第五章分子生物學研究法（上）——DNA、RNA及蛋白質操作技術

從20世紀中葉開始，分子生物學研究得到高速發展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術的進步。 基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細胞轉化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點突變和PCR擴增等，是分子生物學研究的核心技術。基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質粒或其它載體分子，構成遺傳物質的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內并進行持續穩定的繁殖和表達。基因工程技術是核酸操作技術的一部分，只不過它強調了外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達。事實上，這種跨越物種屏障、把來自其它生物的基因置于新的寄主生物細胞之中的能力，是基因工程技術區別于其它技術的根本特征。5.1重組DNA技術回顧5.2DNA基本操作技術5.3RNA基本操作技術5.4SNP的理論與應用5.5基因克隆技術5.6蛋白質組與蛋白質組學技術5.1.1三大奠基成就：DNA的結構及復制；5.1重組DNA技術發展史回顧DNA是遺傳物質；DNA的遺傳和表達規律——中心法則。40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質，解決了遺傳的物質基礎問題；BacterialStrainInjectionResultsLivingScellsLivingRcellsHeatkilledScellsHeatkilledScellsmixedwithlivingRcellsLivingScellsinbloodsamplefromdeadmousecapsule1928FrederickGriffith&1944OswaldAveryTransformationofStreptococcuspneumoniae

1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細菌實驗50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題；X-raysourceCrystallizedDNARosalindFranklinMauriceWilkinsPhotographicfilm1953-Franklin&WilkinsDescriptionofthe3-DstructureofDNAFrancisCrick&JamesWatsonConservativeModelSemiconservativeModelFrankStahlMattMeselsonParentcellFirstreplicationSecondreplication1958-MatthewMeselson&FranklinStahlprovedthatDNAreplicationinbacteriafollowsthesemiconservativepathway50年代末至60年代，相繼提出了"中心法則"和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達。JacobandMonodDNA提取技術：如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術，科學家就無法對這類物質進行直接的生化分析。5.1.2DNA操作技術DNA的體外切割和連接1962年Arber發現限制性核酸內切酶，1967Gellert發現了DNA連接酶DNAligasecovalentlylinkstwoDNAstrandsRestrictionenzymeRestrictionenzymeLigaseLigase3’5’3’5’HerbertBoyer,PaulBerg(美國斯坦福大學

)于1972年獲得第一個重組DNA分子H.BoyerP.BergSV40DNARecombinantDNA

僅僅能在體外利用限制性核酸內切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組遠不能滿足基因研究的需要。

DNA片段在體外不具備自我復制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上（載體上），并轉入寄主細胞中進行繁殖。這就是基因克隆，或分子克隆。基因克隆技術

分子克隆的載體具備自主復制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌體和質粒等小分子量復制子都可以作為基因導入的載體。大腸桿菌成為分子克隆中最常用的轉化受體。1970年Mandel和Higa發現，大腸桿菌細胞經適量CaCl2處理后，能有效地吸收λ噬菌體DNA。1972年，Cohen等人又報道，經CaCl2處理的大腸桿菌細胞同樣能夠攝取質粒DNA。1973-Boyer,Cohen&ChangTransformE.coliwithrecombinantplasmidStanleyCohen&AnnieChanHerbertBoyerKanamycinresistancegenePlasmidpSC101TetracyclineresistancegeneE.colitransformedwithrecombinantplasmidTransformedcellsplatedontomediumwithkanamycinandtetracyclineOnlycellswithrecombinantplasmidsurvivetoproducecolonies非洲爪蟾表明：

（1）像pSC101這樣的質粒DNA分子可以作為基因克隆的載體，從而把外源DNA導入寄主細胞；（2）像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉移到原核細胞中并實現其功能表達；（3）質粒DNA-大腸桿菌細胞作為一種成功的基因克隆體系，在重組DNA或基因工程研究中發揮重要作用。重組DNA實驗中常見的主要工具酶酶

