），酪氨晉酸酶（m斗el）（2）低葬拷貝載體pIJ9業(yè)20續(xù)1-2拷純貝廣煙泛宿主盯能插入駝大于30衰kb的片響段（3）穿傳梭載體燃pH則JL21黨0（SC具P2*/案pBR3郵22）（4）杯柯斯載抵體（c趟osm制id）構(gòu)建基詠因文庫（5）堤接合轉(zhuǎn)周移載體pBR3寨22/p榆IJ10鄙1/RK酬2（In法cP）（釘轉(zhuǎn)移功能倚）（6）跳噬菌體麗載體C3品1衍生欄的，如躬KC3器04，恢KC偽505（7）表刺達(dá)載體利用Pt紫ipA啟標(biāo)動(dòng)子構(gòu)建弱的表達(dá)載認(rèn)體pIJ6狼021（8）招分泌載馳體利用S.lo閉ngis史poru矩s分泌的枯設(shè)草桿菌素烘抑制劑s噴ubti滿lisi罰n（SS抹I）分泌捧和抑制絲給氨酸蛋白妹酶特性構(gòu)地建如p哥IJ70部2（9）京其他載錫體（A）怨大容量?jī)摧d體細(xì)菌人狂工染色貓?bào)wBA歇C利用F因宣子復(fù)制起統(tǒng)始點(diǎn)/p探ar元件卸，1-2唯拷貝，克切隆100吳-300耀kb的片佩段（B）整昂合型載體利用pS晴AM2整住合元件構(gòu)裝建的pP笨M927（C）高罩表達(dá)載體整合高表輸達(dá)載體p籃CJR2多4，是利鍬用天藍(lán)色矩鏈霉菌A健3中的激土活調(diào)節(jié)基若因act太I(xiàn)I-O庸RF4與眨actI叮基因啟動(dòng)西子構(gòu)建的3）鏈高霉菌基濤因轉(zhuǎn)移戴的方法（1）原餅生質(zhì)體轉(zhuǎn)崇化轉(zhuǎn)化率博不高蓬,制備員過程中郊影響因仔素多,祝系統(tǒng)對(duì)禿外源D新NA的杜限制修趁飾作用（2）徹接合轉(zhuǎn)做移DNA以蓋單鏈形式握進(jìn)入宿主炒菌大腸桿惰菌S1檢7-1鈔菌株,粘質(zhì)粒社RSF拍101談0（3）電繼脈沖穿孔轉(zhuǎn)化率絨比原生激質(zhì)體高轎10-睛100斷倍（4）年噬菌體壤轉(zhuǎn)導(dǎo)4）鏈歌霉菌基定因的調(diào)嬌控和蛋欺白質(zhì)的椒分泌表釣達(dá)（1）R園NA聚合拉酶基因多體樣性天藍(lán)色今鏈霉菌勁有兩種結(jié)不同形誓式的R梢NA聚肉合酶全震酶32（與大腸索桿菌有保哀守性）和犯49（發(fā)育布階段）多龜因子,其雙啟動(dòng)程子研究表范明天藍(lán)色止鏈霉菌獻(xiàn)至少有7個(gè)串不同的摸因咽子,參赤與營(yíng)養(yǎng)翻期,孢若子形成蹈,次級(jí)猴代謝等（2）調(diào)患節(jié)基因A、途持徑專一布調(diào)節(jié)基飄因（p腳ath包way草sp奇eci等fic臘re在gul侮ato工r）具有鏈霉脅菌調(diào)節(jié)蛋貨白新家族污(SAR瘦P)正調(diào)陽控因子B、全輝局調(diào)節(jié)捉基因（道glo誦bal嫌re燦gul臥ato顯r）調(diào)控所紐奉有抗生扔素生物障合成的殊調(diào)節(jié)基規(guī)因absA編碼雙滾組分信長(zhǎng)號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同系統(tǒng)（3）調(diào)練節(jié)因子小分子脂破溶兼水溶圈的γ丁酰內(nèi)餓酯作為股激素樣填物質(zhì)激卵發(fā)次級(jí)愿代謝和失/或氣儀生菌絲訪的形成（4）鏈廊霉菌中的朗蛋白外泌甜系統(tǒng)蛋白分濃泌機(jī)制大多數(shù)游鏈霉菌槐的外泌放蛋白前刃蛋白中拿有N端信邁號(hào)序列，它們的僑外泌依靠成Sec-姑介導(dǎo)的分致泌系統(tǒng)。疲現(xiàn)已從鏈迫霉菌中已賓克隆了S通ecA，某SecY溫，Sec嘆D，Se戰(zhàn)cE和S絨ecF類繁似物。S疼ecA(籠Blan手coe陷tal.劃1998屋)屬于膜碼相關(guān)的轉(zhuǎn)乞位ATP拿ase,撞它阻止分色泌前蛋白床形成三級(jí)主結(jié)構(gòu)前體廈，促進(jìn)前數(shù)蛋白定位嫁于分泌的朗轉(zhuǎn)位酶上班。蛋白的欣轉(zhuǎn)位和揚(yáng)穿膜鏈霉菌中笨蛋白的轉(zhuǎn)悟位與穿膜賄機(jī)制尚未消搞清，如沈?qū)L-甜2與te扭ndam奸ista示t信號(hào)肽盲融合，在梅鏈霉菌中鞏只有1/懼20翻譯加產(chǎn)物轉(zhuǎn)位特（tra仁nslo寒cati遵on）至誘培養(yǎng)基和償積累在胞刷內(nèi)。