第四章基因工程載體

VesctorsforGeneticEngineering作為一個理想的載體，應具備以下條件：

載體：這種能與目的基因結合，且有完整的復制和轉錄功能的DNA大分子稱之為載體（vector）。

（1）能夠在宿主細胞中存在并繁殖，有功能良好的復制子和啟動子，使插入基因復制和表達；（2）具有多個限制性內切酶的切點，且切點是單一的，這樣可將多個外源DNA片段插入其中；（3）具有容易檢測的篩選標記；（4）載體DNA的分子量適當，可容納較大的外源DNA片段，又可在受體細胞內擴增較多的拷貝；（5）在細胞內穩定性高，這樣可以使重組體可以穩定傳代而不易丟失。

第一節微生物基因工程載體

克隆載體（cloningvector）：主要是對目的基因克隆，建立DNA文庫和cDNA文庫，其上有復制子即可；表達載體（expressionvector）：能使目的基因在宿主細胞中表達的一類載體。這類載體既有復制子，更要有強啟動子；穿梭載體（shuttlevector）：這類載體可以在原核細胞中復制，也可在真核細胞中擴增和表達。一、質粒載體

細菌質粒(plasmid)載體是基因工程中最常用的載體,它必須包括三種組成部分：復制必須區，選擇標記基因和限制性核酸內切酶的酶切位點（克隆位點，MCS).

質粒DNA分子具有三種構型：

ClosedcircleDNA,ccDNA;supercoil;SC構型

OpencircleDNA,OC構型;LinerDNA,IDNA;L構型.1.嚴緊型和松馳型質粒嚴緊型質粒：在宿主細胞中的拷貝數較少，一般只有1～3個松馳型質粒：其拷貝數較多，一般20～60個，多的可達200～300個

2、轉移型和非轉移型質粒3.質粒的不相容性和不親和群

轉移型，結合型（conjugativeplasmid）是指一些質粒在不同的菌株中可以相互轉移。

非轉移型質粒(non-conjugativeplasmid)則只能在一種寄主中生存

質粒的不相容性：一般地，不同質粒不能共處在一個細胞中，這種特性稱質粒的不相容性，當它們處在一起時，便有生存競爭，結果一種質粒繁殖，另一種逐漸被排斥，數目變少。不親和群：彼此不相容的質粒組成一個不親合群。

（二）、質粒的命名1、人工組建的質粒人工組建的質粒的第一個字母是質粒英文名字（plasmid）的第一個字符p，用小寫。p后有2個字母是大寫，表示質粒的作者和實驗室名稱，再其后為質粒的編號。例：pXYp109；pSC101等天然載體質粒的第一個字母大寫，且質粒符號用括號括起來。如（C01E1）。農桿菌質粒用p加Ti（Tumerinducing）或At（Agrobacterium

tumefacions）表示，如pTiC58。2、天然載體質粒（三）、常用質粒載體

1.pSC101

圖2.pBR322

（1）組成它由三部分組成：來自pSCl01的四環素抗性基因Tetr來自ColEl的衍生物pMBl的松弛復制起點ori來自RSF2124的氨芐青霉素抗性基因Ampr。

（2）特點（3）重組克隆的

“插入失活”篩選方法

具有多個單一的限制性內切酶位點。Tetr中有BamH1切點（G↓GATCC）和SalⅠ切點（G↓AATTC），Ampr中有PstⅠ切點（CTGCA↓G）。

利用ColEl的復制子，所以在細胞中是多拷貝的，可通過氯霉素使質粒拷貝數進一步擴增。pBR322—→插入在Tetr中，基因型為Tets

、Ampr——→在含有氨卞青霉素培養基上可生長，在在含有四環素培養基上不生長；pBR322—→插入在Ampr中，基因型為Tetr

、Amps、——→在含有氨卞青霉素培養基上不生長，在在含有四環素培養基可不生長；而在兩種抗生素培養基上都生長的是非重組型。這種在一個基因位點中插入外源DNA片段，從而使該基因活性喪失的現象叫插入失活。

AmprTet

rTet

rAmpsPstI....