類功

能限制性核酸內切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶I（大腸桿菌）按5'到3'方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的5'-OH末端（進行末端標記實驗或用來進行DNA的連接末端轉移酶在雙鏈核酸的3'末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶III從DNA鏈的3'末端逐個切除單核苷酸λ噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5'末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5'或3'末端的磷酸基團

到目前為止，科學家已經幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續的片段，再利用凝膠電泳技術將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究。DNA的核苷酸序列分析技術DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學和生物化學的基礎上創立并發展起來的一門重要的DNA技術學，這門技術，對于從分子水平上研究基因的結構與功能的關系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值。5.1.3重組DNA技術歷史上的主要事件年份事

件

1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚精子中分離DNA。1944O.T.Avery證實DNA是遺傳物質。1952A.D.Hershey和M.Chase再次證實和噬菌體的遺傳物質是DNA。1953J.D.Watson和F.H.C.Crick提出DNA分子結構的雙螺旋模型。M.Wilkins用X-射線衍射法證實了這一結構。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發現了DNA聚合酶I。1958M.Meselson和F.W.Stahl提出了DNA的半保留復制模型。1959-1960S.Ochoa發現RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一相遺傳密碼；F.Jacob和J.Monod提出了調節基因表達的操縱子模型。1964

C.Yanofsky和S.Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關系。1965

S.W.Holley完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列測定；科學家證明細菌的抗藥性通常由"質粒"DNA所決定。1966

M.W.Nirenberg，S.Ochoa、H.G.Khorana、F.H.C.Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1970H.O.Smith，K.W.Wilcox和T.J.Kelley分離了第一種限制性核酸內切酶。H.M.Temin和D.Baltimore從RNA腫瘤病毒中發現反轉錄酶。1972-1973H.Boyer，P.Berg等人發展了DNA重組技術，于72年獲得第一個重組DNA分子，73年完成第一例細菌基因克隆。1975-1977F.Sanger與A.Maxam、W.Gilbert等人發明了DNA序列測定技術。1977年完成了全長5387bp的噬菌體φ174基因組測定。1978

首次在大腸桿菌中生產由人工合成基因表達的人腦激素和人胰島素。1980美國聯邦最高法院裁定微生物基因工程可以專利化。1981R.D.Palmiter和R.L.Brinster獲得轉基因小鼠；A.C.Spradling和G.M.Rubin得到轉基因果蠅。1982美、英批準使用第一例基因工程藥物--胰島素；Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測定。1983

獲得第一例轉基因植物。1984

斯坦福大學獲得關于重組DNA的專利。1986

GMO首次在環境中釋放。1988

J.D.Watson出任"人類基因組計劃"首席科學家。1989DuPont公司獲得轉腫瘤基因小鼠--"Oncomouse"。1992

歐共體35個實驗室聯合完成酵母第三染色體全序列測定。1994第一批基因工程西紅柿在美國上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測定。1997英國愛丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個高等植物擬南芥的全序列測定。2001完成第一個人類基因組全序列測定。2004中國科學家完成家蠶基因組全序列測定。2005中、美、日科學家聯合完黑猩猩基因組全序列測定。5.1.4基因克隆技術及其相關概念酶簡介載體簡介細菌轉化及篩選鑒定重組子基因克隆舉例限制性核酸內切酶GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease,RE)一類能識別和切割雙鏈DNA分子中特定堿基順序的核酸水解酶分類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術中常用Ⅱ型）第一個字母取自產生該酶的細菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細菌的種名，用小寫；斜體第四個字母代表菌株；羅馬數字表示發現的先后次序。命名HindⅢ

屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——

回文結構(palindrome)即反相重復結構，是

DNA分子中以某一處為軸，其兩側核苷酸排列呈回文對稱的序列。切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口DNA連接酶:通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片斷連接成一個整體DNA分子。T4ˉDNA連接酶E.coli-DNA連接酶T7ˉDNA連接酶目的基因的來源原核細胞真核細胞：cDNA或gDNA文庫人工合成及PCR擴增目的基因

天然DNA（染色體DNA、病毒DNA(噬菌體DNA)、質粒DNA、線粒體DNA和葉綠體DNA）重組實驗中的主要載體定義：為攜帶目的基因，實現其無性繁殖或表達蛋白質所采用的一些DNA分子。克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設計的載體稱為克隆載體。表達載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉錄翻譯成多肽鏈而特意設計的載體稱為表達載體。載體的選擇標準能自主復制；具有兩個以上的遺傳標記物，便于重組體的篩選和鑒定；有多克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點；分子量小，以容納較大的外源DNA。噬菌體載體：雙鏈DNA病毒，約50kb,兩端有一個12個核苷酸5′端突出粘性末端λ噬菌體λ噬菌體載體的特點：1、克隆的DNA有大小限制。2、和外源DNA連接后，都要經過體外包裝過程，把重組的DNA包進頭部，和尾部裝配成有感染性的噬菌體。3、如果沒有外源DNA插入，載體本身的DNA太小是不能被包裝的，這樣可確保轉化后產生的空斑是重組體。4、重組的λDNA由于利用噬菌體把它注入細胞中，因此和重組質粒DNA轉化相比，具有高得多的轉化率。Cos質粒載體：又叫粘粒載體（cosmid），是帶有cos位點的質粒，是由λ噬菌體的粘性末端和質粒構建而成。柯斯質粒載體含有來自質粒的一個復制起點、抗藥性標記、一個或多個限制酶單一位點，以及來自λ噬菌體粘性末端的DNA片段，即cos位點，其對于將DNA包裝成λ噬菌體粒子是必需的。結構圖cos質粒的結構柯斯質粒載體的優點：①具有噬菌體的高效感染力，而在進入宿主細胞后不形成子代噬菌體僅以質粒形式存在；②具有質粒DNA的復制方式，重組DNA注入宿主細胞后，兩個cos位點連接形成環狀DNA分子，如同質粒一樣進行復制；③具有克隆大片段外源DNA的能力，柯斯質粒本身一般只有5~7kb左右，而它可克隆外源DNA片段的極度限值竟高達45kb，遠遠超過質粒載體及λ噬菌體載體的克隆能力。這是其最大優點。黏粒、YAC、BAC：高容量載體單個克隆載體所容納的外原DNA片段的大小質粒：10kbλ噬菌體：23kb黏粒：45kbBAC：350kbYAC：1000kb

以質粒為載體的DNA

克隆過程??細菌轉化細菌轉化（transformation）

：p163感受態細胞（Competentcells）

：受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl2等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生變化，能容許有外源DNA的載體分子通過，處于這種狀態下的細胞稱~將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀供體受體轉導？轉染？受體細胞的特點：限制缺陷型:避免修飾和降解重組缺陷型：避免重組整合轉化親和型：較高的可轉化性遺傳互補型：利于篩選感染缺陷型：防止感染常用的轉化方法：化學轉化（CaCl2）法電擊法PEG介導轉化人工體外包裝

化學轉化原理：

在0℃冷凍處理時，處于CaCl2低滲溶液中的大腸桿菌細胞膨脹成球形。DNA可吸附于其表面。在短暫的熱沖擊下，細胞吸收外源DNA，然后在豐富培養基內復原并增殖，表達外源基因。電擊轉化：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導入受體細胞。菌液：生長對數期場強(最大轉化效率)：12.5-15kV/cm

溫度：0-4℃

基因重組轉染體外包裝噬菌體噬菌體體外包裝3）轉化率：轉化細胞/細胞總數影響因素：

載體：載體性質、空間結構、分子大小等受體細胞轉化過程克隆的篩選：抗生素基因。常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環素、鏈霉素等-互補藍白斑篩選電泳檢測法營養條件（自養、異養）1）抗藥性標志的選擇pBR322AmpTet插入片段Amp平板Tet平板-互補篩選質粒:β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的調控序列和氨基端（N端）146個氨基酸編碼序列宿主細胞:編碼β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列添加IPTG/X-gal的培養基上篩選藍白斑藍白斑篩選LacZ,IPTG

