采樣和取制樣第一頁，共四十二頁，2022年，8月28日主要內容：§1清洗、消毒和滅菌操作§2培養基的制備§3采樣和取、制樣§4接種、分離純化§5制片、染色及顯微觀察§6實驗室安全基礎知識第二頁，共四十二頁，2022年，8月28日§

3.采樣和取、制樣樣品的采樣和取、制樣是食品微生物檢驗的重要組成部分。要得到準確的檢測結果，必需正確掌握采樣技術、樣品傳遞、樣品保存方法和樣品的制備技術，保證樣品在從采樣到制樣整個過程中的一致性。如果樣品的采取、運送、保存或制備過程中操作不當，或者樣品不具有代表性，就會使實驗室的微生物檢驗結果毫無意義。對采樣人員和制樣人員提出了很高的專業要求，既要保證樣品的代表性和一致性，又要保證整個微生物檢驗過程在無菌操作的條件下完成。第三頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.1采樣

采樣是指在一定質量或數量的產品中，取一個或多個代表性樣品，用于微生物檢驗的過程。樣品必須對采樣的整個產品或批量具有代表性。樣品的大小應能滿足在需要時進行重復分析的需要。第四頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.1.1采樣準備工作1.采樣工具采樣工具要達到無菌的要求。對采樣工具和一些試劑材料應提前準備、滅菌。1）開啟容器的工具：剪刀、刀子、開罐器、鉗子等。雙層紙包裹滅菌（121℃，15min），干燥潔凈的環境中保存2個月。2）樣品采集工具：滅菌的鏟子、勺子、取樣器、鑷子、鋸子、刀子、剪子、壓舌板、木（電）鉆、打孔器、金屬試管和試子等。3）取樣容器：滅菌的廣口瓶或細口瓶，聚乙烯袋（瓶）、金屬試管或類似的密封金屬容器。最好不使用玻璃容器，運輸中易碎。4）溫度計：-20℃~100℃，溫度間隔1℃。最好使用金屬或電子溫度計。使用前在70%~75%乙醇溶液或次氯酸鈉（濃度不小于100mg/L）中浸泡消毒（不小于30s）。第五頁，共四十二頁，2022年，8月28日5)消毒劑：70%~75%乙醇溶液、中等濃度（100mg/L）次氯酸鈉溶液等。6）標記工具：標簽紙（不干膠標簽紙）、油性或不可擦拭記號筆。7）樣品運輸工具：便攜式冰箱或保溫箱。8）天平：最大量程為2000g，感量為0.1g。9）攪拌器和混合器：必要時配備帶有滅菌灌的攪拌器或混合器。10）稀釋液：滅菌的磷酸鹽緩沖液、0.1%蛋白胨水、生理鹽水以及其他稀釋液如腦心浸液肉湯、M肉湯、LB肉湯等。11）防護用品：對樣品的防護。即保護生產環境、原料和成品等不會在取樣過程中被污染，同樣也保護樣品不被污染。工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。事先消毒滅菌（或使用一次性無菌物品)。第六頁，共四十二頁，2022年，8月28日應根據不同的樣品特征和采樣環境，對采樣物品和試劑進行事先準備和滅菌等工作。實驗室的工作人員進入車間采樣時，必須更換工作服，避免將實驗室的菌體帶入加工環境，造成加工過程的污染。第七頁，共四十二頁，2022年，8月28日2.采樣方案

微生物檢驗的特點是一個以小份樣品的檢測結果來說明一大批食品衛生質量，因此，用于分析的樣品的代表性至關重要，也即樣品的數量、大小和性質對結果判定產生重大影響。要保證樣品的代表性首先要有一套科學的采樣方案，其次使用正確的采樣技術，并在樣品的保存和運輸過程中保持樣品的原有狀態。一般說來，進出口貿易合同對食品采樣量有明確規定的，按合同規定采樣；進出口貿易合同沒有具體采樣規定的，可根據檢驗的目的，產品及被抽樣品批的性質和分析方法的性質確定采樣方案。目前的采樣方案多為ICMSF推薦的采樣方案和隨機采樣方案。無論采取何種方法采樣，每批貨物的采樣數量不得少于5件。對于需要檢驗沙門氏菌的食品，采樣數量應適當增加，最低不少于8件。第八頁，共四十二頁，2022年，8月28日1)采樣的術語批量貨物：數量確定的貨物，品質必須均勻一致。抽檢貨物：從批量貨中的一個位置取出的少量貨物。混合貨樣：條件允許，從某一特定批量采樣、混合，即為混合貨樣，亦即大樣。樣品單位：從監督總體中抽取用于檢驗的樣品中的單位產品。樣品量：樣品中所包含的樣品單位數。合格判定數：在計數采樣檢查中，對接收批的樣品允許出現的缺陷數或不合格品數的上限值，合格判定數又稱可接受數。批：一批產品中或特定階段或時間內代表相同質量樣品的單元數。第九頁，共四十二頁，2022年，8月28日隨機采樣：在一批產品中，每個樣品或單元都有同樣被選擇的機會。這種采樣方法被稱為隨機采樣。采樣時常需要查閱隨機數字表。代表性樣品：廣義上講是指能夠代表一個批的樣品，而不是僅代表其中的一部分。要獲得代表性樣品需要以下四個條件：確定整批產品的采樣點；建立能夠代表整個產品特征的采樣方法；選擇樣品大小；規定采樣的頻率。第十頁，共四十二頁，2022年，8月28日2）采樣原則(1)根據檢驗目的、食品特點、批量、檢驗方法、微生物的危害程度等確定采樣方案;(2)應采用隨機原則進行采樣，確保所采集的樣品具有代表性;(3)采樣過程遵循無菌操作程序，防止一切可能的外來污染；(4)樣品在保存和運輸的過程中，應采取必要的措施防止樣品中原有微生物的數量變化，保持樣品的原有狀態。

第十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日3）采樣方案的類型依據GB4789.1-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗總則》(1)類型采樣方案分為二級和三級采樣方案。二級采樣方案設有n、c和m值，三級采樣方案設有n、c、m和M值。第十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日

n：同一批次產品應采集的樣品件數；

c：最大可允許超出m值的樣品數；

m：微生物指標可接受水平的限量值；

M：微生物指標的最高安全限量值。

注1：按照二級采樣方案設定的指標，在n個樣品中，允許有≤c個樣品其相應微生物指標檢驗值大于m值。

注2：按照三級采樣方案設定的指標，在n個樣品中，允許全部樣品中相應微生物指標檢驗值小于或等于m值；允許有≤c個樣品其相應微生物指標檢驗值在m值和M值之間；不允許有樣品相應微生物指標檢驗值大于M值。第十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日

例如：n=5，c=2，m=100CFU/g，M=1000CFU/g。含義是從一批產品中采集5個樣品，若5個樣品的檢驗結果均小于或等于m值（≤100CFU/g），則這種情況是允許的；若≤2個樣品的結果（X）位于m值和M值之間（100CFU/g<X≤1000CFU/g），則這種情況也是允許的；若有3個及以上樣品的檢驗結果位于m值和M值之間，則這種情況是不允許的；若有任一樣品的檢驗結果大于M值（>1000CFU/g），則這種情況也是不允許的。第十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日（2）各類食品的采樣方案

按相應產品標準中的規定執行。（3）食源性疾病及食品安全事件中食品樣品的采集

由工業化批量生產加工的食品污染導致的食源性疾病或食品安全事件，食品樣品的采集和判定原則按以上的（1）和（2）執行。同時，確保采集現場剩余食品樣品。由餐飲單位或家庭烹調加工的食品導致的食源性疾病或食品安全事件，食品樣品的采集按GB14938中衛生學檢驗的要求，以滿足食源性疾病或食品安全事件病因判定和病原確證的要求。

第十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日4）ICMSF采樣方案簡介國際食品微生物標準委員會（ICMSF）所建議的采樣計劃是目前世界各國在食品微生物工作中常用的采樣方案。ICMSF提出的采樣基本原則根據：

a)各種微生物本身對人的危害程度各有不同。

b）食品經不同條件處理后，其危害度變化情況：①降低危害度；②危害度未變；③增加危害度，來設定采樣方案并規定其不同采樣數。第十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日ICMSF的采樣方法

有些實驗室在每批產品中，僅采一個檢樣進行檢驗，該批產品是否合格，全憑這個檢樣來決定。ICMSF方法與此不同，它是從統計學原理來考慮，對一批產品，檢查多少檢樣，才能夠有代表性，才能客觀地反映出該產品的質量而設定的。