....涂布有Tet的培養基涂布有Amp的培養基......重組體的篩選外源基因的插入：.3、pUC系列質粒載體

（1）特點具有更小的分子量（2686bp）和更高的拷貝數。具有多克隆位點可用組化方法鑒別：可通過插入失活法進行篩選含有一個來自于大腸桿菌的經過加工的LacZ基因（LacZ′），它編碼β-半乳糖苷酶氨基端146個氨基酸，可以和β-半乳糖苷酶缺陷型的大腸桿菌實現基因內互補，即α—互補，恢復分解乳糖的能力。X-gal也是β-半乳糖苷酶的一種底物，經降解后可生成溴氯吲哚，使大腸桿菌菌落呈藍色。當無β-半乳糖苷酶時，X-gal不被分解，菌落呈白色。當外源基因插入到pUC質粒的LacZ′基因內部，則LacZ′基因受到破壞，便不能再和缺陷型受體菌中生成有活性的β-半乳糖苷酶，因此，菌落呈白色。反之，非重組體為藍色菌落。含Ampr抗性基因，可通過插入失活和顏色反應進行雙重篩選。lacZ’lacZ’N端C端缺陷型大腸桿菌完整的β-半乳糖苷酶（四）大腸桿菌中的表達載體表達載體應含有：（1）強啟動子（2）在啟動子下游區和ATG上游區有一個好的SD序列。（3）在外源基因插入序列下游區要有一個強的轉錄終止序列，保證外源基因有效轉錄和質粒的穩定性。二、噬菌體載體

（一）、λ噬菌體載體

1、λ噬菌體載體的特征

λ噬菌體顆粒中DNA為線狀雙鏈DNA分子，全長48502bp，兩端各有一段長度為12個核苷酸的互補單鏈（粘端），稱為cos位點。λ噬菌體有61個基因，其中有1/3的區域是其裂解性生長的非必需區，這一區段的缺失，或在此區段中插入外源DNA，并不影響噬菌體的增殖，這就是λ噬菌體可作為基因載體的依據。

GGGCGGCGACCTCCCGCCGCTGGATACG環化作用2、λ噬菌體的缺陷與改造

λ噬菌體的改造⑴基因組太大（49kb）；⑵酶切點太多，它有5個BamH1位點（G↓GATCC），6個BgⅠ位點（A↓GATCT），5個EcoRⅠ位點（G↓AATTC）。⑶

野生型只能接納一定長度的DNA。若相當于λ噬菌體的75-105%，那么只能接納49kb×5%=2.45kb的DNA。

⑴切去非必須區段，在切去的同時，加載目的基因（2.5kb或更大）；⑵去處太多的酶位點，每種酶只留1-2個切口；⑶

增加標記基因（remarkegene）。(4)

引入無義突變．λ噬菌體的缺陷：3.λ噬菌體的主要類型

（1）插入型載體

只有1～2種限制性核酸內切酶的單一切割位點

免疫功能失活大腸桿菌β-半乳糖苷酶失活

（2）替換型載體

在其中央部位有一個可以被外源插入的DNA分子取代的DNA片段的克隆載體

。這是由于構建此載體時，安排在中央可取代片段兩側的多克隆位點是反向重復序列，因此，當外源DNA插入時，一對克隆位點之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效提高了克隆外源DNA片段的能力。

（二）M13噬菌體載體

M13噬菌體屬絲狀噬菌體，其基因組為閉合環狀正鏈ssDNA，6407bp，其中90%的DNA都編碼蛋白質，有10個基因，有兩個較長的間隔區，是外源基因插入的部位。

M13噬菌體產生單雙鏈DNA的機制。1、以（+）鏈DNA為摸板，合成互補（－）鏈，該雙鏈稱復制型DNA（RFDNA）。2、RFDNA在宿主細胞內能快速增殖，可增加到每個細胞約200個拷貝。3、單鏈特異的DNA結合蛋白結合在（+）鏈上，從而阻斷了其互補鏈，即（－）鏈的合成，這樣，細胞就會不斷的合成（+）鏈DNA。4、游離出來的（+）鏈DNA先與基因V的編碼產物形成特異的DNA-蛋白質復合物，然后轉移到寄主細胞膜，同時基因V的蛋白質從（+）DNA鏈上脫落下來，余下的M13（+）鏈DNA則是從其感染的寄主細胞的細胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白包裝成病毒顆粒的。

++-+-+-+-+-+-單鏈結合蛋白RF型DNA復制約200copy+++++以-鏈DNA為模板合成+鏈DNA三、噬菌粒載體（科斯質粒cosmid

）1、構建由質粒和λ噬菌體的粘性末端構建而成的。借用cos-（粘性尾巴）作字頭，質粒的-mid作字尾，故稱Cosmid，也叫粘粒載體。

2、特點（1）有λ噬菌體的高效感染能力。⑵

有質粒的高效復制特性。⑶有更廣泛寄主。⑷有較大的容量。３．主要用途：用于DNA序列分析四、酵母菌載體

①含有E.coli質粒的復制起始序列，這樣在外源基因轉到酵母細胞前可先在大腸桿菌中擴增。②含有酵母的篩選標記，這樣當重組質粒轉入相應的酵母細胞后，可用來篩選重組體。③具有合適的供外源基因插入的限制酶切割位點。共同的特點：多數酵母中含有一種能獨立復制的環狀雙鏈DNA，稱為2μ質粒，長約6.3kb，有單一的復制起始點和一個自主復制功能區域（ARS片段）。

