CRISPR/Cas9:生物體和細胞基因組編輯的革命性技術YSYBiotech2014年4月10日敲降（knockdown）過表達（overexpression)RNA干擾（RNAi）MO敲降（mophorlinoKD）功能缺失（過少）（lossoffunction)功能獲得（過多）（gainoffunction)全身性過表達(ubiquitoustransgenic)

組織特異性過表達(tissuespecifictransgenic)基因位點特異性過表達（knockin）全身性敲除（conventionalKO）條件性敲除

（conditionalKO）敲除（knockout）基因功能的研究敲降（RNAi）2002年Science十大科學進展之首基因敲除(GeneKnockout)

基因敲除

:將生物體（或細胞）中的基因改變成無功能性基因（無效等位基因：nullallele）的一種遺傳學技術【Ageneknockout(KO)isagenetictechniqueinwhichoneofanorganism‘sgenesismadeinoperative.

/wiki/Gene_knockout

】研究基因功能的金標準定向的基因敲除（TargetedDisruptionofAGene)基因敲除突變體（廣義上）的獲得：1、隨機突變（如ENU飽和突變等）需要通過位置克隆（positionalcloning）確定突變基因；費時費力。2、定向的基因敲除精確傳統上定向的基因敲除是通過基因打靶（genetargeting）技術實現的基因打靶(GeneTargeting)基因打靶是利用同源重組原理改變細胞或生物體內源性基因的遺傳學技術【Genetargetingisagenetictechniquethatuseshomologousrecombinationtochangeanendogenousgene.

/wiki/Gene_targeting】特點（基因修飾精確、遺傳背景清晰干凈）：1、刪除基因2、去除外顯子3、定點插入一個基因（Knockin）4、引入點突變5、就制作刪除基因或外顯子而言，可實現永久性(conventional,

全身性)或條件性（conditional,

組織或時空）特異性的基因敲除起始，以酵母為模式生物，建立了一套外源基因插入、修飾、標記、同源重組轉化子篩選系統的建立、載體同源序列DNA（靶標）雙鏈斷裂提高同源重組效率的利用

20世紀80年代/wiki/File:GeneTargeting.png正負篩選策略MarioRenatoCapecchi

MartinJohnEvans

OliverSmithies

1989年依賴于胚胎干細胞的傳統的基因打靶/info/targvectdesign.htmlNextpage百萬分之一的同源重組率；打靶載體含正負篩選標記。向酵母學習傳統的基因打靶（GeneTargeting）的技術瓶頸

1、需要胚胎干細胞只有小鼠上能建立胚胎干細胞大鼠的胚胎干細胞雖有報道，但沒有后續的工作2、極低的同源重組率干細胞同源重組發生率較高，但也只有百萬分之一

通過將基因敲除的個體或細胞與正常的個體或細胞相比較，研究者可以揭示特定基因的功能。基因敲除技術特點：在基因組水平上將目標基因修改成無效等位基因，遺傳背景干凈清晰，是研究基因功能的金標準。敲降（RNAi或MOKD）的缺點：1、僅部分抑制該基因的功能；2、在轉錄后（包括翻譯）水平上下調基因表達，不能遺傳3、非特異性強；脫靶效率高如何突破基于傳統的基因打靶（GeneTargeting）實現基因敲除（GeneKnockout）的技術瓶頸？向細胞學習！DNADamageandDNArepairDNAdamage,duetoenvironmentalfactorsandnormalmetabolicprocessesinsidethecell,occursatarateof1,000to1,000,000molecularlesionspercellperday

/wiki/DNA_repairDouble-strandBreaksandRepairDouble-strandbreaks(DSBs),inwhichbothstrandsinthedoublehelixaresevered,areparticularlyhazardoustothecellbecausetheycanleadtogenomerearrangements.ThreemechanismsexisttorepairDSBs:1)non-homologousendjoining(NHEJ)2)microhomology-mediatedendjoining(MMEJ),3)homologousrecombination(HR)Non-homologousendjoining(NHEJ)NHEJ(coinedin1996byMooreandHaber)isreferredtoas"non-homologous"becausethebreakendsaredirectlyligatedwithouttheneedforahomologoustemplate.Itisaerror-pronerepair.NHEJtypicallyutilizesshorthomologousDNAsequencescalledmicrohomologiestoguiderepair.Thesemicrohomologiesareoftenpresentinsingle-strandedoverhangsontheendsofDSB.Whentheoverhangsareperfectlycompatible,NHEJusuallyrepairsthebreakaccurately.Impreciserepairleadingtolossofnucleotidescanalsooccur,butismuchmorecommonwhentheoverhangsarenotcompatible.InappropriateNHEJcanleadtotranslocationsandtelomerefusion,hallmarksoftumorcells./wiki/Non-homologous_end_joiningHomologousrecombination(HR)

AtypeofgeneticrecombinationinwhichnucleotidesequencesareexchangedbetweentwosimilaroridenticalmoleculesofDNA.Occurringduringmeiosis.WidelyusedbycellstoaccuratelyrepairDSB.HRisalsousedinhorizontalgenetransfertoexchangegeneticmaterialbetweendifferentstrainsandspeciesofbacteriaandviruses.

/wiki/Homologous_recombinationTheNHEJandHROccurringnearbytheDSBsitesGenetargetingdependsonDSBsitesspontaneousoccurringintargetgenes.IncreasingDSBsitesdefinitelyimprovetheefficiencyofgenetargetingorgeneknockout.MethodstoCreateDSBnearbytheTargetGene

(Restrictionenzyme:anenzymethatcutsDNAatspecificrecognitionnucleotidesequencesknownasrestrictionsites.)制備一個人工的限制性內切酶Doyonetal,2008.Heritabletargetedgenedisruptioninzebrafishusingdesignedzinc-fingernucleases.NatBiotechnol.2008Jun;26(6):702-8.Epub2008May25.Mengetal,Targetedgeneinactivationinzebrafishusingengineeredzinc-fingernucleases.NatBiotechnol.2008Jun;26(6):695-701

GenomeEditingUsingZFNTechnologyWhatIsZFNTechnology?Zincfingernucleases(ZFNs)areaclassofengineeredDNA-bindingproteinsthatfacilitatetargetededitingofthegenomebycreatingdouble-strandbreaksinDNAatuser-specifiedlocations./life-science/functional-genomics-and-rnai/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/what-is-zfn.html劃時代的突破！Figure1:EachZincFingerNuclease(ZFN)consistsoftwofunctionaldomains:a.)ADNA-bindingdomaincomprisedofachainoftwo-fingermodules,eachrecognizingauniquehexamer(6bp)sequenceofDNA.Two-fingermodulesarestitchedtogethertoformaZincFingerProtein,eachwithspecificityof≥24bp.b.)ADNA-cleavingdomaincomprisedofthenucleasedomainofFokI.WhentheDNA-bindingandDNA-cleavingdomainsarefusedtogether,ahighly-specificpairof'genomicscissors'arecreated./life-science/functional-genomics-and-rnai/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/what-is-zfn.htmlZFNKnockoutAnimalCreationviaMicroinjection/life-science/functional-genomics-and-rnai/zinc-finger-nuclease-technology/learning-center/what-is-zfn.htmlZFN：zinc-fingernucleaseDoyonetal,2008.Heritabletargetedgenedisruptioninzebrafishusingdesignedzinc-fingernucleases.NATUREBIOTECHNOLOGYpublishedonline25May2008;doi:10.1038/nbt1409Componentsofyeast-basedchromosomalreportersystem:expressionvectorsfortheZFNs(top),targetgeneintegratedintothechromosomeattheHOlocus(middle).Afteradouble-strandbreak(DSB)isinducedatthetargetbyapairofZFNs,itisprocessedviasingle-strandannealing(SSA)torepairtheMEL1reportergene,theactivityofwhichcanberapidlyassayedinliquidculture.ZFN：zinc-fingernucleaseMengetal,2008.Targetedgeneinactivationinzebrafishusingengineeredzinc-fingernucleases.NATUREBIOTECHNOLOGYpublishedonline25May2008;doi:10.1038/nbt1398Figure1EngineeringZFNsthattargetkdrexon2usingabacterialone-hybridsystem.(a)Firstselectionstagetoidentifysinglezincfingerswithoptimizedbindingtoeach3-bpsubsitewithinarecognitionelement.(b)RecombinationofindividualzincfingersandsubsequentsecondselectionstageagainstfullZFPrecognitionelements.(c)SequencelogosareshownforthebindingspecificityofZFPsincorporatedintoZFNsforsubsequentanalysisinzebrafishembryos.(d)OverviewofapproachforZFN-targetedmutagenesisinzebrafishembryos.CuiX,JiD,FisherDA,WuY,BrinerDM,etal.(2010)Targetedintegrationinratandmouseembryoswithzinc-fingernucleases.NatBiotechnol29:64-67.ZFN-inducedtargetedintegration(HR)利用ZFN技術進行基因敲除和基因打靶的技術瓶頸1、構建ZFN很困難，需要進行復雜的分子重組2、獲得有活性的ZFN非常非常困難

