類型與特點簡介第1頁/共63頁第一節透射式電鏡第三節掃描透射式電鏡第四節分析類電鏡第五節掃描探針式顯微鏡第二節掃描式電鏡第六節激光共聚焦顯微鏡第2頁/共63頁第一節透射式電子顯微鏡一般（常規）TEM：100KV高壓TEM：200KV超高壓TEM：500Kv、1MV、3MV根據加速電壓的大小分為：第3頁/共63頁一、常規透射電鏡（TEM）1、原理：主要利用入射電子束穿過樣品，產生攜帶樣品橫截面內部的電子信號，并經多級磁透鏡的放大后成像于熒光板，整幅像同時成立。2、特點：

⑴樣品超薄h<1000?⑵二維平面像、立體感差⑶分辨率高，優于2?⑷樣品制備復雜3、觀察對象：

主要樣品內部超微結構（可用來觀察組織和細胞內部的超微結構、微生物、生物大分子等）第4頁/共63頁第5頁/共63頁第6頁/共63頁第7頁/共63頁二、超高壓透射電鏡（UHVEM:ultra-highvoltageelectronmicroscope）

HV<500kv為常規及高壓電鏡,一般TEM：100~200KVHV>500kv為超高壓電鏡，Hvmax=1MV（法），3MV，15MV（美），10MV（日）1、特點：

⑴穿透能力強、可觀察較厚的樣品μm級⑵分辨率高，2?（晶格分辨率）⑶單色性好，色差小，成像質量好⑷加速電壓越高，散射截面越小，輻射損傷減小⑸場深大，可獲取樣品的三維結構信息⑹樣品室一般為環境樣品室，可觀察活體生物樣品2、缺點：

體積龐大、結構復雜、價格昂貴、需專用的防護裝置3、觀察對象：主要研究非生物材料的晶格結構、觀察細胞骨架系統（微梁、微絲），人工培養細胞、血細胞等第8頁/共63頁日立超高壓電鏡H-3000（3MV）第9頁/共63頁第二節掃描式電鏡依據性能不同主要分為：（1）常規（一般）SEM（2）環境掃描電鏡（3）低壓掃描電鏡（4）場發射電子槍SEM（5）生物用SEM（6）掃描電－聲電鏡第10頁/共63頁

1、原理：

利用電子束轟擊樣品表面，引起二次電子等信號的發射，主要利用SE并放大、傳遞SE所攜帶的信息，按時間序列逐點成像，顯像管上成像2、特點：

⑴圖象立體感強、可觀察一定厚度的樣

⑵樣品制備簡單，可觀察較大的樣

⑶

分辨率較高，30~40?

一、常規掃描電鏡（SEM）第11頁/共63頁2、特點：

⑷倍率連續可變，從4倍~~15萬⑸可配附件，進行微區的定量、定性分析3、觀察對象：

主要用于觀察樣品的表面形貌、割裂面結構，管腔內表面的結構等第12頁/共63頁1、特點：①多種真空狀態：高、低、超低真空

1Torr（乇）=1mmHg柱壓力=1/760標準大氣壓=133.3Pa

粗真空：760~10乇低真空：10~10-3乇 高真空：10-3~10-8乇超高真空：10-8乇以下多種真空條件下可得SEI像、BEI像，且

=4nm②樣品室可充氣體:水氣、氮氣

③動態分析：樣品溫度從-185℃~1000℃④制樣簡單：樣品無須鍍膜、脫水、干燥等處理真正的“環境”條件，可直接觀察含水、含油樣品低氣壓空間二、環境掃描電鏡（ESEM）第13頁/共63頁2、缺點：

造價太高$30萬，Philips（FEI），分辨率仍不很高3、觀察對象：

活體生物、真菌、細菌、人工培養細胞等（含液體［水或油等］、以及不適合進行常規固定、脫水、干燥等處理的樣品）如：ESEM最適宜觀察培養基上人工培養細胞的表面微觀結構。第14頁/共63頁三、低壓掃描電鏡（LVSEM:lowvoltage）2、特點

⑴加速電壓降低，增強反差⑵試樣不易發生充放電效應，

⑶Hv=2－3Kv時也可獲得1nm的分辨率3、觀察對象：

可觀察絕緣物質、生物樣品、半導體材料1、類型：⑴高分辨型低壓掃描電鏡⑵新型“減速”低壓掃描電鏡第15頁/共63頁四、場發射電子槍SEM場發射電子槍SEM優點:

⑴場發射電子槍具有亮度高、能量分散少，陰極源尺寸小等優點，其分辨率已達到0.3-0.4nm。⑵可在低加速電壓下進行高分辨率觀察，因此可以直接觀察絕緣體而不發生充、放電現象。第16頁/共63頁優點：裝備有冰凍、冷熱樣品臺，可把含水生物樣品迅速冷凍并對冰凍樣品進行觀察，可以減少化學處理引起的人為變化，使觀察樣品更接近于自然狀態。若要觀察內部結構，還可用冷刀把樣品進行切開，加溫使冰升華，并在其上噴鍍一層金屬再進行觀察，所有這些過程都在SEM中不破壞真空的狀態下進行。五、生物用SEM第17頁/共63頁六掃描電－聲電鏡SEAM（ScanningElectronAcousticMicroscope）成像原理基于樣品微熱學和彈性性質的變化建立圖像的，優點如下：1.電子束斑直徑小10nm，分辨率高2.能交換顯示同一樣品的二次電子像和掃描電－－聲像。3.能顯示樣品表面和亞表面不同層次的圖像，并且不破壞成像的剖面。4.節省費用，對現有的SEM稍加改裝即可一機兩用(一)優點：比較振幅和相位的成像結果，可以區別表面和亞表面的結構差異。第18頁/共63頁（二）掃描電－聲顯微鏡的成像原理成像過程及原理框圖第19頁/共63頁第20頁/共63頁(三)SEAM觀察的對象：

可以顯示樣品表面或表面下不同層次的微觀熱性質的差異，適宜檢測有晶格結構或有分層結構的金屬、陶瓷、半導體材料、有機介質等樣品，進行生物樣品表面和亞表面分析，進行晶體界面分析和亞表面無損分析。如：生物組織、大分子結構的分層研究和檢測，組織損傷研究等。

第21頁/共63頁1.超高真空的場發射式STEM第三節掃描透射式電鏡（STEM）

2.附件型STEM

工作原理介于TEM與SEM之間，兼顧SEM及TEM的優點、功能更強大、又彌補各自的缺點。（一）類型

使用場發射電子槍，單晶鎢針尖燈絲，可以獲得很高的亮度10－8－10－10A/cm2立體弧度，分辨率0.3-0.5nm，真空度10－10torr，價格極高。附件附加在TEM或SEM上，分辨率較低，TEM電鏡附件型分辨率1－1.5nm;SEM電鏡附件型分辨率4－6nm,附件型STEM主要用于X－ray能譜、波譜分析或電子損失譜分析，用以觀察元素分布圖第22頁/共63頁⑴兼顧SEM及TEM的特點、功能強大、但造價高⑵分辨率不如TEM高,高分辨型0.3~0.5nm;附件型1~1.5nm⑶在200KV以上且超高真空時，照射面積小，熱損傷和輻射損傷小、污染小，可以觀察到鈾和釷原子像⑷能過檢測到掃描透射電子、透射電子和散射電子，并可同時觀察明場和暗場，可進行適當的處理和比較，獲取更多超微結構信息⑸可觀察較厚樣品(0.2~0.4μm)和低反差樣品，圖像的反差和亮度易調節，切片可以不染色⑹顯像方式：熒光板、顯像管（二）、特點（三）、觀察對象：觀察樣品表面、內部，獲取樣品的明場及暗場圖像第23頁/共63頁第四節分析類電鏡分析電鏡是利用電子束（射線）轟擊樣品所產生的X射線或俄歇電子等信號對樣品元素進行分析的一類電鏡。其基本特點：能在觀察超微結構的同時，對樣品中一個極微小的區域進行化學分析，從而在超微結構水平上測定各種細胞結構的化學成分及其變化規律。第24頁/共63頁（1）分析TEM：

也稱生物分析電鏡（BATEM:biologicanalysis）

TEM+EDS（or：WDS），分辨率高

=1.5?、分析性能好。目前很多100KV和200KVTEM都可以裝上X射線檢測附件，進行樣品的元素分析。（2）分析SEM：

在SEM上配備X射線能譜儀（或波譜儀）后，便可兼有電子探針分析樣品化學成分的功能。（3）掃描俄歇電鏡：

把SEM與俄歇電子能量分析儀相結合，即成為掃描俄歇電鏡，它能對樣品表面進行微區元素分析，是一種表面微觀分析電鏡。（一）分析電鏡的類型第25頁/共63頁（AEM:analysiselectronmicroscope)

連續X-ray背底扣除能量：Z特征X-ray的能量特征X-ray

波長：Z特征X-ray的波長1、波譜儀（WDS）

Wavelength-dispersespectrometer

微區定量分析，4Be92U慢20~60分，靈敏度高2、能譜儀（EDS）

Energy-dispersespectrometer

微區定性分析，11Na92U快2~3分，靈敏度低（二）分析電鏡的原理第26頁/共63頁連續X-ray特征X-ray第27頁/共63頁波長與能量之間的關系：特征X射線的波長與加速電壓無關系，只與樣品的種類有關系。