根據質粒的復制方式不同將它們分為：整合型、復制型、附加型和穩定型等類型。

整合型：含有酵母的篩選標記ura3，但不具有酵母的復制起始點該質粒DNA以單拷貝形式穩定遺傳，缺點是轉化率較低（1～10轉化子/μgDNA）

復制型：是酵母DNA片段插入到大腸桿菌質粒中構成的，插入片段含有酵母的篩選標記ura3和2uDNA片段，一般以低拷貝數維持在酵母染色體之外。復制型載體對酶母的轉化率極高（102～103轉化子/μgDNA），但是轉化子不穩定，容易丟失。

附加型：是在pBR322中插入酵母篩選標記和2uDNA的ARS序列構建成的。這種質粒以附加體的形式存在于真核細胞中。附加型型載體對酵母具有很高的轉化活性（102～103轉化子/μgDNA），且與復制型相比，穩定性高，拷貝數也較高（25～100分子/細胞）。

穩定型：在附加型載體中再插入酵母著絲粒的一個DNA片段（CEN）。

第二節

植物基因工程載體

一、根癌農桿菌及Ti質粒

（一）、根癌農桿菌與冠癭瘤

根癌農桿菌屬根瘤菌科農桿菌屬，通過傷口可感染雙子葉植物，并在創傷部位使組織惡性增生而形成植物腫瘤，叫冠癭瘤（crowngalltumor）。冠癭堿類植物激素章魚堿胭脂堿農桿堿（二）、Ti質粒及T-DNA的結構與功能

1、T-DNA區Ti質粒是農桿菌非染色體的環狀雙鏈DNA分子，分子量為90×106～150×106道爾頓，有16~240kb。致病菌株37℃培養治愈菌株（Ti質粒被消除）治愈菌株

與致病菌株接合致病菌株（重新獲得Ti質粒）胭脂堿型質粒T區大小約23kb，單一序列插入植物核DNA。章魚堿型左區(TL-DNA)：長約13kb，通常為單拷貝，有誘發和維持腫瘤的作用。右區(TR-DNA)：長約7kb，多拷貝的含有參與冠癭堿生物合成的蛋白酶的編碼基因。圖章魚堿pTiAch5和胭脂堿pTiC58質粒的遺傳圖共同區：T區有控制腫瘤形態和編碼冠癭堿合成酶基因，實際上shi基因與生長素合成有關。roi基因與細胞分裂素合成有關，Ocs是章魚堿合成酶基因，Agr是編碼農桿堿合成酶基因，章魚堿型與胭脂堿型的T區中上述基因分布不完全一致，但90％是相同的稱共同區。3個同源區段，含有6個基因位點，是冠癭瘤形成所必需的，統稱“致癌基因”(oncogene，onc)。

非同源序列則編碼冠癭堿合成酶，在胭脂堿型中叫Nos，章魚堿型酶叫Ocs。

共同區已知T-DNA的兩側是被一對保守的25bp的重復序列包圍著，而且在一系列不同的植物腫瘤DNA中發現，T-DNA的兩邊端點是位于這種同向重復序列的當中或附近，這種同向重復序列實際上就是T-DNA的邊緣區。右側邊緣區又叫RB序列，左側邊緣區又叫LB序列。2、毒性Vir

區，VirA、B、D和G為致瘤性，它們的突變型為非致病性。VirA、C、D編碼專一核酸內切酶蛋白，與VirB共同作用，與T-DNA遷移直接有關。VirC部分決定寄主范圍VirE與菌體感染過程有關Vir區大約35kb，包含6個互補群，A、B、C、D、E、G。

3、代謝區Tra，T-DNA轉移功能；Agr，農桿堿代謝；Inc，不同類型質粒代謝相容性；Occ和Noc，章魚堿和胭脂堿分解代謝。（三）農桿菌對寄主的侵染和T-DNA的轉移

1、侵染過程2、T-DNA的轉移（1）創傷植物細胞釋放出可激活Ti質粒Vir基因進行轉錄的蛋白因子；（2）VirA和VirD蛋白因子進一步激活其它的Vir基因進行表達；（3）先在Ti質粒右側邊緣區產生出頭一個單鏈缺口；（4）接著在Ti質粒左側邊緣區產生出另一個單鏈缺口，結果釋放出的單鏈T-DNA分子便定向地轉移到植物細胞，并隨機整合到寄主染色體基因組上；（5）Ti質粒中移走的單鏈T-DNA區，通過DNA復制得到修復。（四）Ti質粒作為植物基因工程的載體