研究人員通常還需要驗證以及幾十個不同的ZFNs，來證明其中一個有效。/?articles.view/articleNo/39239/title/A-CRISPR-Fore-Cas-t/

Dongetal.,2011.PLoSONE,6(12):e28897.我們的發明：斑馬魚胚胎作為篩選系統篩選有活性的ZFN專利申請號:CN201110052372

國際上首例養殖魚類基因敲除突變體GenomeEditingUsingTALENTechnologyTAL(transcriptionactivator-like)effectors(TALEs):proteinssecretedbyXanthomonasbacteria(gram-negativebacteria).Theseproteinscanbindpromotersequencesinthehostplantandactivatetheexpressionofplantgenesthataidbacterialinfection.TheyrecognizeplantDNAsequencesthroughacentralrepeatdomainconsistingofavariablenumberof~34aminoacidrepeats./wiki/TAL_effectorBochJ,BonasU(September2010)."XanthomonasAvrBs3Family-TypeIIIEffectors:DiscoveryandFunction".AnnualReviewofPhytopathology

48:419–36.向細菌學習！SCIENCEVOL32611DECEMBER2009NucleicAcidsResearch,2011,Vol.39,No.12UnitAssemblyBedellVM,WangY,CampbellJM,PoshustaTL,StarkerCG,etal.(2012)Nature491:114-118.TALEN-inducedtargetedintegration(HR)Dongetal.,2011.PLoSONE,6(12):e28897.我們的發明：斑馬魚胚胎作為篩選系統篩選有活性的ZFN專利申請號:CN201110052372

同樣適合于篩選鑒定TALEN的活性！TALEN技術靶向突變黃顙魚胚胎細胞基因組中的mstnbDongetal.,2014.Zebrafish利用TALEN技術進行基因敲除或基因打靶的技術瓶頸1、構建TALEN依然耗時、耗力2、獲得有活性的TALEN不容易

研究人員通常還需要驗證十幾個不同的TALENS來證明其中一個有效。

/?articles.view/articleNo/39239/title/A-CRISPR-Fore-Cas-t/

基因組工程學里程碑式的技術—CRISPR/Cas9Gajetal.,2013.TrendsinBiotechnology,09May2013偉大時代的到來一、癌癥免疫療法：癌癥治療的標靶是身體的免疫系統而不是直接針對腫瘤。二、CRISPR:

這種基因編輯技術是在細菌中被發現的，但研究人員現在將其作為一種外科手術刀而指向了個體基因。其普及性在今年出現飆升，因為有超過12個研究團隊用它來操控多個植物、動物及人類細胞的基因組。六、迷你器官:

在體外生長迷你人樣“類器官”上取得了顯著的進步。這些類器官包括肝芽、迷你腎及微型大腦。八、人類的克隆胚胎:

成功地從克隆的人類胚胎中得到了干細胞。【Science】2013年度十大科學突破2013年度的10大科學人物《自然》評選出了2013年度10大科學人物，張鋒（FengZhang，音譯）位列第一。DNA“編輯大師”張鋒CRISPR/Cas9基因組編輯技術CRISPR：(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)arelocicontainingmultipleshortdirectrepeatsthatarefoundinthegenomesofabout40%ofsequencedbacteriaand90%ofsequencedarchaea.IshinoY,ShinagawaH,MakinoK,AmemuraM,NakataA(1987)."Nucleotidesequenceoftheiapgene,responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninEscherichiacoli,andidentificationofthegeneproduct".JBacteriol169(12):5429–33.RepeatMojica,F.J.;Díez-Villase?or,C.;Soria,E.;Juez,G.(2000)."BiologicalsignificanceofafamilyofregularlyspacedrepeatsinthegenomesofArchaea,Bacteriaandmitochondria".Molecularmicrobiology36(1):244–246.doi:10.1046/j.1365-2958.2000.01838.x.SRSRJansen,R.;Embden,J.D.;Gaastra,W.;Schouls,L.M.(2002)."IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes".Molecularmicrobiology43(6):1565–1575.CRISPR

/wiki/CRISPR向古細菌學習！HorvathP,BarrangouR(January2010)."CRISPR/Cas,theimmunesystemofbacteriaandarchaea".Science327(5962):167–70.