ICMSF方法中包括二級法及三級法兩種。二級法只設有n、с及m值，三級法則有n、c、m及M值。M即附加條件后判定合格的菌數限量。第十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日（1）二級采樣方案自然界中材料的分布曲線一般是正態分布，以其一點作為食品微生物的限量值，只設合格判定標準m值，超過m值的，則為不合格品。檢查在檢樣是否有超過m值的，來判定該批是否合格。例如生食海產品魚的副溶血性弧菌標準為n=5，c=0，m=102，n=5即采樣5個，c=0即意味著在該批檢樣中，未見到有菌落數超過m值的檢樣，此批貨物為合格品。第十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日（2）三級采樣方案設有微生物標準m及M值兩個限量如同二級法，超過m值的檢樣，即算為不合格品。其中以m值到M值的范圍內的檢樣數，作為c值，如果在此范圍內，即為附加條件合格，超過M值者，則為不合格。例如：冷凍生蝦的細菌總數標準n=5，c=3，m=101，M=102，其意義是從一批產品中，取5個檢樣，經檢樣結果允許≤3個檢樣的菌落數是在m和M值之間。如果有3個以上檢樣的菌落數是在m和M值之間或一個檢樣菌落數超過M值者，則判定該批產品為不合格品。第十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日（3）ICMSF對食品中微生物的危害度分類與采樣方案說明為了強調采樣與檢樣之間的關系，ICMSF已經闡述了把嚴格的采樣方案與食品危害程度相聯系的概念（ICMSF，1986）。在中等或嚴重危害的情況下使用二級采樣方案，對健康危害低的則建議使用三級采樣方案。

ICMSF是將微生物的危害度、食品的特性及處理條件三者綜合在一起進行食品中微生物危害度分類的。這個設想是很科學的，符合實際情況的，對生產廠及消費者來說都是比較合理的。下面結合表1加以說明。第二十頁，共四十二頁，2022年，8月28日表1、ICMSF按微生物的危害度及食品處理進行情況分類

級別危害程度對象微生物食品經不同處理后的危害度減少（加熱）無變化（冷凍品立刻進食）增加危害度（未加熱吃到吃前還有一段時間）

三級方案1.食品的保藏2.輕度間接指標菌3.中度程度局部傳播菌落總數大腸菌群、大腸桿菌金黃色葡萄球菌（指標菌）金黃色葡萄球菌蠟樣芽孢桿菌產氣莢膜梭菌例1n=5c=3例4n=5c=3

例7n=5c=2例2n=5c=2例5n=5c=2

例8n=5c=1例3n=5c=1例6n=5c=1

例9n=10c=1二級方案4.中度程度廣泛傳播5.嚴重程度沙門氏菌副溶血性弧菌致病性大腸桿菌肉毒梭菌、霍亂弧菌傷寒沙門氏菌副傷寒沙門氏菌例10n=5c=0例13n=15c=0例11n=10c=0例14n=30c=0例12n=20c=0例15n=60c=0注：1.表中“減少”系指食品經加熱殺死污染的細菌。

2.“無變化”系指微生物數不增減例如冷凍食品或干燥食品。

3.“增加”系指將食品保存在不良環境中使微生物易于繁殖和產毒。

4.n：一批產品采樣個數。c：該批產品的樣品菌落數中，超過限量的檢樣數。第二十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日

根據表1中15種情況的舉例，1-3可用三級法，4-5可用二級法來判定是否合格。

考慮到以上15種情況，分別設定不同的取樣數及檢樣污染數，在1-9例中檢樣需采5個（n=5），而污染檢樣數設定為c=3，2，1。在10-15例用二級法則不得檢出該致病菌c=0。例如冷凍食品，細菌數按例2，大腸菌按例5，金黃色葡萄球菌按例8，沙門氏菌按例11的二級法判定。

對食品處理應酌情考慮，例如生肉火腿中的金黃色葡萄球菌，被腐敗菌所抑制，不易發生食物中毒，適用例7和例8。烹調加工后的熟肉，對腐敗菌沒有抵抗力，則易發生食物中毒，適用例9。加熱鹽腌的火腿，水分活性為0.86以下，金黃色葡萄球菌有增殖的可能性，因此適用例9。沙門氏菌水活性在0、94以下不能繁殖，適用例11，如上所述，應根據各種食品的危害度進行設定。第二十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日

ICMSF方法是以二級法、三級法和抽樣的概念為基礎，再將微生物的知識加進來，則可以提出各種食品的微生物標準。如表2。為了安全，冷凍生蝦加熱吃，減少危害度適用例1、4、10。冷凍加工蝦，為了不加熱就食，在解凍中有增強危害度的可能性，適用例3、6、9、12，對象微生物特別指定金黃色葡萄球菌腸毒素，兩者雖菌數限量是相同的，但情況有所不同，分別適用c=3，c=1，因此不依靠菌數限量，而用合格率來控制。第二十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日表2、ICMSF蝦的微生物標準食品名稱檢查項目例級別nc菌數限量/gmM冷凍生蝦