5）影夕響鏈霉郊菌中基楊因表達(dá)充的因素（1）啟潤(rùn)動(dòng)子對(duì)外襖源基因表巾達(dá)的影響（2）信搶號(hào)肽對(duì)外貪源蛋白分哈泌的影響A、信辛號(hào)肽N蝴末端氨尿基酸序雹列正電截荷數(shù)對(duì)逗基因表酬達(dá)的影蛋響B(tài)、信既號(hào)肽切撤割位點(diǎn)僵后的氨昌基酸數(shù)瞧對(duì)基因拿表達(dá)的件影響C、信沿號(hào)肽和礎(chǔ)目的蛋膨白之間鼻的距離即對(duì)基因僻表達(dá)的龍影響（3）舞密碼子稼、SD野序列和億終止子周等對(duì)基劑因表達(dá)棉的影響鏈霉菌中朗翻譯起始狗密碼子為截ATG或爆GTG，陵終止密碼和子為TA留A或TA蹄G（4）D饒NA擴(kuò)增壩序列對(duì)基迎因表達(dá)的掃影響（5）展發(fā)酵條鞏件對(duì)外亡源基因膛表達(dá)的瓦影響6）鏈霉莫菌表達(dá)系干統(tǒng)優(yōu)缺點(diǎn)助及研究發(fā)鉤展趨勢(shì)（1）優(yōu)爪點(diǎn)：鏈霉菌棄工業(yè)化歪培養(yǎng)條辮件成熟調(diào),適合蜜于大規(guī)港模產(chǎn)業(yè)永化鏈霉菌基泉本為非致音病菌,不撕產(chǎn)生內(nèi)毒憑素可以進(jìn)行蠻高密度培和養(yǎng),在穩(wěn)黎定期仍能刑維持異源么蛋白的產(chǎn)捐生鏈霉菌撤可分泌供胞外酶央,利用盡信號(hào)肽誦可分泌宿外源蛋柜白鏈霉菌中嚷有許多可杏利用的轉(zhuǎn)猜錄起始信受號(hào),利用辛它可以高友表達(dá)外源執(zhí)基因（2）缺冷點(diǎn)：由于研究效鏈霉菌表兼達(dá)有生物缸活性的真丘核來源的灘蛋白還處多于初級(jí)階扁段,許多家實(shí)驗(yàn)結(jié)果星不具有普歪遍規(guī)律,投存在的問繁題有下列喉方面高活性敵啟動(dòng)子信號(hào)肽澆切割位收點(diǎn)的氨器基酸序箱列蛋白酶金的水解次級(jí)代謝獎(jiǎng)可控制啟革動(dòng)子翻譯后加燈工（3）曠研究發(fā)靈展趨勢(shì)結(jié)合基因搭組學(xué)和轉(zhuǎn)拐錄組學(xué),傍完善基因子表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化組歪合強(qiáng)啟迎動(dòng)子,篇信號(hào)和愁先導(dǎo)肽印,從套分子水面平研究滔其結(jié)構(gòu)址元件與肉功能的低關(guān)系在蛋白水和平研究蛋目白的分泌游機(jī)理,特清別是蛋白午的轉(zhuǎn)位和份轉(zhuǎn)膜機(jī)制研究次級(jí)柔代謝產(chǎn)物液生物合成絕酶系的結(jié)皮構(gòu),構(gòu)建睜新化合物瓜文庫,用旗于新藥的繡開發(fā)5、酵把母菌表議達(dá)系統(tǒng)師（Gene充Exp秘ress鍵ion裙syst熊emi搏nYea尚st）*199忽6年，完祖成了酵母跨基因組D癥NA（1草.25x旅107bp)丈全序列塌測(cè)定工屋作。Divi輝sion風(fēng):bu泰ddin病gDo悔not您fo菌rm裝fil逗ame丑ntsSome馬for彎mfi詢lame廢ntsSome壩can陳mat掛e.1）酵母堂菌基因表剩達(dá)系統(tǒng)的公宿主特點(diǎn)專：（1）型安全顯無毒,術(shù)不致市病。（2）偵有較清救楚的背拔景,容巷易遺傳騾操作。（3）簡(jiǎn)容易進(jìn)秘行載體阿DNA予的導(dǎo)入幼。（4）龜培養(yǎng)條伸件簡(jiǎn)單棚，容易互進(jìn)行高否密度發(fā)酵。（5）曠有良好辰的蛋白領(lǐng)質(zhì)分泌寺能力。（6）有緩類似高等頭真核生物奔的蛋白質(zhì)朝翻譯后的修飾洽功能。2）釀腹酒酵母眠（Sac否cha輩rom丘yce扎sc蓮ere騰vis蹲iae掃）釀酒酵母盈是最早發(fā)赤展的真核閉基因表達(dá)逆系統(tǒng)。已表達(dá)和濱生產(chǎn)乙型揀肝炎疫苗租、人胰島疤素、干擾現(xiàn)素等。釀酒酵母牧的不足之堵處：（1）發(fā)癥酵時(shí)會(huì)產(chǎn)柳生乙醇，盾乙醇的積避累會(huì)影響風(fēng)酵母本身媽的生長(zhǎng)，銳因此較難怕進(jìn)行高密訂度發(fā)酵。（2）責(zé)蛋白質(zhì)測(cè)的分泌給能力較志差。（3）字雖然能龍進(jìn)行蛋楚白質(zhì)的補(bǔ)糖基化外修飾，乎但是與水高等真匙核生物悅的相比葛，所形字成的糖烏基側(cè)鏈叮太長(zhǎng)。過度的糖非基化會(huì)引臥起副作用村。3）畢赤浮酵母（Pi牽chi邊ap社ast奧ori陪s）優(yōu)點(diǎn)：（1）可胸以使發(fā)酵分密度達(dá)到降很高的水夢(mèng)平；（2）日分泌外悔源基因鑄表達(dá)產(chǎn)規(guī)物的能炸力強(qiáng)；（3）糖蔽基化修飾索功能更接澆近高等真要核生物。不足：分子生物顏學(xué)的研究額基礎(chǔ)差，酸要對(duì)其進(jìn)遮行遺傳改編造困難較紙大；不是一記種食品校微生物轉(zhuǎn)，發(fā)酵較時(shí)又要困添加甲袖醇，所旱以要用幼它來生移產(chǎn)藥品敘或食品傾還沒有紡被廣泛羨接受。發(fā)酵雖然炊能達(dá)到很泄高的密度登，發(fā)酵周傅期一般較剝長(zhǎng)。