Chapter8Advancesintransgenictechnology

1.InducibleexpressionsystemsInmanygene-transferexperiments,theproductionofarecombinantproteinistheultimategoal,inwhichcaseitisgenerallyappropriatetomaximizetransgeneexpressionusingastrongconstitutivepromoter.However,therearealsosituationsinwhichconstitutivepromotersarenotappropriate.Forexample,arecombinantproteinistoxic;thetimingoftransgeneexpressioniscritical;thetissueororganspecificityofintransgeneexpressionisrequired.現在是1頁\一共有57頁\編輯于星期三原核生物基因的結構1）基因區原核生物的基因多數以操縱子形式存在，即完成同類功能的多個基因聚集在一起，處于同一個啟動區的調控之下，下游同具一個終止子。但各基因分別具有起始密碼子和終止密碼子?；蛑g一般都存在間隔序列。1.1genestructure1.1.1promoter1.1.2codingregion1.1.3terminator現在是2頁\一共有57頁\編輯于星期三2）啟動子(是和RNA聚合酶識別、結合的一段DNA序列)啟動子(promoter)是一段位于結構基因5’端上游區的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準確地結合并起始轉錄。（1）Pribnowbox（－10區）由六個核苷酸組成的保守序列TATAAT，是RNA聚合酶的結合位點，此區的中央大約位于轉錄起始位點上游10bp處。（2）－35區由六個核苷酸組成的保守序列TTGACA，是RNA聚合酶的識別位點，此區的中央大約位于轉錄起始位點上游35bp處。

現在是3頁\一共有57頁\編輯于星期三現在是4頁\一共有57頁\編輯于星期三現在是5頁\一共有57頁\編輯于星期三現在是6頁\一共有57頁\編輯于星期三3）SD區Shine-Dalgarno序列：位于起始密碼子上游約10bp處，富含嘌呤的保守序列(轉錄mRNA序列為5’-AGGAGGU-3’)，該區轉錄的序列與30S亞基中16SrRNA富含嘧啶的序列(5’-GAUCACCUCCUUA-3’)互補。4）轉錄終止子在一個基因的3’端或是一個操縱子的3’端，提供轉錄停止信號的DNA序列稱為終止子(terminator)。所有原核生物的終止子產生的RNA可形成由莖環構成的發夾結構。該結構可使聚合酶減慢移動或暫停RNA的合成?，F在是7頁\一共有57頁\編輯于星期三終止位點上游一般存在一個富含GC堿基（7-20bp）的雙重對稱區，由這段DNA轉錄產生的RNA容易形成發夾結構。AGCCGCCAGTTCCGCTGGCGGCATTTTTCGGCGGTCAAGGCGACCGCCGTAAAAAGCCGCCAGUUCCGCUGGCGGCAUUUU發卡結構GCAUCGCGGCCGCGGC