冷凍烹調蝦細菌數大腸菌群金黃色葡萄球菌副溶血性弧菌細菌數大腸菌群金黃色葡萄球菌副溶血性弧菌144103691233323332555555553330111010641031021064103102

1074002×103—1074002×103—注：n：一批產品采樣個數。

c：該批產品的檢樣菌數中，超過限量的檢樣數，即結果超過合格菌數限量的最大允許數。

m：合格菌數限量，將可接受與不可接受的數量區別開。

M：附加條件，判定為合格的菌數限量，表示邊緣的可接受數與邊緣的不可接受數之間的界限。第二十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日5）隨機采樣方案在現場采樣時，可利用隨機采樣表進行隨機采樣。隨機采樣表（SN0330-1994《出口食品中微生物檢驗通則》系用計算機隨機編制而成，包括一萬個數字。其使用方法如下：

a.先將一批產品的各單位產品（如箱、包、盒等）按順序編號。如將一批600包的產品編為1、2……600。

b.隨意在表上點出一個數。查看該數字所在的行和列。如點在第48行、第10列的數字上。

c.根據單位產品編號的最大位數（如A1，最大為三位數），查出所在行的連續列數字（如A2所點數為第48行、第10、11和12列，其數字為245），則編號與該數相同的那一份單位產品，即為一件應抽取的樣品。

d.繼續查下一行的相同連續列數字（如按A3、即第49行的第10、11和12列的數字，為608）。該數字所代表的單位產品為另一件應抽取的樣品。

e.依次按A4所述方法查下去。當遇到所查數超過最大編號數量（如第50行的第10、11和12列的數字為931、大于600）則舍去此數，繼續查下一行相同列數，直到完成應抽樣品件數為止。第二十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日采樣方法

確定了采樣方案以后，采樣方法對采樣方案的有效執行和保證樣品的有效性代表性至關重要。采樣必須遵循無菌操作程序，采樣工具如整套不銹鋼勺子、鑷子、剪刀等應當高壓滅菌，防止一切可能的外來污染。容器必需清潔、干燥、防漏、廣口、滅菌，大小適合盛放檢樣。采樣全過程中，應采取必要的措施防止食品中固有微生物的數量和生長能力發生變化。確定檢驗批，應注意產品的均質性和來源，確保檢樣的代表性。第二十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日各類食品的采樣方法采樣應遵循無菌操作程序，采樣工具和容器應無菌、干燥、防漏，形狀及大小適宜。1．即食類預包裝食品：取相同批次的最小零售原包裝，檢驗前要保持包裝的完整，避免污染。2．非即食類預包裝食品

：原包裝小于500g的固態食品或小于500mL的液態食品，取相同批次的最小零售原包裝；大于500mL的液態食品，應在采樣前搖動或用無菌棒攪拌液體，使其達到均質后分別從相同批次的n個容器中采集5倍或以上檢驗單位的樣品；大于500g的固態食品，應用無菌采樣器從同一包裝的幾個不同部位分別采取適量樣品，放入同一個無菌采樣容器內,采樣總量應滿足微生物指標檢驗的要求。第二十七頁，共四十二頁，2022年，8月28日3．散裝食品或現場制作食品：

根據不同食品的種類和狀態及相應檢驗方法中規定的檢驗單位，用無菌采樣器現場采集5倍或以上檢驗單位的樣品，放入無菌采樣容器內,采樣總量應滿足微生物指標檢驗的要求。4．食源性疾病及食品安全事件的食品樣品

采樣量應滿足食源性疾病診斷和食品安全事件病因判定的檢驗要求。第二十八頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.2樣品的標記和運輸應對采集的樣品進行及時、準確的記錄和標記，采樣人應清晰填寫采樣單（包括采樣人、采樣地點、時間、樣品名稱、來源、批號、數量、保存條件等信息）。樣品的標記

（1）所有盛樣容器必須有和樣品一致的標記。在標記上應記明產品標志與號碼和樣品順序號以及其他需要說明的情況。標記應牢固，具防水性，字跡不會被擦掉或脫色。（2）當樣品需要托運或由非專職采樣人員運送時，必須封識樣品容器。第二十九頁，共四十二頁，2022年，8月28日樣品的保存和運送

（1）采樣后，應將樣品在接近原有貯存溫度條件下盡快送往實驗室檢驗。運輸時應保持樣品完整。如不能及時運送，應在接近原有貯存溫度條件下貯存。例如冷凍樣品應存放在-15℃以下冰箱或冷藏庫內；冷卻和易腐食品存放在0-4℃冰箱或冷卻庫內；其他食品可放在常溫冷暗處。（2）運送冷凍和易腐食品應在包裝容器內加適量的冷卻劑或冷凍劑。保證途中樣品不升溫或不融化。必要時可于途中補加冷卻劑或冷凍劑。（3）如不能由專人攜帶送樣時，也可托運。托運前必須將樣品包裝好，應能防破損，防凍結或防易腐和冷凍樣品升溫或融化。在包裝上應注明“防碎”、“易腐”、“冷藏”等字樣。（4）作好樣品運送記錄，寫明運送條件、日期、到達地點及其他需要說明的情況，并由運送人簽字。保存方法聯合國糧農組織(FAO)推薦的樣品保存方式可作參考。第三十頁，共四十二頁，2022年，8月28日3樣品的制備3.3.1樣品檢驗

實驗室樣品的制備是微生物檢驗的重要環節，是獲得較高準確性和良好檢驗結果的基礎。樣品處理

1）實驗室接到送檢樣品后，應認真核對登記，確保樣品的相關信息完整并符合檢驗要求。

2）實驗室應按要求盡快檢驗。若不能及時檢驗，應采取必要的措施保持樣品的原有狀態，防止樣品中目標微生物因客觀條件的干擾而發生變化。

3）冷凍食品應在45℃以下不超過15min，或2℃~5℃不超過18h解凍后進行檢驗。第三十一頁，共四十二頁，2022年，8月28日檢驗方法的選擇

GB4789.1-2010要求:1）應選擇現行有效的國家標準方法。

2）食品微生物檢驗方法標準中對同一檢驗項目有兩個及兩個以上定性檢驗方法時，應以常規培養方法為基準方法。

3）食品微生物檢驗方法標準中對同一檢驗項目有兩個及兩個以上定量檢驗方法時，應以平板計數法為基準方法。第三十二頁，共四十二頁，2022年，8月28日GB/T4789.17~25-2003中分別規定了肉與肉制品、乳與乳制品、蛋與蛋制品、水產食品、清涼飲料、調味品、冷食菜和豆制品、糖果和糕點及果脯、酒類的樣品的制備方法。以上標準規定使用的稀釋劑均為無菌蒸餾水或生理鹽水，大多數產品標準也主要使用這兩種稀釋劑，而且對待檢樣品的制備方式相當單一。反映出我國相關標準比較滯后，缺乏先進性，微生物樣品制備的方法在實際應用中針對性差，操作性不強。第三十三頁，共四十二頁，2022年，8月28日

由于食品種類繁多，在實際微生物檢驗中盡可能采用統一的樣品制備方法。對于許多特殊產品，由于產品本身的物理狀態（如干品、粘稠度高的產品等）、樣品中抑制劑存在（如大蒜制品、洋蔥制品、咸魚等）或酸性等原因，需要采用特殊的樣品制備方法。包括：

1）調整食品稀釋液的pH至中性；

2）對于含高抑制物質（成分）的產品（如大蒜制品、洋蔥制品等）或所含微生物受損的產品（如酸性食品、鹽漬食品、干制食品等），使用緩沖蛋白胨水或其他稀釋劑（如D/E中和肉湯、腦心浸液肉湯等）；

3）對于低水分活度的食物，需要采取特殊復水程序；第三十四頁，共四十二頁，2022年，8月28日4）調整適當溫度和靜置時間，以利于可可粉、明膠、奶粉等樣品的懸浮；5）對于來自食物加工或貯存過程中的受損微生物，需要采取特殊復蘇程序；6）某些產品（如谷物）和（或）目標菌（如酵母菌和霉菌）的特殊均質程序及均質時間；7）對于高脂肪食品，使用表面活性劑（如1g/L到10g/L聚山梨醇酯80），促進懸浮過程中的乳化作用。第三十五頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.3.2稀釋液的選擇常用和特殊稀釋液常用稀釋液包括：0.85%生理鹽水、緩沖蛋白胨水（BPW）、0.1%蛋白胨水、磷酸鹽緩沖溶液、無菌蒸餾水等。特殊稀釋液包括：D/E中和肉湯、LB肉湯、M肉湯等。最合適的稀釋液應該通過一系列的試驗得到，所選擇的稀釋液應該具有最高的復蘇率。第三十六頁，共四十二頁，2022年，8月28日3.3.2.2厭氧微生物的稀釋液應使用具有抗氧化作用的培養基作為稀釋液。制備樣品懸液時應盡量避免氧氣進入，使用袋式拍擊式均質器。配備一些特殊的樣品防護措施，如厭氧工作站等。3.3.2.3嗜滲菌和嗜鹽菌的稀釋液

20%的無