4）酵辮母表達(dá)個(gè)系統(tǒng)研標(biāo)究進(jìn)展（1）敲外源基捆因在酵意母中的遷高表達(dá)（A）啞提高和膚控制外邪源基因蛇的轉(zhuǎn)錄罰水平*強(qiáng)啟動(dòng)漫子：磷酸揪甘油酸激勞酶基因的找啟動(dòng)子指（pgk捏1）*營(yíng)養(yǎng)調(diào)撕節(jié)啟動(dòng)子尤：碳源調(diào)測(cè)控的gal1桃，gal萌10基因，幻玉無機(jī)磷攪調(diào)控融的poh5基因*溫控惰調(diào)節(jié)啟超動(dòng)子：sir3基因（B）凱提高表郵達(dá)載體墾的在細(xì)殊胞的拷邁貝數(shù)和尤穩(wěn)定性*酵母歸菌的內(nèi)孕源質(zhì)粒芒：野生筍型2μ質(zhì)粒*核糖體哪DNA：織rDNA膛介導(dǎo)的多姓拷貝整合*單拷貝丈DNA片頭段：HI匙S4或A態(tài)OX1介縣導(dǎo)（C）提奶高外源基蜘因在酵母豪系統(tǒng)表達(dá)普水平的其抵它因素蛋白質(zhì)分鋪泌的調(diào)控翻譯效率基；酵母偏公愛密碼子甘；蛋白酶擾降解；發(fā)盆酵密度（2）提枝高外源基流因表達(dá)產(chǎn)延物的的質(zhì)帖量（A）慎表達(dá)系粗統(tǒng)的遺槐傳穩(wěn)定或性（B）胞恥內(nèi)表達(dá)產(chǎn)次物的加工撞和修飾（C）分籍泌表達(dá)產(chǎn)像物的加工占和修飾（3）酵娃母表達(dá)系蒜統(tǒng)的新應(yīng)伸用（A）酵改母表達(dá)系終統(tǒng)在人類菜基因組研息究中應(yīng)用(a）人食類基因的播功能分析襯（b）沸人類蛋白造質(zhì)相互作劇用網(wǎng)絡(luò)圖落譜分析性（c）人奶類分泌蛋牧白質(zhì)和受航體基因的們快速篩選（B）閥酵母表歌達(dá)系統(tǒng)退在藥物錦研究中榨的應(yīng)用6、絲狀型真菌表達(dá)綿系統(tǒng)（Gen宏eEx絨pres椅sion搞sys資tem各inF配ilam革ento業(yè)usF形ungi憐）1）載體尖特點(diǎn)：天然質(zhì)事粒，多強(qiáng)數(shù)為線性，僅在村粗糙鏈疤孢霉發(fā)盤現(xiàn)有環(huán)材狀質(zhì)粒呈。目前使看用的載筑體還是舞以細(xì)菌滾質(zhì)粒為陳基本結(jié)賠構(gòu)。1、營(yíng)養(yǎng)況選擇性標(biāo)單記：arg慈B（精氨訊酸原養(yǎng)以型）和amd們S（乙酰尸胺利用協(xié)）2、顯柔性選擇疲性標(biāo)記：G41襖8（氨基姥糖苷類抗責(zé)生素）3、啟動(dòng)治子：從真仁菌基因法組中篩藏選強(qiáng)啟起動(dòng)子,繭如cbh1（纖維素胸生物水解觸酶）gpd（甘油醛餃-3-磷縫酸脫氫酶墨）轉(zhuǎn)化方品法：（1）原黎生質(zhì)體轉(zhuǎn)壓化裂解酶演Nov昂ozy吵me2兩34，緣瑞或與-葡速萄醛酸律糖苷酶含混合使供用；滲透物壓穩(wěn)定挺劑（如嶺氯化鎂宴等無機(jī)賢鹽或山眠梨醇、蜂蔗糖等瓜糖）；尺聚乙二如醇（P肝EG）轉(zhuǎn)化率鵲低，僅青為10曬-30愛轉(zhuǎn)化子跑/ug慶DN認(rèn)A（2）電支擊轉(zhuǎn)化-葡萄內(nèi)醛酸糖苷環(huán)酶預(yù)處理遣，電擊條割件，12鄉(xiāng)豐.5kV葬/cm,柳電容2捏5豎F,電阻襪400鋸。（3）佛共轉(zhuǎn)化兩個(gè)質(zhì)斬粒共轉(zhuǎn)驅(qū)化在絲布狀真菌減中有較炮高的整蒸合頻率尖。一個(gè)燭質(zhì)粒攜聾帶目的招基因，犁另一個(gè)枕有篩選界標(biāo)記孔。所篩徒選的轉(zhuǎn)棋化子中循90%啦含有目科的基因練。2）基因飼的結(jié)構(gòu)和框功能真菌的核熊通常為單斧倍體核，俗基因組小縱，約為大腿腸桿菌的扛7倍，酵喊母菌的2閥倍，僅為良人類基因沙組的1%（一）揮基因轉(zhuǎn)裝錄（1）司5’非惠編碼區(qū)呢：核旁心啟動(dòng)切子單元（2）CAA偷T保守序況列較高等的玩真核生物匯中，常在炊位于-8汗0bp處榆，發(fā)現(xiàn)GC（C蘭/T）C育AATC埋T保守序脅列，絲鑼狀真菌步常位于附-10披0～-名200旅bp區(qū)售。（3）TATA保守序列常位于轉(zhuǎn)市錄啟始點(diǎn)刻上游-4赤0～-1尿00bp（4）C枕T含量豐曉富區(qū)常位于佩-10伏～-6雙0bp書（平番均-2內(nèi)0bp厚）（5）轉(zhuǎn)斥錄起始點(diǎn)通常有壇2個(gè)以訴上的轉(zhuǎn)壞錄啟始摧點(diǎn)（6）轉(zhuǎn)惑錄加工和擺翻譯帽子結(jié)敬構(gòu)（C啊ap）場(chǎng)，AUG身C5‘-端拆不翻譯m默RNA約咽5～30橡0bp，勢(shì)通常30企～70b采pCAATTAT罷ACTtspATG（7）能內(nèi)含子68%田的絲狀棚真菌的球基因含漲有內(nèi)含嗽子大多數(shù)邁的拼接宗位點(diǎn)5俗‘端掘GTP招uNG普Py3’販端懸PyA液G（8）溜3’非轎編碼區(qū)Pol稼yA寡醋聚物3）次級(jí)航代謝產(chǎn)物略的生產(chǎn)（一）莖β-內(nèi)繁酰胺抗鎖生素青霉素、另頭孢菌素殘C（1）、拌生物合成般基因克隆朋和調(diào)控研計(jì)究（A)侍編碼A活CV合鳴成酶的炎基因acvA(pcbA晌B)（-氨基攏己二酸坦-半胱塘氨酸-箭頡氨酸縮慧合成酶奇）葡萄糖調(diào)燙控，磷酸材鹽調(diào)控，枯銨調(diào)控（B）銜異青霉沈素N合辭成酶基粱因ipnA(pcbC)（C）室異青霉羽素N:繼酰基-彩輔酶A倘酰基轉(zhuǎn)點(diǎn)移酶(巴IAT扮)的基季因aatA(pen桂DE)（D）脫誘乙酰氧頭汽孢菌素C錢合成酶/忌羥化酶(愿DAOC稿/DAC譯)雙功能蔑基因cefE益F（E）柏編碼乙助酰基-登CoA慎:DA搬C乙酰扮基轉(zhuǎn)移針酶的基粥因cefG(2)刊、應(yīng)用(A)增壞加基因量娃提高產(chǎn)量(B)引甘入血紅蛋漲白基因增招加抗生素妻產(chǎn)量(C)工狡程菌直接差合成7-聰ACA或磚7-AD靜CA（二）識(shí)多肽代露謝物具有抗句微生物勸和其他荒藥理學(xué)盼活性如：線幻玉狀多肽來—由綠合色木霉竹產(chǎn)生的危丙甲菌訓(xùn)素4）發(fā)展貨趨勢(shì)1、通搶過基因崇工程技律術(shù)改良互絲狀真沫菌表達(dá)斑系統(tǒng)，歉擴(kuò)大遺軌傳背景避的深入朝了解。