臨床微生物學檢驗

第五個實驗周

目的要求1.掌握下呼吸道標本的分離培養及檢測方法2.掌握的銅綠假單胞菌形態染色、培養特性、菌落特征和鑒定方法3.掌握流感、副流感嗜血桿菌形態染色、培養特性、菌落特征和鑒定方法

菌種試劑菌種：流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、金黃色葡菌球菌標本：模擬痰標本

主要試劑：X、V、X＋V因子紙片，氧化酶試劑，革蘭染色液不發酵細菌微量生化編碼管

第一天實驗內容模擬痰標本①分離培養：接種（1個大血平/人+1個Mac/人+1個巧克力/人）②涂片干燥固定后革蘭染色流感嗜血桿菌或副流感嗜血桿菌：①菌落觀察、涂片干燥固定后革蘭染色②衛星試驗（1個小血平板/人）因子試驗（MH平板1個/人）③轉種巧克力平板（2個/組）

痰液及上呼吸道標本

肉眼觀察培養前處理①直接涂片檢查②

血平板、Mac

特殊細菌培養初報

巧克力平板

選擇適當培養基和條件

菌落觀察分離鑒定涂片純培養

生化鑒定藥敏

最終報告

②合格痰標本：白細胞＞25/低倍視野，鱗狀上皮細胞＜10/低倍視野①洗痰、胰酶均質化嗜血桿菌屬形態：G-b細小呈球桿狀短絲狀或多形態

培養：5-10%CO2

營養要求高生長需X或V因子

巧克力平板菌落:直徑0.5-1.5mm、圓形、光滑、濕潤、無色或灰白色半透明小菌落革蘭陰性短小球桿菌（有多形性）副流感嗜血桿菌革蘭染色結果培養基：巧克力平板血液中含有X、V因子，V因子處于抑制狀態，加熱80-90℃10-15min可破壞V因子的抑制物使V因子發揮作用。巧克力瓊脂中加入抗生素可提高檢出率

菌落特征:巧克力平板上無色或灰白色半透明小菌落衛星試驗：金葡菌能合成釋放V因子，在金葡菌菌落周圍，流感嗜血桿菌菌落較大，遠離則小因子試驗：MH平板上貼上X、V、X＋V因子紙片，不同嗜血桿菌會在所需因子紙片周圍生長副流感嗜血桿菌流感嗜血桿菌衛星試驗（血平板）金黃色葡萄球菌（劃線或點種）

流感嗜血桿菌（密集涂布于平板上）衛星試驗陽性結果

嗜血桿菌（密集涂布于平板上）X＋VVX因子試驗（MH平板）操作方法、注意事項X＋V生長，V生長因子試驗結果第一天實驗內容模擬痰標本①分離培養：接種（1個大血平/人+1個Mac/人+1個巧克力/人）②涂片干燥固定革蘭染色流感嗜血桿菌或副流感嗜血桿菌：①巧克力平板上菌落觀察、涂片干燥固定革蘭染色衛星試驗（1個小血平板/人）因子試驗（1個MH平板/人）③轉種巧克力平板（2個/組）部分接種流感，部分接種副流感一個接種流感嗜血桿菌，一個接種副流感②金葡點種或劃線第二天實驗內容嗜血桿菌：①觀察分區劃線結果，觀察菌落特點②衛星現象結果觀察③因子試驗結果觀察痰標本：血平板菌落觀察和革蘭染色、氧化酶試驗。麥康凱和巧克力平板上菌落觀察。取Mac上淺粉紅色的菌落接種相應的微量生化編碼系統（非發酵菌微量生化編碼系統）。

（上述實驗每人均做）流感嗜血桿菌培養24h菌落菌落:直徑0.5-1.5mm、圓形、光滑、濕潤、無色或灰白色半透明小菌落流感嗜血桿菌培養48h菌落同學分離的流感嗜血桿菌菌落流感嗜血桿菌衛星試驗陽性結果流感嗜血桿菌和副流感嗜血桿菌衛星現象結果（二者衛星現象均陽性，上面“+”，下面“-”）溶血嗜血桿菌的衛星試驗陽性流感嗜血桿菌衛星試驗陽性某同學做的“衛星試驗”副流感嗜血桿菌因子試驗結果流感嗜血桿菌因子試驗結果X+V因子周圍生長流感嗜血桿菌因子試驗結果X+V因子周圍生長溶血嗜血桿菌因子試驗結果

X因子V因子β溶血流感嗜血桿菌++-副流感嗜血桿菌-+-

X因子V因子β溶血

流感嗜血桿菌++-

溶血嗜血桿菌+++

副流感嗜血桿菌-+-

副嗜沫嗜血桿菌-+-

副溶血嗜血桿菌-++

杜克雷嗜血桿菌+--

嗜沫嗜血桿菌---

幾種嗜血桿菌對生長因子需求痰培養平板上致病菌的初步判斷原則：需要結合“痰標本涂片、培養及臨床表現”才能判斷培養出來的細菌是定植還是致病菌①患者的血象、體溫、胸痛和肺部啰音等體現感染的臨床表現。②痰涂片鏡檢見大量白細胞吞噬細菌③痰涂片見到的細菌培養大量生長（占所分出細菌的50%以上）綠色色素、金屬光澤、特殊氣味、β-溶血環血平板麥康凱平板巧克力平板巧克力平板：菌落圓形、大小不一、邊緣不整、扁平、濕潤、常呈融合態，特殊氣味、色

素不易觀察到。血平：類似巧克力瓊脂上菌落，綠色色素、特殊氣味，有金屬光澤、有β溶血。

銅綠假單胞菌菌落形態革蘭染色銅綠假單胞菌G-b、菌體長短不一、球桿狀或長絲狀

可疑菌落（痰培養中優勢菌）涂片革蘭染色革蘭陰性桿菌氧化酶(+)

非發酵菌鑒定系統鑒定到種

非發酵菌微量生化鑒定系統第三天實驗內容1.不發酵菌微量編碼系統結果判斷2.痰標本鑒定結果報告非發酵菌微量生化鑒定系統DNA酶試驗

原理：甲基綠與長鏈DNA結合呈綠色，而短鏈的寡核苷酸不與甲基綠結合，呈灰白色。

精氨酸雙水解酶試驗（在非發酵菌鑒定中不加石蠟油）

原理：精氨酸經兩次水解后,生成鳥氨酸、氨及二氧化碳。鳥氨酸又在脫羧酶的作用下生成腐胺。氨及腐胺均為堿性物質，故可使培養基變堿，用指示劑指示出來。

乙酰胺利用試驗

原理：許多非發酵菌產生一種脫酰胺酶，可使乙酰胺經脫酰胺作用釋放氨，使培養基變堿。

非發酵菌微量編碼系統結果判斷枸櫞酸鹽麥芽糖精氨酸甘露醇木糖乙酰胺DNA硝酸鹽葡萄糖(厭氧)葡萄糖(需氧)氧化酶III