第三章細胞生物學研究方法細胞形態結構的觀察方法

細胞組分的分析方法

細胞培養、細胞工程復習綱要第一節細胞形態結構的觀察方法

1.光學顯微鏡技術（lightmicroscopy）

2.電子顯微鏡技術(Electromicroscopy)

第二節細胞組分的分析方法

1.離心分離技術

2.細胞內核酸、蛋白質、酶、糖與脂類等的顯示方法

3.特異蛋白抗原的定位與定性

4.細胞內特異核酸的定位與定性

5.定量細胞化學分析技術第三節細胞培養、細胞工程細胞培養

細胞工程1.光學顯微鏡技術（lightmicroscopy)1.1普通復式光學顯微鏡技術1.2熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）1.3激光掃描共聚焦顯微鏡技術（LaserConfocalMicroscopy）1.4相差顯微鏡（phase-contrastmicroscope）1.5微分干涉差顯微鏡1.6倒置顯微鏡

倒置顯微鏡組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養的活細胞，具有相差物鏡。微分干涉顯微鏡(DIC)優點：能顯示結構的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點，折射率差別更大，故影像的立體感更強。

用途：DIC顯微鏡使細胞的結構，特別是一些較大的細胞器，如核、線粒體等，立體感特別強，適合于顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。微分干涉顯微鏡(DIC)計算機輔助的微分干涉顯微鏡可以得到很高的反差，其分辨率比普通光鏡提高了一個數量級，這不僅填充了普通光鏡與電鏡之間分辨率的間隙，也為高分辨率下研究活細胞提供了必要工具。2.電子顯微鏡技術

2.1透射電子顯微鏡的基本知識2.1.1電鏡與光鏡的比較2.1.2電鏡與光鏡光路圖比較2.1.3電子顯微鏡的基本構造

2.1.4主要電鏡制樣技術超薄切片技術負染色技術冰凍蝕刻技術2.2掃描電子顯微鏡（Scanningelectronmicroscope，SEM）

掃描電子顯微鏡作用：用來觀察標本的表面結構。工作原理：用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發出次級電子，次級電子由探測體收集，并被轉變為光信號，再經光電倍增管和放大器轉變為電信號來控制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。圖像為立體形象，反映了標本的表面結構。為了使標本表面發射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。

冰凍蝕刻技術冰凍蝕刻（freeze-etching）也稱冰凍斷裂（freeze-fracture）標本置于-100?C的干冰或-196?C的液氮中，進行冰凍,然后用冷刀驟然將標本斷開，升溫后，冰在真空條件下迅即升華，暴露出斷面結構，稱為蝕刻（etching）。蝕刻后，向斷面以45度角噴涂一層蒸汽鉑，再以90度角噴涂一層碳，加強反差和強度。然后用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。復膜顯示出了標本蝕刻面的形態，在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂面處的結構。負染色技術負染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品進行染色；吸去染料，樣品干燥后，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現負染效果，分辨力可達1.5nm左右超薄切片技術通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，以環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片厚20~50nm普通復式光學顯微鏡技術

分辨率是指區分開兩個質點間的最小距離N=介質折射率；α=鏡口角，λ=入射光波長熒光顯微鏡技術（FluorescenceMicroscopy）1.2.1原理：高壓汞燈，激發濾片，阻斷濾片

直接熒光標記技術

免疫熒光標記技術（間接標記）1.2.2應用

在光鏡水平用于蛋白質、核酸等生物大分子的定性定位：

如綠色熒光蛋白(GFP)的應用

綠色熒光蛋白GFP是一個分子量較小的蛋白，易與其他一些目的基因產物形成融合蛋白，且不影響目的基因產物的空間構象和功能。GFP與目的基因融合，將目的基因產物標記為綠色，可定量分析目的基因的表達水平，顯示其在細胞內的表達位置和量的變化，為探討該基因在細胞中的作用及其分子機制提供便利條件。

/view/957211.htm尼康E800熒光DIC顯微鏡熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、微絲紅色、核藍色）1.3激光掃描共聚焦顯微鏡技術

（LaserScanningConfocalMicroscopy）1.3.1原理:物鏡與聚光鏡聚焦于同一點上，排除焦平面以外光的干擾，增強 圖像反差和提高分辨率(1.4—1.7倍)，可重構樣品的三維結構。1.3.2應用：可以用于觀察細胞形態，也可以用于細胞內生化成分的定量分析、光密度統計以及細胞形態的測量。

激光掃描共聚焦顯微境

LCSM照片，藍色為細胞核，綠色為微管原理：將相位差轉換成振幅差，從而提高各種結構間的對比度。結構：環狀光瀾，相差物鏡用途：可用于觀察活細胞

相差顯微鏡電鏡與光鏡的比較

顯微鏡分辨本領光源透鏡真空成像原理LMTEM200nm100nm0.1nm可見光（400-700）紫外光（約200nm)電子束（0.01-0.9）玻璃透鏡玻璃透鏡電磁透鏡不要求真空不要求真空要求真空1.33x10-5～1.33x10-3Pa利用樣品對光的吸收形成明暗反差和顏色變化利用樣品對電子的散射和透射形成明暗反差電鏡與光鏡光路圖比較電子顯微鏡的基本構造2.3掃描電鏡原理與應用：電子“探針”掃描，激發樣品表面放出二次電子，探測器收集二次電子成象。CO2臨界點干燥法可以消除引起樣品變形的表面張力問題1.離心分離技術

1.1用途：于分離細胞器與生物大分子及其復合物1.2種類:

差速離心：在密度均一的介質中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器.

密度梯度離心：用一定的介質在離心管內形成一連續或不連續的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離，常用的介質為氯化銫，蔗糖和多聚蔗糖。2.細胞內核酸、蛋白質、

酶、糖與脂類等的顯示方法

原理：利用一些顯色劑與所檢測物質中一些 特殊基團特異性結合的特征，通過顯色劑在細胞中的定位及顏色的深淺來判斷某種物質在細胞中的分布和含量。

3.特異蛋白抗原的定位與定性

（免疫細胞化學）定義：根據免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結合，對抗原進行定位測定的技術。分為直接免疫熒光魚間接免疫熒光

。3.1免疫熒光技術： 快速、靈敏、有特異性，但其分辨率有限（圖）

3.2免疫電鏡技術：免疫鐵蛋白技術免疫酶標技術免疫膠體金技術

應用：通過對分泌蛋白的定位，可以確定某種蛋白的分泌動態；胞內酶的研究；膜蛋白的定位與骨架蛋白的定位等直接免疫熒光魚間接免疫熒光4.細胞內特異核酸的定位與定性

（原位分子雜交技術）用來檢測染色體上的特殊DNA序列。最初是使用帶放射性的DNA探針，通過放射自顯影來顯示位置。后來又發明了免疫探針法，將探針核苷酸的側鏈加以改造，探針雜交后，其側鏈可被帶有熒光標記的抗體所識別，從而顯示出位置。4.1光鏡水平的原位雜交技術

探針用同位素標記或熒光素標記

4.2電鏡水平的原位雜交技術

探針用生物素標記,檢測用與抗生物素抗體相連的膠體金標記顯示

免疫探針法人類染色體端粒DNA的熒光原位雜交照片5.定量細胞化學分析技術5.1

細胞顯微分光光度術（Microspectrophotometry）利用細胞內某些物質對特異光譜的吸收，測定這些物質 （如核酸與蛋白質等）在細胞內的含量。5.2流式細胞儀（FlowCytometry）：流式細胞術是對單個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。用于定量測定細胞中的DNA、RNA或某一特異蛋白的含量；測定細胞群體中不同時相細胞的數量；從細胞群體中分離某些特異染色的細胞；分離DNA含量不同的中期染色體。