2、研究酒絲狀真菌竹自身的自梳我復(fù)制序狐列，提高牽DNA轉(zhuǎn)臂化率。3、研善究轉(zhuǎn)錄僚水平，搜翻譯水蒸平和翻喂譯后加雨工的調(diào)焰控，增禮加產(chǎn)量惠。4、研究誦代謝網(wǎng)絡(luò)愁的調(diào)節(jié)關(guān)六鍵點(diǎn)，最圈大限度的掩表達(dá)次級(jí)賺代謝產(chǎn)物潑，胞外酶倦，外源蛋井白昆蟲表達(dá)羊系統(tǒng)是一類愧應(yīng)用廣觀泛的真驢核表達(dá)軌系統(tǒng)，把它具有贊同大多情數(shù)高等脂真核生則物相似閉的翻譯后修堤飾、加工信以及轉(zhuǎn)移霧外源蛋白攝的能力。利用重組桿閃狀病毒陸在昆蟲贈(zèng)細(xì)胞系閣中表達(dá)類外源蛋妄白是目前趴較為流蜂行的表期達(dá)系統(tǒng)潮，而另釘一類新屬型的昆神蟲細(xì)胞括表達(dá)系尺統(tǒng)，則葵是建立裳在對(duì)果徒蠅等昆扮蟲細(xì)胞追進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)束化的基礎(chǔ)之艱上的，在甲穩(wěn)定性和點(diǎn)表達(dá)效率刻方面有著券更為突出踢的優(yōu)點(diǎn)。7、昆蟲困細(xì)胞表達(dá)乖系統(tǒng)（G宜ene地Expr篇essi仆ons敏yste尿min辜Ins肯ect懶Cell淚s）目前使用約桿狀病毒府表達(dá)系統(tǒng)太克隆和表顧達(dá)了許多牙外源基因任，例如：佩H5N1駛亞型禽流莖感病毒血殃凝素、人長(zhǎng)骨形成蛋悼白2、人務(wù)類細(xì)小病倡毒B19錢殼蛋白V遙P2，人慈尿激酶原汗cDNA配、信號(hào)肽跳引導(dǎo)源基蓬因等。抗體分子勝有鼠源單午克隆抗體石、人鼠嵌瘡合抗體、腦單鏈抗體已及人單克朗隆抗體等足多種抗體斬分子，還杜將抗體分霞子與尿激緊酶型纖溶協(xié)酶原激活什物等腫瘤遞相關(guān)蛋白雕進(jìn)行了融般合表達(dá)，拐這些抗體喚分子多數(shù)損能正確組殿裝，完成僅糖基化過酒程，具有辣相當(dāng)?shù)幕罱行浴?）昆耍蟲表達(dá)貧系統(tǒng)的夾特點(diǎn)重組蛋典白具有該完整的駕生物學(xué)箭功能為高表達(dá)弱的外源蛋糠白在細(xì)胞燥內(nèi)進(jìn)行正魚確折疊、孔二硫鍵的姑搭配及寡吃聚物的形阿成提供良吳好的環(huán)境謀，可使表疫達(dá)產(chǎn)物在縮慧結(jié)構(gòu)及功齊能上接近蝦天然蛋白覆。能進(jìn)行翻鐮譯后的加棄工修飾對(duì)蛋白折質(zhì)進(jìn)行影完整的追翻譯后殺加工，勁包括糖碰基化、欠磷酸化漂、酰基匯化、信倆號(hào)肽切疏除及肽術(shù)段的切農(nóng)割和分蓋解等，口修飾的序位點(diǎn)與排天然蛋渠白在細(xì)失胞內(nèi)的批情況完怠全一致口。表達(dá)水平哨高與其它巨真核表撞達(dá)系統(tǒng)輛相比較住，此系袍統(tǒng)最突璃出的特遵點(diǎn)就是部能獲得慶重組蛋扎白高水矮平的表憶達(dá)，最賭高可使逢目的蛋蓮白的量階達(dá)到細(xì)幼胞總蛋狠白的5歪0%。能容納因大分子趁的插入傳片段桿狀病毒掙粒子可以創(chuàng)擴(kuò)大，并遠(yuǎn)能包裝大醬的基因片惱段，但目怎前尚不知變桿狀病毒繞所能容納扁的外源基容因長(zhǎng)度的賺上限。能同時(shí)表竊達(dá)多個(gè)基敘因桿狀病貫毒表達(dá)票系統(tǒng)具逮有在同袋一細(xì)胞統(tǒng)內(nèi)同時(shí)前表達(dá)多拐個(gè)基因蹦的能力茄。既可施采用不溝同的重播組病毒央同時(shí)感安染細(xì)胞未的形式蔬，也可垂在同一斧轉(zhuǎn)移載乓體上同模時(shí)克隆嚷兩個(gè)外往源基因臺(tái)，表達(dá)桐產(chǎn)物可加加工形悅成具有肅活性的軍異源二竄聚體或匙多聚體睡。對(duì)脊椎曉動(dòng)物安建全3）昆尖蟲桿狀搞病毒的乏一般概閉念（1）昆當(dāng)蟲桿狀照病毒是已知染昆蟲病掏毒中的徹最大類緒群，是聽研究最田多、實(shí)潛用意義菜最大的進(jìn)昆蟲病全毒。它尾們是很仇多昆蟲晚病的病方原，如革家蠶的堡膿病，攔同時(shí)也妨是農(nóng)林教主要害派蟲的控覽制因子翁，對(duì)它卸的研究北具有重報(bào)要的意鏟義，目肌前對(duì)桿槳狀病毒鎮(zhèn)的研究潑日益廣嫂泛和深壇入。（2）省桿狀病奶毒的分個(gè)類桿狀病況毒因其斬病毒粒渾子呈桿蛙狀而得野名。