第二十章重組DNA技術recombinantDNAtechnique第一節

重組DNA技術的基本過程重組DNA技術：又稱DNA克隆或基因克隆應用酶學的方法，在體外將不同來源的特異基因或DNA片段插入病毒、質粒或其它載體分子，構建重組DNA分子，然后將重組DNA導入到合適的受體細胞中，使其在細胞中擴增和繁殖（稱之為“克隆”），篩選出含有目的基因的轉化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子。克隆(clone)：來自同一始祖的相同副本或拷貝的集合。克隆化(cloning)：獲取這類同一的DNA分子群體、細胞群體或個體群體的過程，即無性繁殖。重組DNA(recombinantDNA,或嵌合DNA,chimeraDNA)：采用克隆技術，把來自不同生物的外源DNA插入載體分子所形成的雜合DNA分子。重組DNA技術的基本過程

第二節重組DNA技術中常用工具酶

一、限制性核酸內切酶二、DNA連接酶三、DNA聚合酶四、其它修飾酶

1.限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease)—基因工程的手術刀功能：

識別雙鏈DNA中特異序列，該序列的特征為4-6個核苷酸的回文結構，并在識別序列內或附近特異切割DNA，產生黏性末端或平末端。

根據需要在特定的位點精確切割雙鏈DNA分子。作用：與甲基化酶共同構成細菌的限制修飾系統，限制外源DNA，保護自身DNA。分類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數字表示發現的先后次序。命名：HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構

(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGG

作用模式圖：（1）產生5

突出黏性末端

(stickyend)EcoRI**********GAATTC******************CTTAAG********5′3′5′3′*********G*********CTTAA

5′3′3′5′—OH—P

AATTC*********G*********5′3′3′5′P

OH—

作用模式圖：（2）產生3突出黏性末端PstI**********CTGCAG************************GACGTC**************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*********CTGCA*********G5′3′3′5′OH——PACGTC***********G***********

作用模式圖：（3）產生平末端

(bluntend)AluI*************AGCT**************************TCGA*************5′3′5′3′5′3′3′5′—OH—P*************AG*************TC5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************同裂酶來源不同但能識別相同序列的酶，又稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制性內切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產生相同的黏性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的黏性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA

可變酶

識別DNA序列中的一個或幾個堿基是可變的，并且識別序列往往超過6個核苷酸。此類酶是Ⅱ型限制酶的特例。

如：BstpⅠGGTNACC;

Bbl

ⅠGCC(N)4NGGC2.

DNA連接酶(DNAligase)

—基因工程的縫紉針

將兩條雙鏈DNA片段連接起來，實現DNA的體外重組。功能：

催化兩條雙鏈DNA分子的互補黏性末端或平末端的5磷酸基團與3羥基形成磷酸酯鍵。

也可將雙鏈DNA分子內部的單個切口(無核苷酸空缺)連接起來。還可作用于RNA，但效率很低。

DNA連接酶催化平末端連接要比黏性末端效率低得多。

DNA連接酶有T4DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶

DNA連接酶

EcoRI**********GAATTC********************CTTAAG**********5′3′5′3′*********G*********CTTAA5′3′3′5′—OH—PAATTC*********G*********5′3′3′5′—P

OH—DNA連接酶作用模式圖：（1）連接黏性末端

作用模式圖：（2）連接平末端AluI*************AGCT***************************TCGA**************5′3′5′3′—OH—P5′3′3′5′************TC************AG5′3′3′5′

OH——PCT*************GA*************DNA連接酶

能夠把脫氧核糖核苷酸連續地添加到雙鏈DNA分子引物鏈的3′-OH末端，催化核苷酸的聚合作用

類型：

大腸桿菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段

TaqDNA聚合酶反轉錄酶

三、DNA聚合酶

四、其它修飾酶

末端脫氧核苷酸轉移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase）

多核苷酸激酶（polynuleotidekinase）堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）

功能：催化脫氧核糖核苷酸轉移到單鏈或雙鏈DNA分子的3′-OH末端上。(1)底物是單鏈DNA或有3′突出末端的雙鏈DNA。OH5′3′Mg2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi

5′3′OHMg2+dNTPnppi5′3′(A、G、C、T)n末端轉移酶

(2)底物是平端或3′凹端的雙鏈DNA。5′3′Co2+dNTP5′3′(A、G、C、T)nnppi

5′3′Co2+dNTPnppi5′3′OHOH(A、G、C、T)n

用途：

（1）主要作用是在載體或目的基因3′

末端加上同源多聚尾巴，形成人工黏性末端，便于DNA重組。（2）DNA3′末端的同位素標記。

目的基因進入原核或真核細胞并高效復制和表達蛋白質，需要裝入載體才能實現。載體（vector）

指能攜帶外源DNA分子進入受體細胞進行擴增和表達的運載工具第三節重組DNA技術中常用載體

作為基因工程載體所需具備的基本條件能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點(外源DNA插入點)，常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA；拷貝數高具有較高的遺傳穩定性克隆載體(cloningvector)

為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體。表達載體(expressionvector)

為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體。

質粒載體：最常用的對目的基因克隆

噬菌體：主要用于構建基因組DNA或

cDNA文庫M13噬菌體：專用于Sanger雙脫氧DNA測序

粘粒：用于克隆大片段DNA

酵母質粒：用于在酵母中表達目的蛋白病毒：包括人或哺乳動物病毒、昆蟲及植物毒，用于在真核細胞中表達目的蛋白

基因工程載體的種類和用途1.質粒(plasmid)載體

細菌培養質粒擴增并表達蛋白質大腸桿菌染色質質粒

細菌染色質以外的雙鏈環狀DNA，能自我復制和表達其攜帶的遺傳信息。

AmprORITetrpBR322質粒：一種克隆質粒ORI：復制起始點，保證高拷貝自我復制。結構與功能：Ampr,

Tetr：兩個抗性基因用于篩選陽性克隆。PstI,BamHI：兩個單酶切位點用于插入目的基因分子量較小拷貝數較高pUC18/pUC19pUC192686bpAmprLacZP(BLA)PlacOriAvaI(413)BamHI(418)EcoRI(397)HindIII(448)PstI(440)SmaI(415)XmaI(413)ApaLI(178)ApaLI(1121)ApaLI(2367)MCSMCS：MultipleClonningSite提供多個單酶切位點用于克隆操作LacZ:藍白斑篩選陽性克隆第四節目的基因的獲得和體外重組

一、目的基因的獲得

----分二、目的基因的體外重組

----切、接目的基因

(targetDNA)cDNA(complementaryDNA)基因組DNA(genomicDNA)目的:

分離獲得某一感興趣的基因或DNA序列

獲得感興趣基因的表達產物（蛋白質）種類：（一）化學合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產物的氨基酸序列（二）聚合酶鏈反應

(polymerasechainreaction,PCR)（三）從基因文庫中篩選（一）目的基因的獲取—分*化學合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列組織或細胞染色體DNA基因片段克隆載體重組DNA分子含重組分子的轉化菌限制性內切酶受體菌基因組DNA文庫存在于轉化細胞內由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合*從基因組DNA文庫獲取目的基因mRNA

cDNA

雙鏈cDNA

重組DNA分子

cDNA文庫

反轉錄酶

載體

受體菌

復制*從cDNA文庫獲取目的基因

反轉錄酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶DNA聚合酶Ⅰ堿水解

TTTT

基因組文庫：G-文庫cDNA文庫：c-文庫

(常用)方法：基因文庫

用目的基因上的一段DNA做成探針與文庫中的DNA作核酸雜交，從基因文庫中“釣出”有目的基因的克隆。（三）外源基因與載體的連接—接1.黏性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接

(2)不同限制酶切位點連接

配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構建BamHⅠ切割反應

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體目的基因自連載體自連同一限制酶切位點連接不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。2.平末端連接適用于：限制性內切酶切割產生的粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內切酶限制性內切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連3.人工接頭(linker)連接由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產生黏性末端，而進行粘端連接。

人工接頭及其應用CCGAATTCGGGCTTAAGC5′-3′-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目錄4.同聚物加尾連接在末端轉移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出黏性末端，再進行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT

5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉移酶+dATP末端轉移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA