高效液相色譜方法及應用液相色譜的發展史液相色譜的基本概念高效液相色譜的具體操作（Aglient1100）本實驗室應用HPLC的實驗總結歷史回顧1906年，俄國植物學家Tswett（茨維特）用碳酸鈣作為吸附劑，分離干燥葉子的石油醚萃取物，發現三種顏色六條色帶，他把這種色帶稱為“色譜”；屬于液固色譜。1940年，Martin和Synge提出了液液分配色譜；1941年提出了氣相色譜可能性；1949年，Macllean制作薄層色譜板1952年，Martin和Synge發展了氣相色譜，并獲得諾貝爾獎。60年代末，出現商業高效液相色譜（HPLC),但是由于泵、檢測器的發展滯后，使得HPLC在80年代以后才得以迅速發展。經典的LC色譜（柱色譜）經典LC特點：僅做為一種分離手段（1）柱內徑1~3cm，固定相粒徑>100μm且不均勻（2）常壓輸送流動相（3）柱效低（H↑，n↓）（4）分析周期長（5），僅靠肉眼觀測，且無法在線檢測HPLC的特點HPLC：分離和分析（1）柱內徑2~6mm，固定相粒徑<10μm（球形，勻漿裝柱）（2）高壓輸送流動相（3）柱效高（H↓，n↑）（4）分析時間大大縮短（5）靠儀器在線檢測HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測主要差別：分析對象的差別和流動相的差別1．分析對象

GC：能氣化、熱穩定性好、且沸點較低的樣品，高沸點、揮發性差、熱穩定性差、離子型及高聚物的樣品不可檢測占有機物的20%

HPLC：溶解后能制成溶液的樣品，不受樣品揮發性和熱穩定性的限制分子量大、難氣化、熱穩定性差及高分子和離子型樣品均可檢測用途廣泛，占有機物的80%2．流動相差別GC：流動相為惰性氣體組分與流動相無親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動相為液體流動相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對分離起很大作用流動相種類較多，選擇余地廣流動相極性和pH值的選擇也對分離起到重要作用選用不同比例的兩種或兩種以上液體作為流動相可以增大分離選擇性3．操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬小）三、高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質）2．高壓泵（輸液泵）3．進樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置第五節高效液相色譜儀（Aglient1100）1.真空脫氣機工作原理：使用半透膜管路，允許氣體分子通過，液體分子無法通過作用：(1)可以有效地降低噪音（2）保證保留時間具有更好的重現性2．泵

類型：恒壓泵：流量精度不穩恒流泵：常用自動進樣器1．進樣裝置1）隔膜進樣（高分子有機硅膠墊→進樣室）

GC系統壓力較小，可以

HPLC系統壓力太大，必須停泵進樣（早期）2）閥進樣：不必停泵，六通閥2.優點：1.在標準進樣范圍內（0.1~100μL),具有良好的重現性和精確度2.自動進樣針尖取樣位置可設為負值（－2.5mm）

4.柱溫箱作用：溶劑管路先在柱溫箱中預熱，然后才進入柱子，保證了溫度的穩定性。也意味著保留時間的重現性得以保證。3.色譜柱：直徑4~6mm,柱長10~30cm

柱效評價：色譜系統適應性試驗

R，n，fs（拖尾因子）柱再生：維護、保養、柱子的沖洗4．檢測器1）紫外檢測器：適于吸收紫外光的物質1.可見波長檢測器（VWD)特點：在某一時刻僅可得到某一波長下的吸光度值；將各個時刻所得到的吸光度值描點作圖，即可得到所需的色譜圖。（擁有一個VWD檢測器）2.二極管陳列檢測器（DAD）特點：可得到任一時刻各個波長下的吸光度值，即可以得到樣品在各個時刻的吸收光譜圖；同時DAD還具有峰純度檢測的功能，用于初步判斷所得色譜峰是否為純凈物的流出物。（擁有兩個DAD檢測器）3.色譜圖與光譜圖的區別：色譜圖是某一波長下各個不同時刻的吸光度值描點作圖；光譜圖是某一時刻各個波長下的吸光度值描點作圖。

3.熒光檢測器：只能分析自身發光的物質靈敏度高其他檢測器：折光指數檢測器（RID）、電導檢測器（ECD）近幾年出現的蒸發激光散射檢測器（ELSD）有望成為高效液相色譜全新的通用靈敏的質量檢測器.。四、HPLC的特點和應用

“三高”“一快”“一廣”高柱效——n=104片/米，柱效高（遠高于一般LC）高靈敏度高選擇性分析速度快應用范圍廣泛（可分析80%有機化合物）第四章建立高效液相色譜分析方法的一般步驟通常在確定被分析的樣品以后，要建立一種高效液相色譜分析方法必須解決以下問題：①根據被分析樣品的特性選擇適用于樣品分析的一種高效液相色譜分析方法。②選擇一根適用的色譜柱，確定柱的規格（柱內徑及柱長）和選用固定相（粒徑及孔徑）。③選擇適當的或優化的分離操作條件，確定流動相的組成、流速及洗脫方式。