ShortsegmentsofforeignDNA,calledspacers,areincorporatedintothegenomebetweenCRISPRrepeats,andserveasa'memory'ofpastexposures.CRISPRspacersarethenusedtorecognizeandsilenceexogenousgeneticelementsinamanneranalogoustoRNAiineukaryoticorganisms.CRISPRFunctionsasaProkaryoticImmuneSystem(acquiredimmunity)Milestonework:JinekM,ChylinskiK,FonfaraI,HauerM,DoudnaJA,CharpentierEAprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science.2012Aug17;337(6096):816-21.

/wiki/CRISPRCas9、tracrRNA和crRNA一起以某種方法攻擊和crRNA配對的外來DNA

李君等,2013.CRISPR/Cas系統：RNA靶向的基因組定向編輯新技術遺傳

35(11):1265―1273Cas9是一個核酸內切酶Cas9是由1409個aa組成（加上兩端的核定位信號，編碼序列全長4.5kb）含有2個核酸內切酶結構域：中間位置的HNH核酸內切酶結構域（H結構域，切割與crRNA互補的鏈）氨基端RuvC-like（R結構域，切割另外一條鏈）CRISPR/Cas9識別目標基因組DNA示意圖(改自Malietal.,2013.Science,339(6121):823-6.)Koo,2013-7-23,accessedon2013-11-9,/news/show/6268.htmlSchematicdiagramofCRISPR/Cas9systemCas9適用的應用研究：敲除應用于動植物及微生物基因組水平上的編碼基因的靶向基因敲除應用于動植物基因組水平上的非編碼基因如lncRNA（longnon-codingRNA）和microRNA的靶向基因敲除多基因同時敲除Cas9適用的應用研究：敲入應用于動植物及微生物基因組水平上的編碼基因的靶向基因敲入點突變、保守區域替換、或加入標簽編碼序列李君等,2013.CRISPR/Cas系統：RNA靶向的基因組定向編輯新技術遺傳

35(11):1265―1273Genome-scaleScreeningGenome-scaleCRISPR-Cas9knockoutscreeninginhumancells.ShalemO,SanjanaNE,HartenianE,ShiX,ScottDA,MikkelsenTS,HecklD,EbertBL,RootDE,DoenchJG,ZhangF.Science.2014Jan3;343(6166):84-7.doi:10.1126/science.1247005.Epub2013Dec12.GeneticscreensinhumancellsusingtheCRISPR-Cas9system.WangT,WeiJJ,SabatiniDM,LanderES.Science.2014Jan3;343(6166):80-4.doi:10.1126/science.1246981.Epub2013Dec12.Cas9適用的應用研究：其它領域雙突變的Cas9（dCas9）的C端加上VP16等具激活活性的功能結構域，則可以特異地激活目標基因的表達在雙突變的Cas9（dCas9）的C端加上EVE等抑制活性的功能結構域，則可以特異地抑制目標基因的表達（Cell.2013Jul18;154(2):442-51）。應用于動植物基因組水平上目標基因的甲基化、去甲基化等表觀修飾。Cas9實驗的常見問題：Off-tragetFedorov,Y.,etal."Off-targetingBysiRNACanInduceToxicPhenotype."RNAAccepted(2006).RNAiOff-target

Cas9實驗的常見問題：脫靶問題脫靶幾率計算：如果目標位點突變率為30%，另外潛在位點的突變率（脫靶率）1%，因為這兩個事件是獨立事件，因此在指定的細胞中，既發生目標位點基因敲除同時又發生脫靶的概率即為30%1%=0.3%，是非常低的。是可控的。在一般的以研究為目的的實驗中，脫靶并不是問題，只有用于治療才是個問題RNAi的敲降也一樣存在脫靶問題，只不過之前沒有重視過。。。。。Talen也存在，只是做的人更多偏向Cas9技術CRISPR/Cas9技術脫靶問題已獲解決17個堿基的設計GNNNNN。。NGG，比常規降低了5000倍，幾乎就不再脫靶。