X-galX+gal

（白色）（藍色）

LacZ（失活）,IPTG

X-galX-gal

（白色）（白色）

藍白斑

電泳檢測法凝膠電泳檢測加樣孔DNAMarker空質粒重組質粒

重組質粒酶切重組質粒的PCR擴增片段例1.Generalprocessofgeneengineering1.從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段。2.將帶有目的基因的外源DNA片段和載體分別進行酶切。4.將重組DNA分子轉移到適當的受體細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖。5.從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經得到擴增的目的基因。3.將酶切片段與具有選擇記號的載體連接，形成重組DNA分子。人體生長激素釋放激素(SS)抑制和調節多種激素的作用從動物腦中提取:5mg50萬只羊腦基因工程9升大腸桿菌培養液例2大腸桿菌SS蛋白重組體+SS基因大腸桿菌SS蛋白重組體+SS基因目的基因基因載體5.1重組DNA技術回顧5.2DNA基本操作技術5.3RNA基本操作技術5.4SNP的理論與應用5.5基因克隆技術5.6蛋白質組與蛋白質組學技術5.2

DNA基本操作技術

5.2.1

核酸的凝膠電泳

自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經發展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現在通用的許多分子生物學研究方法，如：

DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術基礎，受到科學界的高度重視。

一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當的電極。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數成正比。就是說，電場強度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。由于在電泳中往往使用無反應活性的穩定的支持介質，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故電泳的遷移率與分子的摩擦系數成反比。已知摩擦系數是分子大小、極性及介質粘度的函數，因此，根據分子大小的不同、構型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來。基本原理

在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場當中，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構型。大分子量的DNA移動的慢小分子量的DNA移動的快電泳緩沖液陽極陰極DNA加樣孔DNAMarker及其作用瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間凝膠類型及濃度分離DNA片段的大小范圍（bp）0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1

凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關，凝膠濃度的高低影響凝膠介質孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。在凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（ethidiumbromide，簡稱EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05μg的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來。在紫外線的照射下結合溴化乙錠的DNA分子發出熒光稱樣溶解加熱制板倒膠電泳操作基本程序取樣點樣電泳檢測結果5.2.3

聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法。

PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復復制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他發表了第一個單純且短暫性基因復制（類似PCR前兩個周期反應）的實驗。而現今所發展出來的PCR則于1983年由Dr.KaryB.Mullis提出，并于1985年與Saiki等人正式發表了第一篇相關的論文。此后，PCR技術在生物科學研究和應用中得以廣泛應用，成為分子生物學研究的最重要技術。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。1.變性（90℃-96℃）

在加熱或堿性條件下可使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA，稱之為變性。2.退火（25℃-65℃）

是模板與引物的復性。引物是與模板某區序列互補的一小段DNA片段。3.延伸（70℃-75℃）

從結合在特定DNA模板上的引物為出發點，將四種脫氧核苷酸以堿基配對形式按5’→3’的方向沿著模板順序合成新的DNA鏈。標準的PCR過程分為三步：PCR反應體系引物dNTPMg2+Taq聚合酶模板反應緩沖液引物設計的基本原則：1.引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-27bp，但不應大于38bp，因為過長會導致其退火溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應。2.引物序列3’端出現3個以上的連續堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發機率增加。3.引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，兩條引物3’端若互補，或者單條引物自身形成發夾結構也可能導致PCR反應失敗。4.5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。可在引物設計時加上限制酶位點、核糖體結合位點、起始密碼子、缺失或插入突變位點以及標記生物素、熒光素、地高辛等.通常應在5‘端限制酶位點外再加1-2個保護堿基。5.引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發反應，因為GC含量決定了DNA雙鏈的解鏈溫度（Tm）。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。6.一般PCR反應中的引物終濃度為0.2-1.0μmol/L。引物過多會產生錯誤引導或產生引物二聚體,過低則降低產量。用NaOH將pH調至7.0。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分裝,-20℃貯存。一般反應中每種dNTP的終濃度為20-200μmol/L。理論上4種dNTP各20μmol/L,足以在100μl反應中合成2.6μg的DNA。當dNTP終濃度大于50mmol/L時可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4種dNTP的濃度應該相等,以減少合成中由于某種dNTP的不足出現的錯誤摻入。

dNTPPCR反應體系-Mg2+Mg2+濃度對TaqDNA聚合酶影響很大,它可影響酶的活性和真實性,Mg2+濃度過低，會顯著降低酶活性;Mg2+濃度過高又使酶催化非特異性擴增增強。Mg2+濃度還影響引物退火和解鏈溫度以及引物二聚體的形成等。通常Mg2+