桿狀病搏毒科（Bac薦ulo爹vir乏ida梢e）分為①包含論體桿狀叢病毒亞網(wǎng)科(Eub虧acu貞lov勵(lì)eri軍nae),又間稱真桿盯狀病毒政亞科；②非包擊含體桿遍狀病毒隔亞科(Nudi育bacu愧love嚼rina默e)。包含體桿奏狀病毒亞施科根據(jù)其娘包含體的霧多少和形姨態(tài)分為核型多賞角體病寒毒屬（Nuc選lea尾rP釋oly餡hed裁ros姓is朽Vir稅us，爛NPV）和顆粒病駕毒屬（Gran賀ulos糕isV紋irus表，GV）NPV屬傍按囊膜內(nèi)垮核衣殼數(shù)仰目的多少壞分成1）單粒包埋補(bǔ)核型多角麗體病毒（攔SNPV轎）代表種：殊家蠶核型財(cái)多角體病趟毒（Bm饅NPV）2）多粒包朋埋核型紛多角體厚病毒（唇MNP狠V）代表種：蓮苜蓿尺蠖謝核型多角徐體病毒獻(xiàn)（AcM樂NPV）自從19槍83年S鋒umme駝rs等人尖構(gòu)建了第陷一個(gè)Ac壩MNPV鳳重組病毒才表達(dá)外源粘基因以來便，桿狀病晚毒表達(dá)系茄統(tǒng)的分子課生物學(xué)及拆應(yīng)用研究舞取得了飛缺速發(fā)展。（3）桿塑狀病毒的吹基因結(jié)構(gòu)以Ac橫MNP撇V為例桿狀病殿毒基因夾組是共價(jià)閉合漿環(huán)狀的d打sDNA，其基預(yù)因組全籠長(zhǎng)13般4kb箏，共有后337修個(gè)開放煤閱讀框碎，其中嘆可以編巨碼多肽碎的區(qū)段偷共有1熱37個(gè)印。生理?xiàng)l件們下，DN顛A與富含牛Arg的向堿性蛋白紗結(jié)合，此誘DNA－緩蛋白復(fù)合站體由39籍KD的衣丑殼蛋白組懂成的外被庸所包圍，犬形成一個(gè)核殼體。若干瞎個(gè)核殼秩體外面刻在包被州一層脂燙蛋白外雄被就成束為病毒顆盆粒。幾個(gè)病赤毒顆粒聚所集成一簇吵，嵌在晶僵狀基質(zhì)中北成為一個(gè)多角體誼包含體。（4）漁桿狀病污毒表達(dá)研載體昆蟲桿狀坊病毒表達(dá)袖載體系統(tǒng)太通常由催轉(zhuǎn)移載體暢、親本病女毒和重組醬介質(zhì)三部肺分組成。摸其技術(shù)路具線分以下伏幾步:（A）徐將外源串片段克懷隆到載然體質(zhì)粒科中，置聾于桿狀渾病毒啟轉(zhuǎn)動(dòng)子控洲制之下魂，上下潮游各有嶼一段與粥親本病棉毒DN貴A相炒匹配的余側(cè)翼序哥列，構(gòu)煮建成轉(zhuǎn)移載譜體；（B）把柴轉(zhuǎn)移載體洞和野生型素病毒共轉(zhuǎn)染入昆蟲旋細(xì)胞，蜻通過同孔源重組芒將外源觀片段插辨入到病煮毒基因舌組，以忌特定的劇篩選標(biāo)俱記和方初法獲得壁重組病碌毒。（C）蓮當(dāng)重組太病毒在蛇受體細(xì)菌胞內(nèi)復(fù)繭制時(shí)，皺外源片債段也得婚到了表澤達(dá)。最寬后空斑咱純化重絹組病毒拆，擴(kuò)大躺培養(yǎng)，分離、勺純化所表達(dá)戶的外源裙蛋白。轉(zhuǎn)移載承體構(gòu)建由于A碎cMN森PV基稠因組的扭巨大，木不可能芳用單一攔的限制紋性酶切驕位點(diǎn)來許對(duì)它進(jìn)沾行操作打，所以警目前使忠用的桿棕狀病毒遙表達(dá)載告體系統(tǒng)肚大多采貪用構(gòu)建塞轉(zhuǎn)移載鑼體（t證ran偶sfe隔rv拒ect忙or）勢(shì)。將病毒溉非必需慎基因pol外h基因克隆減到一個(gè)大爸腸桿菌質(zhì)晶粒中，利蒼用限制性遲內(nèi)切酶和毫DNA外驚切酶或者牢PCR的蛛方法，除亦去部分或河全部polh基因編碼苗序列，保濤留完整的香啟動(dòng)子部論分和多角希體基因下短游序列，患即多角體漢基因側(cè)翼年序列，之寧間加入單丹一或者多悠克隆位點(diǎn)最，可以插繳入外源基柿因。桿狀病叮毒分子刻量大，便不能象察質(zhì)粒載奴體一樣資利用多歉克隆位渠點(diǎn)進(jìn)行嘉基因重吵組，而識(shí)只能利蜘用桿狀凈病毒和位帶有目逐的基因末序列的集質(zhì)粒載做體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。以野挪生型桿攏狀病毒絞ＤＮＡ走(ＡＣ到ＭＮＰ昆Ｖ)進(jìn)類行共轉(zhuǎn)例染時(shí)重床組率極福低,僅棗有0剝.1%慣.利用線形輸化的病毒寄載體可將氣重組率提獎(jiǎng)高到30筑%。在部肺分載體中家引入了β索-半乳糖倦苷酶基因特后可以利運(yùn)用插入失辜活結(jié)合藍(lán)盼白斑進(jìn)行呆重組體的里篩選。B氧acul滲ogol股dTM是屈一種缺失本衣殼蛋白速編碼序列暮ＯＲＦ1撇629部鍋分序列的永缺失致死終型突變體姻,此ＤＮ擊Ａ與基于騰多角體蛋派白位點(diǎn)的垂轉(zhuǎn)移載體蜜對(duì)細(xì)胞進(jìn)捉行共轉(zhuǎn)染補(bǔ)時(shí),只有省發(fā)生同源榜重組的病銀毒才有復(fù)逢制能力.果蠅表達(dá)殖系統(tǒng)(優(yōu)Dros今ophi磚lae頓xpre端ssio精nsy狂stem將，DE卡S)包含表達(dá)甲載體和相池應(yīng)的選擇握載體。通釋過表達(dá)載探體和選擇螞載體的共盈轉(zhuǎn)染,摸可在3～羅4周時(shí)片間內(nèi)獲得掛表達(dá)重組烘蛋白的穩(wěn)般定轉(zhuǎn)染的兼細(xì)胞系.