17個再加上雙切口技術，脫靶幾乎檢測不到！SolvedOffTargetproblem：Cas9（D10A）介導的雙切口增強基因組編輯的特異性SolvedOffTargetproblem：使用17nt或18ntgRNA增強Cas9對基因組編輯的特異性最大限度地解決脫靶問題：17ntgRNA+

Cas9n介導的雙切口可最大程度地提高基因組編輯的特異性Ranetal.,2013Sep12;154(6):1380-9

比TALEN效率高Dongetal.,2011.PLoSONE,6(12):e28897.我們的發明：斑馬魚胚胎作為篩選系統篩選有活性的ZFN專利申請號:CN201110052372

同樣適合于篩選鑒定sgRNA的活性！斑馬魚1號染色體基因（約1400個基因）敲除計劃文章案例EffectivegenetargetinginrabbitsusingRNA-guidedCas9nucleasesdoi:10.1093/jmcb/mjt04150ng/ulCas9mRNAplus6ng/ulsgRNARNA-guidedendonucleasesHighlyefficientgeneknockoutinmiceandzebrafishwithRNA-guidedendonucleasesHyun-TaekKimpublishedonlineNovember19,2013GenomeResOne-StepGenerationofMiceCarryingMutationsinMultipleGenesbyCRISPR/Cas-MediatedGenomeEngineeringRudolfJaenischCell153,910–918,May9,2013GenerationofGene-ModifiedCynomolgusMonkeyviaCas9/RNA-MediatedGeneTargetinginOne-CellEmbryosCell156,1–8,February13,2014Cas9mRNA(20ng/ml)andsgRNAs(5ng/ml)Cas9細胞怎么做

確定待敲除基因的靶位點并設計識別靶位點的識別的一對DNAOligo（引物）2.構建可表達sgRNA的Cas9質粒3.含sgRNA表達元件的Cas9質粒的活性檢測4.利用Cas9質粒建立knock-out細胞系1，如何設計？以CFTR為例NCBI中找到對應的exon2構建可表達sgRNA的Cas9質粒

將合成的Oligos以逐步降溫的方法退火成雙鏈，然后與堯順禹生物提供的Cas9質粒進行連接，連接后轉化感受態的大腸桿菌，再進行涂板。電轉如293T、3T3等模式細胞或目的細胞脂轉熒光鑒定轉染效率Puro藥篩3-5天部分細胞抽提DNA、并PCR送測序通過測序套峰情況初步判斷活性效率PCR產物連接TA克隆，驗證準確效率3含sgRNA表達元件的Cas9質粒的活性檢測

YSYsgRNA活性檢測（專利）含識別位點的基因組片段（400-600bp）gRNA+Cas9mRNA斑馬魚受精卵發育24hpfYSY超微量試劑盒5個胚胎混合制備DNA模板通過測序套峰情況初步判斷活性效率PCR產物連接TA克隆，驗證準確效率套峰圖4.利用Cas9質粒建立knock-out細胞系

電轉如293T、3T3等模式細胞或目的細胞脂轉熒光鑒定轉染效率Puro藥篩3-5天部分細胞抽提DNA、并PCR送測序通過測序套峰情況初步判斷活性效率PCR產物連接TA克隆，驗證準確效率其余細胞消化成單細胞克隆，繼續培養并結合效率數據篩選獲得穩定敲除細胞系PCR檢測單克隆細胞，篩選非3的整數倍突變穩定建系成功Cas9動物模型怎么做體外轉錄成sgRNA（Cas9的mRNA單獨轉錄，戴帽或加尾）顯微注射到胚胎（斑馬魚、小鼠、大鼠、果蠅、熱帶爪蟾等）篩選F0代，內交或與WT雜交YSYsgRNA活性檢測（專利）構建sgRNA表達質粒F1代YSY-CRISPR/Cas9Kit將正反向兩個引物進行退火將退火產物與線性化的質粒連接轉化感受態細胞轉化子鑒定送2個經PCR驗證有陽性條帶的菌液去測序使用質粒提取試劑盒從經測序確認含正確重組質粒的菌液中提取質粒。細胞基因敲除載體（常規）細胞基因敲除載體（D10A）基因點突變細胞建系方式一：方式二：細胞敲入建系（長片段）動物模型基因敲除方式一：方式二：不同技術組合應用思路微陣列芯片、二代高通量測序微陣列芯片高通量測序RNA水平DNA水平RNA水平DNA水平轉錄組miRNAlncRNA外顯子捕獲SNPChIP全轉錄組測序物種重測序cGHDN