濃度范圍為0.5-2mmol/L,1.5mM最佳。PCR反應體系-Taq聚合酶擴增效率最高,1000bp/min

活性

5’-3’DNA聚合酶活性強

無3’-5’DNA外切酶活性,錯配率每個循環約1/6000

3’末端加“A”,產物可直接進行“TA”克隆pfu酶——保真度高原理:具3’－5’核酸外切酶活性，即校正功能。

效率相對較低,500bp/min3’末端不加“A”，加A后才可進行TA克隆。就模板DNA而言,影響PCR的主要因素是模板的數量和純度。一般反應中的模板濃度為50-100ng/ml。模板量過多則可能增加非特異性產物。DNA中的雜質也會影響PCR的效率.PCR反應體系-模板DNAPCR反應體系—PCR反應緩沖液緩沖液一般含10-50mmol/LTris·Cl(20℃下pH8.3-8.8),50mmol/LKCl和適當濃度的Mg2+.另外，反應液可加入5mmol/L的二硫蘇糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA),它們可穩定酶活性。PCR反應參數:變性在第一輪循環前,在94℃下變性3-5min非常重要，它可使模板DNA完全解鏈。變性不完全，往往使PCR失敗，因為未變性完全的DNA雙鏈會很快復性，減少DNA產量。對于富含GC的序列，可適當提高變性溫度。但變性溫度過高或時間過長都會導致酶活性的損失。

PCR反應參數:退火引物退火的溫度和所需時間的長短取決于引物的堿基組成、引物的長度、引物與模板的配對程度以及引物的濃度。實際使用的退火溫度比擴增引物的Tm值約低5℃，時間一般為20-60s。PCR反應參數:延伸延伸反應通常為72℃，接近于TaqDNA聚合酶的最適反應溫度75℃。實際上，引物延伸在退火時即已開始，因為TaqDNA聚合酶的作用溫度范圍可從20℃-85℃。一般在擴增反應完成后，都需要一步較長時間(5-10min)的延伸反應。以獲得盡可能完整的產物，這對以后進行克隆或測序反應尤為重要。PCR反應參數:循環次數當其它參數確定之后，循環次數主要取決于DNA濃度。一般而言25-30輪循環已經足夠。循環次數過多，會使PCR產物中非特異性產物大量增加。如果此時產物量仍不夠，需要進一步擴增，可將擴增的DNA樣品稀釋103-105倍作為模板，重新加入各種反應底物進行擴增，這樣經60輪循環后，擴增水平可達109-1010

。PCR反應程序:溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（0.5min）60℃退火（0.5min）72℃延伸（1min）循環1循環2循環394℃預變性（5min）PCR技術在基因克隆方面的應用

（1）目的基因的直接克隆，（2）通過RT-PCR進行cDNA的克隆；（3）制備DNA探針，進行分子檢測等。5.2.4.實時定量PCR一般而言，熒光擴增曲線擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段,熒光信號指數擴增階段和平臺期。只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系，可以選擇在這個階段進行定量分析。實時熒光定量pcr技術中的一些重要因素：Ct值。每個反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數。Ct值與起始模板的關系，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小。可利用來計算出該樣品的起始拷貝數。實時熒光定量PCR中熒光化學，熒光定量pcr所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現將其原理簡述如下：TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。SYBR熒光染料：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。TaqMan熒光探針SYBR熒光染料在多細胞的高等生物個體水平上，人們用克隆（clone）表示由具有相同基因型的同一物種的兩個或數個個體組成的群體。從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotictwins）便是屬于同一克隆。在細胞水平上，克隆一詞是指由同一個祖細胞（progenitorcell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。在分子生物學上，人們把將外源DNA插入具有復制能力的載體DNA中，使之得以永久保存和復制這種過程稱為克隆。5.2.5基因克隆技術分子克隆的主要方法（1）構建cDNA、核DNA文庫，應用現有核酸探針分離新的目的基因；