茂而且通猶過優(yōu)化表謹(jǐn)達(dá)載體和估選擇載體吹的比例,治可以得微到含有高欣拷貝數(shù)目分的基因的男細(xì)胞系,逃從而提懸高目的蛋戶白的表達(dá)鑄量。以前人們藍(lán)認(rèn)為桿狀娃病毒僅能寺在鱗翅目有昆蟲細(xì)胞獲中復(fù)制，司不能在其柳他昆蟲細(xì)艱胞(如果浩蠅細(xì)胞)賤中復(fù)制，亮然而研究妹表明在一青定條件下可，桿狀病威毒也能感博染果蠅細(xì)郊胞。在果妥蠅細(xì)胞中再，桿狀病胡毒的多角巧體基因啟吵動(dòng)子幾乎勇不發(fā)生作城用，利用程的是果蠅啟敵動(dòng)子如Hs桂p70咽啟動(dòng)子納、肌動(dòng)雅蛋白5為C啟動(dòng)番子、金密屬硫蛋潮白基因震啟動(dòng)子等，其中萄，Hsp戒70啟動(dòng)男子的作用表最強(qiáng)。重睜組桿狀病竿毒感染果列蠅細(xì)胞后弄不會(huì)引起藏宿主細(xì)胞矩的裂解，客且蛋白表售達(dá)水平與陣鱗翅目細(xì)淋胞相似，敢因此，桿狀病桐毒-果銷蠅系統(tǒng)勝是一個(gè)欠很有應(yīng)映用前景牌的昆蟲諸細(xì)胞表幸達(dá)系統(tǒng)。4）昆蟲軟細(xì)胞培養(yǎng)隸和重組蛋喇白表達(dá)（1）屢昆蟲細(xì)繼胞的培敘養(yǎng)基和偵培養(yǎng)條袍件所有的汁昆蟲細(xì)賊胞培養(yǎng)肢基都含盼有基本臨鹽類，縣糖類，總氨基酸響，有機(jī)既酸，維谷生素以獄及微量狼元素。通常用傍的商品紅培養(yǎng)基姿有Gr比ace墊培養(yǎng)基驢，呈粉傻狀。配坐制培養(yǎng)寨基的時(shí)慰候要加串入10坦％胎牛陽血清（暴FBS寫）和酵偉母水解市物（Y萄L）和埋水解乳扣蛋白（士LH）昆蟲細(xì)縣胞一般隸在27富℃生長(zhǎng)兆最佳，工培養(yǎng)基彼pH是腸6.2制，無需鞏CO2。多數(shù)昆揮蟲細(xì)胞的扇倍增時(shí)間朗是18－辱22h（2）昆婆蟲細(xì)胞的鉆大規(guī)模懸香浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)社胞比較多容易在糧實(shí)驗(yàn)室女小規(guī)模徑水平上難（10祥0－1猾000飼ml）祝，在磁歌力攪拌相瓶中生殿長(zhǎng)，其失密度一竊般可以擔(dān)達(dá)到3液×106/ml，童活力在9剛5％以上核。氧的供給：在成批培吃養(yǎng)的密閉只容器中需門解決通氧紫，而且在浙培養(yǎng)感染唐重組病毒匯的昆蟲細(xì)路胞時(shí)耗氧威量比未感枕染的要高思。細(xì)胞保呆護(hù)：由于昆讀蟲細(xì)胞撥對(duì)于剪娃切力和鍵產(chǎn)生氣員泡的敏碎感性，脖細(xì)胞容礙易破裂認(rèn)，化合裹物Pl碑uro奸nic匆F－6犬8可以進(jìn)保護(hù)細(xì)虛胞因上偷述原因詞造成的輕損傷。其它因紙素：還有好多畢因素要考皆慮，如反老應(yīng)器的設(shè)戰(zhàn)計(jì)，細(xì)胞絲式密度，培允養(yǎng)基成分軌，病毒感棍染的條件李等。（3）病鑒毒感染蓄和基因胳表達(dá)由于昆倒蟲細(xì)胞慶桿狀病所毒表達(dá)猾系統(tǒng)生葛產(chǎn)外源半蛋白是寒一種間序歇性的陰程序進(jìn)趕行生產(chǎn)悅的，因棵為所有勺細(xì)胞都押會(huì)因病員毒感染假而引起陶病理性歌死亡，肝因此，煌在生產(chǎn)鳥時(shí)往往慈需要至凍少有兩截個(gè)反應(yīng)使器：第溜一個(gè)反論應(yīng)器培竿養(yǎng)正常剪的昆蟲萬細(xì)胞，逝第二個(gè)瘋反應(yīng)器蘭用于病事毒接種兆感染表每達(dá)。利用桿擦狀病毒襲的極早識(shí)期基因ie基因啟動(dòng)解子構(gòu)建轉(zhuǎn)憤移載體，斧由于病毒媽極早期基搜因啟動(dòng)子診的轉(zhuǎn)錄可厲以直接利變用宿主細(xì)鞋胞的RN答Apo肚lyme敏rase毫II，將所以用這呈樣的質(zhì)粒與直接轉(zhuǎn)化稻昆蟲細(xì)胞惠，使昆蟲暮細(xì)胞能夠搭持續(xù)表達(dá)伏外源蛋白顧。5）桿磁狀病毒孔表達(dá)載家體系統(tǒng)城的新應(yīng)愉用（1）廣召泛用于在戀昆蟲細(xì)胞難中表達(dá)各愁種重組蛋低白。昆蟲繞桿狀病毒赤表達(dá)載體蜓系統(tǒng)于2艦0世紀(jì)8芳0年代初邪期問世以禿來，在2住0多年的畝時(shí)間里已歲成為生產(chǎn)盾與研究各薦種原核、職真核蛋白酬有力而普灣及的工具夏。（2）用釋于桿狀病忍毒表面巨的蛋白梅展示，建立蛋帝白庫，簡(jiǎn)善化單克隆姻抗體的純縫化和蛋白壓與受體相莖互作用的萬研究。有潛力把的應(yīng)用遙是病毒逃表面的姥蛋白展裝示功能穩(wěn)（pr川ote挽in謊dis要pla侵y）。棒將外源鎖基因插解入到桿層狀病毒義表面糖恢蛋白g潮p67摘的信號(hào)冤肽與成貨熟蛋白正編碼序標(biāo)列之間默，不破飛壞它本昏身的轉(zhuǎn)貨運(yùn)及膜初融合功犯能，從妙而作為蛙載體將只外源蛋美白展示辟在病毒敢粒子表魄面。（3）構(gòu)建含有錫哺乳動(dòng)物臉啟動(dòng)子的靠重組桿狀黨病毒，轉(zhuǎn)秋導(dǎo)哺乳動(dòng)貼物細(xì)胞，粘作為良好懷的基因轉(zhuǎn)駛移載體，泡用于基因況轉(zhuǎn)移和基跌因治療。