特征X-ray的波長和能量隨樣品中各元素的不同而異，可用于定量、定性分析

Z↗激發的特征X-ray能量E↗波長↘即：只要是同一種原子，不論其所處的物理或化學狀態如何，它們所發出的特征X射線均應具有相同的波長或能量。分析電鏡中X射線顯微分析的理論依據：第28頁/共63頁第五節掃描探針式顯微鏡（1）掃描隧道顯微鏡（STM）（2）原子力顯微鏡（AFM）（3）激光力顯微鏡（LFM）、（4）掃描電化學顯微鏡（SECM）分類：第29頁/共63頁一、掃描隧道顯微鏡（STM）（STM:scanningtunnelingmicroscope）1、原理：利用量子隧道效應獲取樣品表面結構。其關鍵部件是有一個加上一定電壓的精密探針，當探針接近物質時，由于‘隧道效應’而有電子飛出，從而在探針與物質之間有電流通過。第30頁/共63頁當探針沿物質表面掃描時，使探針與物質表面間的距離不斷發生改變，從而引起電流不斷發生改變。將電流的這種改變圖象化，即可顯示出原子水平的凹凸形形態。第31頁/共63頁第32頁/共63頁2、STM特點：⑴M=1000萬倍，水平<1?，垂直<0.1?⑵可進行“活體”觀察、可在大氣、液體環境下直接觀察物質表面特征⑶三態（固態、液態和氣態）物質均可進行觀察。⑷（觀察固體時）只能觀察導體和半導體的表面結構、非導電的物質需要覆蓋一層導電薄膜3、STM應用：主要用于研究表面科學、半導體材料、生命科學第33頁/共63頁優點：可在真空、大氣、常溫等不同環境下工作，甚至可將樣品浸在水和其它溶液中，不需要特別的制樣技術，并且探測過程對樣品無損傷。這些特點適用于研究生物樣品和在不同試驗條件下對樣品表面的評價，例如對于多相催化機理、超導機制、電化學反應過程中電極表面變化的監測等。STM在生物領域的應用：

STM在生物和有機材料一領域有著廣泛的應用前景。盡管目前還存在著如何解釋生物樣品的STM圖象、如何更好地制備生物樣品以及選擇合適襯底以沉積生物分子等問題，但實際應用中已取得了不少好結果。例如在真空、大氣和溶液條件下的DNA研究，球蛋白、膠原蛋白及紅血球的研究等。掃描隧道顯微鏡能直接觀察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白質等)的原子布陣，也能觀察一些生物結構(如生物膜、細胞壁等)的原子排列。在生物學研究中發揮著重要作用，將把生物學研究推進到納米科學水平。第34頁/共63頁STM在納米科技中的應用：

STM不僅能夠對樣品表面進行成像，而且還能在納米尺度上對材料表面進行刻蝕與修飾。由微觀到宏觀，即直接操縱單個原子和分子，對它們進行排列組合，以形成新的物質，或制造出一定功能的機器這是實現納米加工的新思想，STM的出現使這一思想變為現實。自從STM問世以來，STM作為一種納米加工的工具的研究已涉及到表面直接刻寫、電子束誘導沉積以及單原子操縱等方面，并取得了一批高水平的研究結果。第35頁/共63頁掃描隧道電子顯微鏡下金原子的晶格排列圖像第一節形態觀察技術第36頁/共63頁硅111面7×7原子重構象

硅片是大家熟悉的制作晶體管和大規模集成電路的半導體材料，為了得到表面清潔的單質材料，要對硅片進行高溫加熱和退火處理，在加熱和退火處理的過程中硅表面的原子進行重新組合，結構發生較大變化，這就是所謂的重構。

第37頁/共63頁

1990年，IBM公司的科學家展示了一項令世人瞠目結舌的成果，他們在金屬鎳表面用35個惰性氣體氙原子組成“IBM”三個英文字母。第38頁/共63頁科學家把碳60分子每十個一組放在銅的表面組成了世界上最小的算盤。與普通算盤不同的是，算珠不是用細桿穿起來，而是沿著銅表面的原子臺階排列的.第39頁/共63頁這是中國科學院化學所的科技人員利用納米加工技術在石墨表面通過搬遷碳原子而繪制出的世界上最小的中國地圖。第40頁/共63頁DNA分子拉成的DNA圖象第41頁/共63頁二、原子力顯微鏡（AFM：atomicforcemicroscope)2、特點：⑴導電樣品、非導電樣品均可觀察⑵分辨率達到原子水平⑶可以在真空、超高真空、電化學環境、常溫、低溫條件下工作，可以三維成像