1.細胞培養

活細胞離體后要在一定的生理條件下才能存活和進行生理活動，特別是高等動植物細胞要求的生存條件極其嚴格，稍有不適就要死亡。所以細胞培養技術（cellculture）就是選用最佳生存條件對活細胞進行培養和研究的技術。動物細胞的生存環境與植物細胞差別很大，因而二者的培養方法很不相同。1.1動物細胞培養1.2植物細胞培養1.3非細胞體系（cell-freesystem）1.2植物細胞培養1.2.1組織培養：誘發產生愈傷組織，如果條件適宜，可培養出再生植株。用于研究植物的生長發育、分化和遺傳變異；進行無性繁殖；制取代謝產物。1.2.2懸浮細胞培養：在愈傷組織培養技術基礎上發展起來的一種培養技術。適合于進行產業化大規模細胞培養，制取植物代謝產物。1.2.3原生質體培養：脫壁后的植物細胞稱為原生質體（protoplast），其特點是：①比較容易攝取外來的遺傳物質，如DNA；②便于進行細胞融合，形成雜交細胞；③與完整細胞一樣具有全能性，仍可產生細胞壁，經誘導分化成完整植株：1.2.4單倍體培養：通過花藥或花粉培養可獲得單倍體植株，經人為加倍后可得到完全純合的個體。植物細胞培養1.1動物細胞培養（一）培養方式大致可分為兩種：1.1.1群體培養（massculture），將含有一定數量細胞的懸液置于培養瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層；1.1.2克隆培養（clonalculture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經過生長增殖每一個細胞形成一個細胞集落，稱為克隆（clone）。1.1動物細胞培養（二）

原代培養（primaryculture）：從動物機體取出的進行培養的細胞群。原代培養的細胞生長比較緩慢，而且繁殖一定的代數后（一般10代以內）停止生長，需要重新更換培養基。將細胞從一個培養瓶轉移到另外一個培養瓶即稱為傳代或傳代培養（Passage）。

細胞株（cellstrain）：從原代培養細胞群中篩選出的具有特定性質或標志的細胞群，能夠繁殖50代左右，在培養過程中其特征始終保持。細胞系（cellline）：從腫瘤組織培養建立的細胞群或培養過程中發生突變或轉化的細胞，在培養條件下可無限繁殖克隆（clone）：亦稱無性繁殖系或簡稱無性系。對細胞來說，克隆是指由同一個祖先細胞通過有絲分裂產生的遺傳性狀一致的細胞群。群體培養（左）和克隆培養（右）2.細胞工程即細胞水平的生物工程,使用的主要技術有細胞培養、定向誘導分化、細胞融合和顯微注射等。2.1細胞融合（cellfusion）技術2.2單克隆抗體（monocloneantibody）技術2.3顯微操作技術

細胞融合通過培養和誘導，兩個或多個細胞合并成一個雙核或多核細胞的過程稱為細胞融合（cellfusion）或細胞雜交（cellhybridization）。基因型相同的細胞融合成的雜交細胞稱為同核體，來自不同基因型的雜交細胞則稱為異核體。誘導細胞融合的方法有三種：生物方法（病毒）、化學方法（聚乙二醇PEG）、物理方法（電激和激光）。某些病毒如：仙臺病毒、副流感病毒和新城雞瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusionprotein），可介導病毒同宿主細胞融合，也可介導細胞與細胞的融合，因此可以用紫外線滅活的此類病毒誘導細胞融合。化學和物理方法可造成膜脂分子排列的改變，去掉作用因素之后，質膜恢復原有的有序結構，在恢復過程中便可誘導相接觸的細胞發生融合。LightPathwayofMicroscopeDAPI染色顯示的前中期染色體明視場與相差的觀察效果比較DIC顯微鏡下的硅藻冰凍蝕刻電鏡照片