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文檔簡介

堿性磷酸酶

的動力學分析酶促反應動力學：研究各種因素對酶促反應速率的影響，并加以定量的闡述。影響因素包括：酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。堿性磷酸酶

米氏常數的測定原理米氏常數是酶促反應動力學中的一個相當重要的常數，通過實驗，可理解并掌握利用實驗求出Km的方法。在酶促反應中，當反應體系的溫度、pH及酶濃度恒定時，底物濃度對反應速率的影響呈矩形雙曲線關系。米氏方程式：反應速率與底物濃度關系的數學方程式

。[S]：底物濃度V：不同[S]時的反應速率Vmax：最大反應速率(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常數(Michaelisconstant)

ＶVmax[S]

Km+[S]＝──VmaxV[S]KmVmax/2Km值等于酶促反應速率為最大反應速率一半時的底物濃度，單位是mol/L。酶底物復合物E+SE+PES(過渡態)

Vmax[S]Km+[S]V=（林－貝氏方程）+1/V=KmVmax

1/Vmax1/[S]兩邊同取倒數雙倒數作圖法-1/Km

1/Vmax1/[S]1/V本實驗以堿性磷酸酶（AKP）為材料，用磷酸苯二鈉為其底物。AKP催化磷酸苯二鈉水解產生游離酚和磷酸鹽。酚在堿性溶液中與4一氨基安替比林作用，經鐵氰化鉀氧化，可生成紅色的醌衍生物。根據紅色的深淺可測出酚的含量，進而算出相應的酶活性(V)。再根據Lineweaver—Burk法作圖，計算其Km值。操作

底物濃度對酶促反應速度的影響

1)取試管8支，按下表操作(應特別注意準確吸取底物溶液及酶液)：加入酶液立即計時，混勻后置37℃水浴準確保溫15min。2)保溫結束，各管立即加入堿性溶液1ml以終止反應。3)各管中分別加入4-氨基安替比林溶液1ml及0.5％鐵氰化鉀2ml，混勻，放置l0min，以第8管調零點，于510nm波長處比色，測定各管吸光度。酶促反應速度計算酶促反應速度以每15分鐘所產生酚的微克數(μg

／15min)來表示。根據酚標準曲線查出各管的酚含量，即各管在不同底物濃度下的反應速度。本實驗不制作酚標準曲線，而以1／[S]對1／A作圖，因各管吸光度與其酚含量成正比，故可用吸光度代表酶促反應速度。注意事項(1)底物濃度和酶濃度都對酶促反應速度產生巨大影響，故該實驗的成功與否，在很大程度上取決于各種試劑(特別是底物溶液和酶液)吸液量的準確性。(2)

加入酶液立即計時，混勻后置37℃水浴準確保溫15min。

實驗記錄堿性磷酸酶米氏常數的測定日期、室溫A

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0.000實驗報告

堿性磷酸酶米氏常數的測定日期室溫一、實驗目的二、實驗原理三、數據處理（一）繪制米氏方程式曲線（二）繪制雙倒數曲線四、實驗結果：AKP的Km=五、實驗討論（一）繪制米氏方程式曲線A

123456780.000Smmol/L234568160ＶVmax[S]

Km+[S]＝──AKP米氏方程式曲線圖A[S]（二）繪制雙倒數曲線1/A

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