桿狀病毒竭可以被非姿宿主細(xì)胞橡如哺乳動(dòng)檔物細(xì)胞所寒吞飲，但渾是不能在爛非宿主細(xì)滴胞中復(fù)制恢。帶有哺跨乳動(dòng)物啟怨動(dòng)子的重帝組桿狀病飄毒可以轉(zhuǎn)俘導(dǎo)原代培軌養(yǎng)的肝細(xì)刺胞，并表已達(dá)報(bào)告基功因。根據(jù)刻桿狀病毒漁在哺乳動(dòng)本物細(xì)胞中翼的特點(diǎn)，研作為基因霉傳遞載體菜，可以將舊帶有p5秤3基因的思重組桿狀貍病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)秀Saos贏－2h膏uman蹤蝶ost西eosa便rcom催a細(xì)胞，拌100％折的轉(zhuǎn)化細(xì)專胞都能表幣達(dá)p53界基因，這肚就為體內(nèi)利用陡基因治療闊法治療癌撥癥等疾病提代供了途徑膛。盡管昆蟲沒桿狀病毒升表達(dá)系統(tǒng)茫存在一些汁不足之處魂，但它在星農(nóng)業(yè)、基號(hào)礎(chǔ)分子生掉物學(xué)以及案醫(yī)學(xué)領(lǐng)域腎都具有極板其重要的喊作用。利站用不斷發(fā)葡展的新技榮術(shù)將其改詳造為較高據(jù)效的殺蟲星劑仍然具椒有極其誘來人的前景遍。另外，憤隨著對(duì)這半一表達(dá)系疾統(tǒng)本身的怪基礎(chǔ)理論聰研究的不勢(shì)斷深入，舊其調(diào)控機(jī)食理也將越屑來越清晰炎明了，新伍的調(diào)控因鞠子及強(qiáng)的遷增強(qiáng)子也密可能被找貿(mào)到，這將欣極大地提報(bào)高蛋白的顯表達(dá)效率棵。8、虜哺乳動(dòng)墾物細(xì)胞姓表達(dá)系杠統(tǒng)（G妙ene挽Ex艷pre洲ssi起on皺sys比tem班in雞Ma侵mma胡ls）1）特購(gòu)點(diǎn)糖基化杏等翻譯回后修飾險(xiǎn)。能夠指龍導(dǎo)蛋白泊質(zhì)的正廟確折疊究，目的屠基因在荷哺乳動(dòng)傘物細(xì)胞倘中表達(dá)輩的蛋白南與天然睜蛋白的譽(yù)結(jié)構(gòu)、臘糖基化咳類型和匙方式幾趙乎相同小且能正酸確組裝解成多亞俱基蛋白呆。2）表舍達(dá)載體病毒載體械：以病毒遙顆粒的方扛式，通過袋病毒包膜伍蛋白與宿待主細(xì)胞膜鑰的相互作紛用使外源莫基因進(jìn)入撒到細(xì)胞內(nèi)勺。常用的病崇毒載體有開腺病毒、須腺相關(guān)病柳毒、逆轉(zhuǎn)桶錄病毒、巖seml秧iki森耀林病毒(肅SFV)夠載體等。3）高誤效表達(dá)亞載體構(gòu)抱建（1）轉(zhuǎn)東錄水平調(diào)卸控（A）刃利用病懶毒源性據(jù)和細(xì)胞泊源性的若強(qiáng)啟動(dòng)侍子，如夾mCM宋V、h財(cái)CMV膊、hE盾F-lα、人屠的c-費(fèi)fos效、雞胞柱漿-β柱肌動(dòng)蛋搖白等啟譽(yù)動(dòng)子。CMV瞧啟動(dòng)子罰在細(xì)胞仰處于S布期、生懸長(zhǎng)迅速枕時(shí)，轉(zhuǎn)宜錄活性驅(qū)最高；畏但在大版規(guī)模生淹產(chǎn)的中唉、后期淘，外源否基因的妹表達(dá)水所平下降蓋。此時(shí)租，pE眨F-1父α啟問動(dòng)子的關(guān)轉(zhuǎn)錄起匪始效率樣更強(qiáng)。（B）蒼利用啟扔動(dòng)子、喘增強(qiáng)子模元件構(gòu)換建雜合畝啟動(dòng)子Mas棵ayu伴ki等驗(yàn)發(fā)現(xiàn)C腎MV增寸強(qiáng)子能皺提高密hEF很-1α啟動(dòng)馬子控制婦下的目蚊的基因崇表達(dá)量里4-9沙倍。Kim等聲發(fā)現(xiàn)將h貫EF-1倉α啟動(dòng)怖子的第1銳個(gè)內(nèi)含子表置于mC芝MV啟動(dòng)必子與目的豎基因(熒敵光素酶)儉之間能極亭大地提高漂目的基因撫在CHO翼細(xì)胞中的羨表達(dá)，使孤熒光素酶琴的表達(dá)量示提高了8占.2倍。（C）提幅高宿主細(xì)撥胞轉(zhuǎn)錄因羨子的表達(dá)水平EGF逮能提高妖EF-砍1αmR姨N(yùn)A的轉(zhuǎn)次錄量和蛋暈白質(zhì)的表水達(dá)。Rez防a等將館用作結(jié)攝合DN鎖A的結(jié)韻構(gòu)域-舒鋅指結(jié)吹構(gòu)和V滔P16濫蛋白的拜轉(zhuǎn)錄激做活結(jié)構(gòu)即域融合縱構(gòu)建了漢人工轉(zhuǎn)浪錄激活廚因子，董將CM辨V啟動(dòng)績(jī)子的轉(zhuǎn)白錄效率暈提高了快2倍多切。（2）翻民譯水平的搭調(diào)控mRN泳A壽命且、mR為NA的綠翻譯起污始效率看和翻譯權(quán)產(chǎn)物的暴加工修減飾的效港率等也艙對(duì)目的毛基因的木表達(dá)產(chǎn)侵生重要琴的影響進(jìn)。（A）催內(nèi)部核律糖體進(jìn)變?nèi)胛稽c(diǎn)鐵(IR偷ES)灣能使同一mR筍NA中除素第1個(gè)基史因之外的其他含基因也勇得到有鑰效表達(dá)涉。（B）泛翻譯增股強(qiáng)子可禮提高翻收譯效率屢。（C）使狡用宿主細(xì)釣胞偏愛的峰密碼子來對(duì)目的基終因的密碼閥子進(jìn)行優(yōu)度化。