（2）差式雜交(differentialscreen)和扣除雜交(subtractivehybridization)技術；

（3）DD-RT-PCR法及差別顯示技術；

（4）RACE技術（5）酵母雙雜交體系Two-hybridsystem；

（6）圖位克隆法（map-basedcloning）與染色體步移（genomicDNAWalking）。

1目的基因的獲取需要克隆的DNA片段：化學合成法

cDNA文庫基因組DNA文庫聚合酶鏈式反應1）化學合成法：較短的基因（60-80bp）用途：PCR引物測序引物定點突變核酸雜交探針2）基因文庫限制性內切酶……克隆、轉化、培養、鑒定基因組DNA基因文庫DNAlibrariesDNAlibrariesaresetsofDNAclones,eachofwhichhasbeenderivedfromtheinsertionofadifferentfragmentintoavectorfollowedbypropagationinthehost.AcloneisageneticallydistinctindividualorsetofidenticalindividualsGenomicDNAlibraries

CDNAlibrariesGenomiclibrariespreparedformrandomfragmentsofgenomicDNA,whichmaybeinefficienttofindagenebecauseofthehugeabundanceofthenon-codingDNA3）

基因組DNA文庫的構建從生物組織細胞提取出全部DNA將其切成預期大小的片段，分別與載體連接，轉入受體細菌或細胞，形成克隆。這樣每一個細胞接受了含有一個基因組DNA片段與載體連接的重組DNA分子，而且可以繁殖擴增，許多細胞一起組成一個含有基因組各DNA片段克隆的集合體，就稱為基因組DNA文庫。如果這個文庫足夠大，能包含該生物基因組DNA全部的序列，就是該生物完整的基因組文庫。基因組DNA文庫可用于分離特定的基因片斷、分析特定基因結構、研究基因表達調控、還可用于全基因組物理圖譜的構建和全基因組序列測定。基因組DNA文庫限制性內切酶基因組DNA基因與載體重組轉化細菌體外包裝基因組DNA文庫的構建過程5.1重組DNA技術回顧5.2DNA基本操作技術5.3RNA基本操作技術5.4SNP的理論與應用5.5基因克隆技術5.6蛋白質組與蛋白質組學技術5.3RNA基本操作技術5.3.1總RNA的提取RNA易遭降解，實驗要求較嚴格。總RNA提取的方法有多種，主要有LiCl法、CTAB法、異硫氰酸胍法（TriZol）。異硫氰酸胍法（TriZol）原理：TRIZOL試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層和有機層，這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質。5.3.2mRNA的純化mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規方法。利用mRNA的PolyA結構，試劑盒提供一種生物素化寡聚dT引物，與PolyA雜交，形成生物素化寡聚dT-mRNA的雜交體，然后利用生物素與抗生物素蛋白的結合作用以鏈抗生物素-順磁顆粒（SA-PMPs）結合雜交體，形成生物素化寡聚dT-mRNA-SA-PMPs復合物，再利用磁性吸附作用以磁性條吸附復合物中的SA-PMPs顆粒，最后利用高嚴緊度鹽溶液中分子雜交體磁性減弱，雜交體中生物素化寡聚dT引物與mRNA分離，從而純化得到mRNA。PolyATtractmRNA的分離純化過程簡圖5.3.3cDNA的合成cDNA的合成包括第一鏈和第二鏈cDNA的合成。第一鏈cDNA的合成是以mRNA為模板，反轉錄為cDNA，有反轉錄酶催化，該酶合成DNA時需要引物引導，常用引物是oligodT。第二鏈合成是以第一鏈為模板，由DNA聚合酶催化。mRNAss－cDNAds－cDNAds－cDNA反轉錄酶DNA聚合酶I或Klenow片斷反轉錄酶核酸酶S1cDNAlibrariesDNAcopies(cDNA)synthesizedfromthemRNAbyreversetranscriptionareinsertedintoavectortoformacDNAlibrary.Muchmoreefficientinidentifyingagene,butdonotcontainDNAcodingforfunctionalRNAornoncodingsequence.5.3.4cDNA文庫的構建cDNA文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部mRNA經反轉錄形成的cDNA片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典cDNA文庫構建的基本原理是用Oligo(dT)作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的cDNA加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。步驟：提取總RNA，在獲得高質量的mRNA后，反轉錄合成cDNA，合成接頭的加入、將雙鏈DNA克隆到載體中去、分析cDNA插入片斷，擴增cDNA文庫、對建立的cDNA文庫進行鑒定。這里強調的是對載體的選擇，常規用的是λ噬菌體，這是因為λDNA兩端具有由12個核苷酸的粘性末端，可用來構建柯斯質粒，這種質粒能容納大片段的外源DNA。RNA分離富集5.3.5基因文庫的篩選基因文庫的篩選是指通過某種特殊方法從基因文庫中鑒定出含有所需重組DNA分子的特定克隆的過程。篩選方法有很多種，常用的有：核酸雜交法PCR篩選法免疫篩選法

將帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應的同源區段就會退火形成雙鏈結構。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子。5.3.6核酸的分子雜交

不同溫度下DNA的構型變化一DNA/DNA的雜交作用，可以用來檢測特定生物有機體之間是否存在著親緣關系，而形成DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置。

不同溫度下DNA的構型變化二

在大多數核酸雜交反應中，經過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細管或電導作用被轉移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”上去的，因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交”。SouthernBlottingE.M.Southern于1975年首先設計出來的。材料：尼龍濾膜硝酸纖維素濾膜二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）步驟：第一，將分離的核酸樣品轉移到固體支持物濾膜上－核酸印跡轉移電泳凝膠核酸印跡法、斑點和狹線印跡法、菌落和噬菌斑印跡法第二，是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交雜交模式圖放射自顯影DNA印跡轉移探針雜交－＋SouthernBlotting的過程1.提取DNA，酶解；2.瓊脂糖凝膠上電泳分離；3.轉印（轉移）DNA4.固定膜上的DNA5.預雜交和雜交（放射性和熒光檢測）6.洗膜7.顯影檢測（放射性/酶促）Southernblot轉移裝置圖

在理想條件下，應用放射性同位素標記的特異性探針和放射自顯影技術，即便每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。由于放射性同位素對人體的危害，近年來又發展了熒光法檢測雜交信號的技術，雖然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實驗變得更為安全。常用的熒光染料：C5、C3等NorthernHybridizationIsolatemRNA(DifferentLengths)ProbewithlabeledDNA是將RNA分子從電泳凝膠轉移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法。類似于Southernblot,但用于檢測RNA的分子雜交技術，用于分析總RNA或mRNA1）RNA提取2）RNA電泳（分離不同長度RNA)3）轉膜(形成固相RNA)4）探針標記（同位素/非同位素）5）預雜交，雜交6）洗膜7）顯影（放射性/酶促）步驟YLNSESLSMKK9MPK1MPK3MPK618SrRNAMPK7Northern用途？基因文庫的篩選PCR篩選法免疫篩選法5.3.7RACE技術RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）是用于從已知cDNA片段擴增全長基因的方法，它根據已知序列設計基因片段內部特異引物，由該片段向外側進行PCR擴增得到目的序列。用于擴增5’端的方法稱為5’RACE，用于擴增3’端的稱為3’RACE。已知cDNA序列可來自序列表達標簽、減法cDNA庫、差法顯示和基因文庫篩選。基因特異引物：genespecificprimer,GSP