1、可行性2、存在缺陷（1）轉化植物細胞很難形成完整植株。（2）質粒上分布著多個酶切位點，而不是單一切點，酶切后不易成環，給插入目的基因帶來困難。（3）Ti質粒只能在農桿菌中復制、繁殖而擴增，可農桿菌對Ti的轉化率太低，只有10—9～10—7左右。（1）將細菌轉座子Tn7插入胭脂堿合成酶基因（Nos）位置上，該Ti質粒仍能實現T-DNA轉移。

（2）用Cat與Nos和Ocs基因啟動子拼接后，重組進入Ti質粒，Ti質粒感染植物，植物細胞中檢測到了Cat基因的酶的存在。

（五）Ti質粒的改造

1、去除致瘤基因Onc

由于影響植株再生的直接原因是T-DNA中的Onc基因的致瘤作用，因此，切除其致瘤基因，使成為無毒的質粒，記為Onc—，這個過程叫“卸甲”、

“繳械”或“解除武裝”，構建的Onc—載體叫“卸甲載體”。例：pGV38502、共整合質粒

（1）首先構建中間載體，如將大腸桿菌pBR322質粒帶上一段與Ti質粒T區同源的一個片段，它在大腸桿菌和農桿菌中均能復制；（2）然后將目的基因插入該片段的適當位置，這樣使目的基因兩端帶上了與Ti質粒T-DNA同源的DNA序列；（3）然后再將該質粒通過轉化或接合引入含有Ti質粒的農桿菌中。（4）引入的衍生質粒和原細胞中Ti質粒具同源性，因而可產生無性配對重組，通過交換，可將目的基因轉到Ti質粒上，使之產生真正的具有外源基因的Ti質粒，稱共整合質粒。

3、雙元載體

“雙元載體”，也稱反式載體，是指由兩個分別含T-DNA和Vir相容性Ti質粒構成的雙質粒系統。

含有為T-DNA轉移所必須的Vir區的質粒，另一個則是含有T-DNA區段的寄主范圍廣泛的DNA轉移載體質粒，后一種質粒較小，可在大腸桿菌中復制，因而易操作，可用來插入外源基因。4、載體盒

所謂“載體盒”(Vectorcassette)是將植物的標志基因、多插入位點、細菌標志基因和質粒的復制啟動子位點等集于一身的質粒系統，象一個集裝箱似的集合在一起。

二、Ri質粒載體

三、CaMV(花椰菜花葉病毒)載體系統

Ri質粒其結構和功能與Ti十分相似。與Ti質粒相比的優點：可以構建完整的Onc+載體。花椰菜花葉病毒(caulimovirus，簡稱CaMV)實際上是一個病毒群，已知有12個種，每個種的寄主范圍都很窄，不感染豆類和單子葉植株，它的主要寄主是蕓苔屬。

CaMVDNA有兩個特別之點，一是在專一位點有不連續性，DNA鏈上有一處到三處不連續；另一點是在電鏡下觀察到DNA大部分有盤繞結構，看上去似超螺旋。1、互補載體系統

2、混合載體系統

缺陷性CaMV+輔助病毒分子

將CaMVDNA克隆到了Ti質粒上，通過農桿菌導入植物細胞，可產生典型的病毒感染癥狀。

3、CaMV35S啟動子融合基因載體系統

SalI

Kmr

SalISalITi質粒T-DNA區SalI

Kmr

SalI混合載體構建過程SalISalISalI四、脂質體(1iposomes)載體

（一）、脂質體結構與性質

脂質體是磷脂在水中形成的一種由脂雙分子層圍成的囊狀結構，這種結構是一種分子排列有序的近晶型液晶。脂質體的主要成分是磷脂，如磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺等。

圖（二）脂質體與細胞的相互作用

制備方法：有超聲波法、機械振蕩法、透析法、融合法以及逆向蒸發法等。

脂質體作為載體的機理與細菌球質體的作用是相似的，它能將DNA包埋在里邊，在PEG誘導下，通過細胞的吞噬或融合作用將內含物轉入受體細胞，最終與受體核DNA結合。脂質體與細胞的相互作用主要有以下幾種形式：

1.內吞作用2.融合作用3.交換作用

優點：使包裝在里邊的物質（質粒或DNA）能避開核酸酶的降解，對受體無毒性，易被吸收，運送率高，轉化率高。更重要的是脂質體制備比常用的質粒