（3）整普合位點(diǎn)的乒優(yōu)化目的基因賢在CHO擇細(xì)胞染色錯(cuò)體上整合擇位點(diǎn)區(qū)域淺的狀態(tài)對(duì)柴于目的基豎因的表達(dá)赴與否、表王達(dá)高低以哥及目的基配因在宿主脈細(xì)胞中的桃穩(wěn)定性起兄著決定性發(fā)的作用。只有那寧些整合資位點(diǎn)處安于染色輕體轉(zhuǎn)錄濤活躍區(qū)擊的細(xì)胞母形成的瀉克隆才蜘可高水介平表達(dá)迫目的基噸因。（A）選趙擇基因(拔如ne蝦o)的弱棗化表達(dá)，娛使大量整勺合在低表太達(dá)整合位隊(duì)點(diǎn)的細(xì)胞質(zhì)由于選擇百標(biāo)記基因頂表達(dá)量不鉆夠而在選攔擇培基條半件下死亡宇。（B）腳在載體煤上添加譽(yù)染色體郊上的某掛些特定受序列(漿如骨架茄/基質(zhì)缺附著區(qū)鵲)，使見表達(dá)載良體整合收到宿主威細(xì)胞的胡染色體晉后能模喜擬染色儲(chǔ)體的高跨轉(zhuǎn)錄活松躍區(qū)。3）宿主促細(xì)胞常用的幾沃種用于表斷達(dá)重組蛋虹白的細(xì)胞滴株BHK-原21細(xì)胞分CHO挨-K1細(xì)露胞C127次細(xì)胞肺MDC黨K細(xì)胞Nama親lwa細(xì)旦胞護(hù)Ver輕o細(xì)胞鼠骨髓澆瘤細(xì)胞魄CO堡S細(xì)胞骨髓瘤細(xì)樸胞株(如皺Sp2/謠0和J5美58L)不同的垃細(xì)胞對(duì)鴿重組蛋渡白的修球飾可能肯會(huì)稍有鍛差別。發(fā)現(xiàn)新素細(xì)胞株挪：來源于Madi六n-Da灘rby犬遍腎的高分借化內(nèi)皮細(xì)擋胞株(M谷DCK)，表達(dá)分離泌型的基斧質(zhì)金屬蛋喉白酶MM零P13。屯高表達(dá)的惡陽性細(xì)胞章克隆可占霜轉(zhuǎn)染細(xì)胞姐的5％～板l0％，辟而同樣的核載體在C去HO細(xì)胞碼中僅得到陵低水平的云表達(dá)。對(duì)現(xiàn)有盤細(xì)胞株開進(jìn)行遺抵傳改造寫：基于腺失病毒E瞎1A蛋扶白可反章式激活廈CMV夜啟動(dòng)子斃，Co剛cke煉tt等貓建立了穩(wěn)定表晚達(dá)E1杠A的C塌HO細(xì)冒胞株，在該細(xì)胞蜜中重組前挪膠原酶的壘產(chǎn)量與C暴HO細(xì)胞導(dǎo)相比增加宋了12倍佩。4)常用猴的細(xì)胞表著達(dá)系統(tǒng)(1)C縫HO/D碗HFR和分CHO/長(zhǎng)NEOS卷PLA表達(dá)系瀉統(tǒng)（2）售C12紋7/B犧PV-循1系統(tǒng)（3）骨愿髓瘤細(xì)胞摟表達(dá)系統(tǒng)5）表達(dá)惹系統(tǒng)方式（1）瞬英時(shí)表達(dá)系蘭統(tǒng)：宿主細(xì)歷胞在導(dǎo)濁入表達(dá)提載體后嚇不經(jīng)選掉擇培養(yǎng)職，載體脾DNA治隨細(xì)胞來分裂而躁逐漸丟漿失，目帶的蛋白倚的表達(dá)扭時(shí)限短過暫。簡(jiǎn)捷，傲實(shí)驗(yàn)周嚇期短，昨規(guī)模大鉗。技術(shù)條件溜要求高，宏如質(zhì)粒的僻純度、轉(zhuǎn)符染的效率觀等。（2）趙穩(wěn)定表塊達(dá)系統(tǒng)致：載體進(jìn)入前宿主細(xì)胞慮并經(jīng)選擇洗培養(yǎng)，載洪體DNA油穩(wěn)定存在欠于細(xì)胞內(nèi)求，目的蛋朋白的表達(dá)粥持久、穩(wěn)欲定。由于需抗差性選擇甚稼至加壓擴(kuò)助增等步驟過，穩(wěn)定表辱達(dá)相對(duì)耗嶼時(shí)耗力。（3）誘芳導(dǎo)表達(dá)系調(diào)統(tǒng)：目的基步因的轉(zhuǎn)烘錄受外櫻源小分葛子誘導(dǎo)顛后才得樣以開放癥。早期—糖蘿皮質(zhì)激素球、重金屬甘離子—特酒異性低、和毒性高。近年—非縫哺乳動(dòng)物翁細(xì)胞來源寨的調(diào)控蛋雕白—外源擱基因表達(dá)飽低、誘導(dǎo)霞效應(yīng)高。6）基獸因的導(dǎo)燭入方法光穿孔智法寺沖擊波礦法基因槍防法瞇穿孔法磷酸鈣兩共沉淀擱法只脂質(zhì)皂體法抗體轉(zhuǎn)衰染法謹(jǐn)其他7）展葵望（一）改旁進(jìn)表達(dá)載船體，提高診表達(dá)水平憂和產(chǎn)量1.采識(shí)用更強(qiáng)獻(xiàn)的啟動(dòng)龜子和增曾強(qiáng)子2.更出好地利鞭用擴(kuò)增待系統(tǒng)獲剪尋找高裳表達(dá)位摔點(diǎn)3.采用呀和改造更唉好的宿主翅細(xì)胞（二）利堪用代謝工男程，改進(jìn)腳培養(yǎng)工藝害，降低生嫌產(chǎn)成本1.采蒼用“代章謝工程警”改造解工程細(xì)退胞2.改火進(jìn)培養(yǎng)蓄工藝，撒降低生君產(chǎn)成本（三）抑室制細(xì)胞調(diào)眉亡，延長(zhǎng)嫁培養(yǎng)時(shí)間（四）封采用“迎糖基化臉”工程默，提高頌產(chǎn)品質(zhì)對(duì)量9、植物槐生物反應(yīng)幻玉器（Pl粱ant切Bior圖eact克or）植物生物蜘反應(yīng)器是指通過例基因工程躍途徑，以逢常見的農(nóng)佛作物作為“化學(xué)工原廠”，