CACAAUUUU

CUCUG現在是8頁\一共有57頁\編輯于星期三真核生物基因的結構1）基因區真核生物染色體基因組的基因一般單獨存在。在基因內部有1至多個非編碼間隔序列區，稱為內含子（intron）。而編碼序列區稱為外顯子(exon)。盡管某基因是由多個外顯子和內含子組成的，但只有一個起始密碼子和一個終止密碼子?，F在是9頁\一共有57頁\編輯于星期三2）轉錄啟動區啟動子的結構特點TATAbox：真核基因的啟動子在－25～－35區含有TATA序列，確保轉錄精確地起始。CAATbox：在－70～－80區含有CCAAT序列，控制轉錄起始頻率。GCbox：在－80～－110區含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，控制轉錄起始頻率?，F在是10頁\一共有57頁\編輯于星期三3）轉錄終止子一般情況下，RNA聚合酶啟動基因轉錄后，它就會沿著模板不停地移動，合成RNA鏈，直到碰上終止信號時才與模板DNA脫離并釋放新生RNA鏈?，F在是11頁\一共有57頁\編輯于星期三基因表達包括轉錄和翻譯兩個階段。轉錄是以DNA為模板合成RNA的過程，是基因表達的核心步驟；翻譯是以轉錄生成的mRNA為模板合成多肽鏈的過程，是基因表達的最終目的。DNAReplicationTranscriptionTranslation1.2geneexpression（基因的表達）現在是12頁\一共有57頁\編輯于星期三1.2.1transcription（轉錄）現在是13頁\一共有57頁\編輯于星期三1）轉錄的基本過程（1）模板識別RNA聚合酶與啟動子DNA雙鏈相互作用并與之結合的過程。（2）轉錄起始在啟動子區，RNA聚合酶合成9個核苷酸短鏈。（3）轉錄延伸RNA聚合酶離開啟動子區，沿DNA鏈移動并使新生RNA鏈不斷伸長的過程。（4）轉錄終止RNA聚合酶識別特定的終止位點，核苷酸不再加到鏈上，轉錄復合物停止移動，酶和RNA從模板上釋放?，F在是14頁\一共有57頁\編輯于星期三核糖體的活性中心：mRNA結合部位接受AA-tRNA部位（A位）肽基轉移部位（P位）1.2.2translation現在是15頁\一共有57頁\編輯于星期三a.30S小亞基首先與翻譯起始因子IF-1,IF-3結合。b.30S小亞基通過Shine-Dalgarno序列與mRNA模板結合，在IF2和GTP的幫助下，fMet-tRNAfMet進入小亞基的P位，tRNA的反密碼子與mRNA上的密碼子配對。c.由tRNA,mRNA,3個翻譯起始因子組成的的小亞基復合物與50S大亞基結合，GTP水解，釋放翻譯起始因子?，F在是16頁\一共有57頁\編輯于星期三Step1:新的aa-tRNA進入A位點反密碼子與mRNA密碼子配對不正確的tRNA結合較弱，在肽鍵形成之前發生解離。正確的tRNA解離較慢，可以形成肽鍵(需要EF-Tu、GTP及EF-Ts)。Step2:肽鍵形成P位新生肽鏈C端與tRNA分開，與A位aa-tRNA上的氨基酸形成肽鍵Step3:移位2個tRNA由各自的P、A位移動到E、P位（EF-G介導GTP水解提供能量）（2）肽鏈的延伸現在是17頁\一共有57頁\編輯于星期三現在是18頁\一共有57頁\編輯于星期三（3）肽鏈的終止

A位點的終止密碼子不能為任何一種tRNA所識別釋放因子RF可結合到A位點P位的肽?；鵷RNA的脫?；?，釋放新生肽鏈RF3參與的依賴GTP的反應導致RF1離開核糖體70S/mRNA/deacylatedtRNA復合物的解體現在是19頁\一共有57頁\編輯于星期三1.3controlofgeneexpression1.3.1controlofprokaryotictranscription乳糖操縱子的表達調控大腸桿菌乳糖操縱子（lactoseoperon）包括四個重要組分：調節基因、啟動區（promoter）、操縱區（operator）、結構基因(LacZ編碼β—半乳糖苷酶,功能是使乳糖水解為半乳糖和葡萄糖;lacY編碼β—半乳糖苷透過酶,功能是使乳糖進入細菌細胞內;lacA編碼β—半乳糖苷乙酰基轉移酶,功能是使β—半乳糖乙?；??，F在是20頁\一共有57頁\編輯于星期三現在是21頁\一共有57頁\編輯于星期三4乳糖操縱子在基因工程中的應用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylthiogalactoside,IPTG）現在是22頁\一共有57頁\編輯于星期三1.3.2controlofeukaryotictranscription1真核基因表達調控的類型1）DNA水平上的基因表達調控2）轉錄水平上的基因表達調控3）轉錄后水平上的基因表達調控4）翻譯水平上的基因表達調控5）蛋白質加工水平上的基因表達調控現在是23頁\一共有57頁\編輯于星期三2.轉錄水平上的基因表達調控（基因表達調控的重要方式）

真核基因表達調控主要也是在轉錄水平上進行的，通過順式作用元件和反式作用因子復雜的相互作用來實現的。

1）順式作用元件真核生物啟動子和增強子是由若干DNA序列元件組成的，由于它們常與靶基因連鎖在一起，因此被稱為順式作用元件。（1）啟動子①啟動子的特點啟動子是指確保轉錄精確而有效地起始的DNA序列?，F在是24頁\一共有57頁\編輯于星期三①啟動子的結構特點TATAbox：真核基因的啟動子在－25～－35區含有TATA序列，確保轉錄精確地起始。CAATbox：在－70～－80區含有CCAAT序列，控制轉錄起始頻率。GCbox：在－80～－110區含有GCCACACCC或GGGCGGG序列，控制轉錄起始頻率。現在是25頁\一共有57頁\編輯于星期三將TATA區上游的保守序列稱為上游啟動子元件（upstreampromoterelement,UPE）?，F代分子生物學把能與某個（類）專一蛋白因子結合，從而控制基因特異表達的DNA上游序列稱為應答元件（responseelement）。現在是26頁\一共有57頁\編輯于星期三②啟動子的類型Ⅰ）組成型啟動子Ⅱ）組織或器官特異性啟動子啟動子具有控制組織特異性表達的元件，其表達特異性由這些元件的種類、數目、及相對位置等共同決定。如根特異性啟動子、莖特異性啟動子、葉特異性啟動子、花特異性啟動子、果實或種子特異性啟動子等。Ⅲ）誘導型啟動子啟動子具有應答元件，如熱激應答元件。誘導型啟動子包括光誘導型啟動子、溫度誘導型啟動子、創傷誘導型啟動子、激素應答啟動子等。受熱后，果蠅細胞內熱激蛋白70mRNA水平提高1000倍，就是因為熱激因子（蛋白）與熱激蛋白70基因TATA區上游60bp處的熱激應答元件結合，誘發轉錄起始。現在是27頁\一共有57頁\編輯于星期三2）反式作用因子起始轉錄所需的任何一種蛋白質（除去RNA聚合酶），就是轉錄因子（TF,transcriptionfactor）。轉錄因子是一種重要的反式作用因子,是能夠與真核基因啟動子區域中順式作用元件發生特異性相互作用的蛋白,通過它們之間以及與其他相關蛋白之間的相互作用,激活或抑制轉錄。反式作用因子的四種作用方式：（1）通過與DNA結合發揮作用（2）一個轉錄因子可以識別另一個轉錄因子（3）可識別RNA聚合酶（4）當有其它幾種蛋白質存在時可以摻入轉錄起始復合物現在是28頁\一共有57頁\編輯于星期三(1)轉錄因子的種類基礎轉錄因子(basalfactor)：是RNA聚合酶II在所有啟動子上形成轉錄起始復合物時所需的轉錄因子。活化因子(activator)：是通過作用于啟動子以刺激RNA聚合酶的結合，從而刺激基因表達。真核生物中，活化因子結合的啟動子中的序列，稱為應答元件。協同活化因子(coactivator)：不結合DNA，是活化因子和基礎轉錄因子相互作用時所需要的轉錄因子。現在是29頁\一共有57頁\編輯于星期三螺旋轉角螺旋鋅指結構亮氨基拉鏈螺旋環螺旋同源異形結構域現在是30頁\一共有57頁\編輯于星期三最初是在爪蟾(Xenopuslaevis)的RNA聚合酶III轉錄因子(TFIIIA)中發現的。9個串聯重復的鋅指區組成，每個單位大約由30個氨基酸殘基組成?；蛞蛟阡\結合位點上突出的氨基酸環的形狀如同手指，所以稱為“指狀”結構。這種蛋白質結構域是同DNA或RNA結合的部位。單個的鋅指保守序列是：Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X2-His

這里x2、x5代表2個和5個任何一種氨基酸殘基?，F在是31頁\一共有57頁\編輯于星期三亮氨酸是疏水性氨基酸，排列在雙螺旋的一側，所有帶電荷的氨基酸殘基排在另一側。當2個蛋白質分子平行排列時，亮氨酸之間相互作用形成二聚體，形成“拉鏈”。由于這類蛋白質都以二聚體形式與DNA結合，兩個蛋白質α螺旋上的亮氨酸一側是形成拉鏈型二聚體的基礎。然而，亮氨酸拉鏈區并不能直接結合DNA，只有肽鏈氨基端20～30個富含堿性氨基酸結構域與DNA結合?，F在是32頁\一共有57頁\編輯于星期三（2）轉錄因子的作用作用于啟動子之應答元件以刺激RNA聚合酶的結合，從而刺激基因表達.現在是33頁\一共有57頁\編輯于星期三能與某個（類）專一蛋白因子結合，從而控制基因特異表達的DNA上游序列稱為應答元件（responseelement），如熱激應答元件（HSE,heatshockresponseelement），糖皮質應答元件（glucocorticoidresponseelement,GRE），金屬應答元件（metalresponseelement,MRE）。它們與細胞內高度專一的轉錄因子(活化因子)相互作用，協調相關基因的轉錄?，F在是34頁\一共有57頁\編輯于星期三現在是35頁\一共有57頁\編輯于星期三舉例1：類固醇激素（性激素、糖皮質激素等）誘導的基因表達靶細胞內具有專一的細胞質受體（活化因子），可與激素形成復合物，導致三維結構甚至化學性質的變化。經修飾的受體與激素復合物通過核膜進入細胞核內，并與染色質特定區域（應答元件）結合，導致基因轉錄的起始。現在是36頁\一共有57頁\編輯于星期三許多生物受熱誘導時能合成一系列熱激蛋白（heatshockprotein）。例如，受熱后果蠅細胞內熱激蛋白mRNA水平提高1000倍。此現象是由熱激因子（heatshockfactor,HSF）與熱激蛋白基因TATA區上游60bp處的熱激應答元件（heatshockresponseelement,HSE）結合，誘發轉錄形成的。舉例2：熱激蛋白的誘導表達