3、應用：主要用于表面科學、生命科學、材料科學

注：以STM、AFM為基礎，衍生出掃描探針顯微鏡（SPM：Scanningprobemicroscope）：如激光力顯微鏡（LFM）、掃描電化學顯微鏡（SECM）1、原理：通過檢測探針與樣品表面頂端原子之間的相互作用力（摩擦與排斥力，即原子力）來分析再現固體樣品表面形貌結構。第42頁/共63頁AFM在生命科學中的應用舉例：⑴生物大分子的結構、生物分子相互作用前后構型的變化。⑵進行生物分子之間力的測定及操縱調控：在酶與底物的作用力上的應用（用原子力顯微技術研究乙酰膽堿與乙酰膽堿酯酶之間的作用力）⑶細胞生物學：研究活體細胞或化學固定的細胞如紅細胞、白細胞、細菌、心肌細胞、活腎上皮細胞及神經膠質細胞的動態行為。第43頁/共63頁第44頁/共63頁第45頁/共63頁第六節激光共聚焦顯微鏡激光掃描共聚焦顯微鏡

LSCM：LaserScanningConfocalMicroscope——以激光作為激發光源，采用光源針孔與檢測針孔共軛聚焦技術，對樣本進行斷層掃描，以獲得高分辨率光學切片的熒光顯微鏡系統。共聚焦系統細胞CT

LSCM：熒光顯微鏡＋激光掃描裝置＋激光發生器＋PC圖像處理技術第46頁/共63頁1、共聚焦掃描顯微鏡的成像原理采用點光源照射標本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發出的熒光被物鏡收集，并沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對于焦平面上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一系列的透鏡，最終可同時聚焦于照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平面的光，可以會聚在探測孔范圍之內，而來自焦平面上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔后的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像，轉為數字信號傳輸至計算機，最終在屏幕上合成清晰的整個焦平面的共聚焦圖像。第47頁/共63頁ConfocalPrinciple第48頁/共63頁光電倍增管檢測針孔光源針孔光源分色鏡物鏡樣本聚集平面共聚焦掃描顯微鏡光學原理

檢測針孔和光源針孔始終聚焦于同一點，使聚焦平面以外被激發的熒光不能進入檢測針孔高分辨率的光學切片

激光穿透性強，可對樣本進行一定深度光學斷層，獲得高標準的連續光學切片實現三維重建第49頁/共63頁第50頁/共63頁問題：激光掃描共聚焦顯微鏡觀察到的圖象為什么比普通的熒光顯微鏡的清晰度、層次感要強許多？第一：普通熒光顯微鏡的不足使用熒光物質標記細胞中的特定成分或結構，不僅圖像的對比度增強，而且由于許多熒光顯微鏡的光源使用短波長的紫外光，大大提高了分辯率（δ=0.61λ/NA）。但當所觀察的熒光標本稍厚時，普通熒光顯微鏡不僅接收焦平面上的光量，而且來自焦平面上方或下方的散射熒光也被物鏡接收，這些來自焦平面以外的熒光使觀察到的圖像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的熒光結構模糊、發虛，原因是大多數生物學標本是層次區別的重疊結構）。第51頁/共63頁第二：LSCM每一幅焦平面圖像實際上是標本的光學橫切面，這個光學橫斷面總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由于焦點處的光強遠大于非焦點處的光強，而且非焦平面光被針孔濾去，因此共聚焦系統的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平面（焦平面）掃描與Z軸（光軸）掃描相結合，通過累加連續層次的二維圖像，經過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像,是細胞CT。第52頁/共63頁觀察方式：以熒光為主光源：激光（紫外、可見光、近紅外）照明方式：點照明、逐點掃描成像方式：共聚焦、逐點成像輸出：實時觀測,數字化圖像，可以進行圖像處理和定量分析2、LSCM的基本性能第53頁/共63頁⑴對活細胞和組織或細胞切片進行連續掃描，可獲得精細的細胞骨架、染色體、細胞器和細胞膜系統的三維圖像。⑵分辨率：接近LM理論分辨率200nm，圖像清晰度、對比度大大增強，同時具有高靈敏度、杰出樣品保護⑶多維圖象的獲得，如7

維圖象(XYZaλIt):

xyt

、xzt

和xt

掃描,時間序列掃描旋轉掃描、區域掃描、光譜掃描、同時方便進行圖像處理。

⑷細胞內離子熒光標記，單標記或多標記，檢測細胞內如pH和鈉、鈣、鎂等離子濃度的比率測定及動態變化。⑸可多重染色觀察：可以在同一張樣品上進行同時多重物質標記，同時觀察⑹

對細胞檢測無損傷，精確、可靠和優良重復性；數據圖像可及時輸出或長期儲存。3、LSCM的優點第54頁/共63頁4、共聚焦掃描顯微鏡在生命科學研究中的應用⑴

細胞生物學：

如：細胞結構、細胞骨架、細胞膜結構及其流動性、受體、細胞器結構和分布變化、細胞凋亡機制；各種細胞器、結構性蛋白、DNA、RNA、酶和受體分子等細胞特異性結構的含量、組分及分布進行定量分析