現在是37頁\一共有57頁\編輯于星期三Heatstresseffectsonproteinsynthesisinsoybeanseedlings(J.Key).現在是38頁\一共有57頁\編輯于星期三Heat-shocktranscriptionfactor(HSF)BindstoHSEsContainsleucinezippermotifsActivityisinducedbyheat,andphosphorylationActivityRepressedbyHSP70現在是39頁\一共有57頁\編輯于星期三在沒有受熱或其它環境脅迫時，HSF主要以單體的形式存在于細胞質和核內。單體HSF沒有DNA結合能力，Hsp70可能參與了維持HSF的單體形式。受到熱激時，細胞內變性蛋白增多，它們與HSF競爭結合Hsp70，從而釋放HSF，使之形成三體并輸入核內。HSF一旦形成三體，便具有與HSE特異結合、促進基因轉錄的功能?，F在是40頁\一共有57頁\編輯于星期三現在是41頁\一共有57頁\編輯于星期三舉例3:cAMP信號系統調節基因轉錄CRE(cAMPresponseelement)

CREB(cAMPresponseelementbindingprotein)現在是42頁\一共有57頁\編輯于星期三誘導表達克隆載體誘導表達克隆載體中的啟動子在特殊的誘導條件下才具有轉錄活性。例如熱誘導表達克隆載體，糖皮質激素誘導表達克隆載體現在是43頁\一共有57頁\編輯于星期三基因在染色體定位整合的原理：同源重組2.Applicationofsite-specifichomologousrecombination(基因定位整合)現在是44頁\一共有57頁\編輯于星期三染色體定位整合克隆載體1基因整合平臺系統1）整合平臺指受體細胞染色體DNA上的一個特定區域，是外源DNA的定位整合位點。2）定位整合載體定位整合載體除了一般質?？寺≥d體必須具備的元件外，還必須含有一個或兩個與整合平臺DNA序列同源的DNA片段（大于1kb）?，F在是45頁\一共有57頁\編輯于星期三3.Furthertransgenicstrategiesforgeneinhibition3.1antisenseRNA

AntisenseRNAhastheoppositesensetomRNA.ThepresenceofcomplementarysenseandantisenseRNAmoleculesinthesamecellcanleadtotheformationofastableduplex,whichmayinterferewithgeneexpressionattheleveloftranscription,RNAprocessingorpossiblytranslation.現在是46頁\一共有57頁\編輯于星期三5′

CAUG

3′

mRNA

3′

GUAC

5′

AntisenseRNA反義RNA作用原理現在是47頁\一共有57頁\編輯于星期三In1988,Smithetal.generatedtransgenictomatoplantscarryinganantisenseconstructtargetingtheendogenouspolygalacturonase(PG)gene.Theproductofthisgeneisanenzymethatcausessofteningandleadstooverripening.ThelevelsofpgmRNAintransgenicplantswerereducedto6%ofthenormallevelsandthefruithadalongershelf-lifeandshowedresistancetobruising.現在是48頁\一共有57頁\編輯于星期三3.2RNAinterference(RNAi)

RNAiisanovelphenomenonthathasthepotentialtobecomeanextremelypowerfultoolforgenesilencinginanyorganism.OnlyafewmoleculesofdsRNAwerenecessaryforRNAi.InterferencecouldbeachievedonlyifthedsRNAwashomologoustotheexonsofatargetgene.DsRNAcreatssmallRNAmolecules,calledguideRNAs.GuideRNAsmayassemblewithcertainproteinstogenerateacatalyticendonucleasecomplexthatcleavestargetmRNAmoleculesefficientlyandinahomology-dependentfashion.現在是49頁\一共有57頁\編輯于星期三