通用引物：universalprimer,UPM反轉錄：利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以連有寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉錄合成標準第一鏈cDNA。3’RACE-PCROligo(dT)30MNUPM區非配對區PCR：用基因特異引物GSP1作為上游引物，用含有部分接頭序列的通用引物UPM作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR循環，把目的基因3‘末端的DNA片段擴增出來。TTTTTTTTTTTTTTTTNNNNNNNNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTNNNNNNNNNNNNNNNAAAAAAAAAAAAANNNNNNNNNNNNNNNPCR擴增，得到cDNA的3′片段GSPUPM原理：1.加C：逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達mRNA的5‘末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結構”，即甲基化的G時會連續在合成的cDNA末端加上幾個（dC）；SMART技術及5’RACESMART：SwitchingMechanismAt5‘endoftheRNATranscript2.模板跳轉：SMART引物的Oligo（dG）與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉錄酶會自動轉換模板，以SMART引物作為模板繼續延伸，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT），另一端有已知的SMART引物序列，可以利用通用引物進行擴增。3.由于有5‘帽子結構的mRNA才能利用這個反應得到能擴增的cDNA，因此擴增得到的cDNA理論上是全長cDNA。然后用含有部分接頭序列的通用引物UPM作為上游引物，用基因特異引物GSP2作為下游引物，以SMART第一鏈cDNA為模板擴增，把目的基因5‘末端的cDNA片段擴增出來。NNNNNNNNNNNNNNNGGGGGTTTTTTTTTTTTTTTT？？AAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTT？？AAAAAAAAAAAAACCCCCSMART引物區PCR擴增，得到cDNA的5‘片段SMART引物區TTTTTTTTTTTTTTTT特異引物PCR擴增PCR擴增SMART通用引物全長拼接：最終，從2個有相互重疊序列的3'/5‘-RACE產物中獲得全長cDNA序列，或者通過分析RACE產物的3‘和5‘端序列，合成相應引物擴增出全長cDNA。5’RACE法的一致性就是設法在cDNA的5‘端加上已知的引物結合區，使PCR可以進行。小結5.5.2應用cDNA差示法分析克隆基因

cDNA差示分析法（representationaldifferenceanalysis,RAD）充分發揮了PCR能以指數形式擴增雙鏈DNA模板，僅以線形形式擴增單鏈模板的特性，通過降低cDNA群體復雜性和更換cDNA兩端接頭等方法，特異性擴增目的基因片斷。5.5.3Gateway大規模克隆技術Gateway克隆技術是利用λ噬菌體與大腸桿菌的染色體之間發生的位點特異性的重組整合與切出反應。整合反應是由Int（integrase）和IHF（IntegrationHostFactor）催化的。attB和attP之間的重組整合的噬菌體基因組DNA的5’和3’端含有attL和attR位點。切出的重組反應需要IHF,Int和Xis蛋白的參與。在插入E.coli基因組DNA的的噬菌體基因組DNA的5’和3’端的attL和attR位點發生位點特異性的重組，重新在形成lambdaDNA的attP位點和E.coli基因組DNA的attB位點。相對酶切構建載體來說，該技術具有需時短、操作簡單、易于各實驗室交流的特點，即只需通過簡單、高效的BP和LR反應就可實現把PCR產物定向轉入克隆質粒和表達質粒，實現PCR產物在各種質粒間的轉移。5.5.4基因的圖位克隆法

1986年提出，根據目的基因在染色體上的位置進行的，無需預先知道基因的DNA順序，也無需預先知道其表達產物的有關信息，但必須建立遺傳分離群體。主要用于與遺傳病相關基因等致病基因的克隆。

Map-basedcloning是分離未知性狀目的基因的一種好方法。從理論上說，所有具有某種表現型的基因都可以通過該方法克隆得到。（1）首先，將目的基因定位到某個染色體的特定位點，并在其兩側確定緊密連鎖的RFLP或RAPD分子標記。（2）利用與目的基因最緊密連鎖的一對分子標記作探針，通過染色體步移技術將位于這兩個標記之間的基因片段克隆并分離出來。（3）根據基因功能互作原理鑒定目的基因。染色體步移：利用已知的基因或分子標記來篩選大片段的DNA文庫獲得陽性克隆，如此得到的陽性克隆是“一步克隆”，利用獲得的克隆作探針對文庫進行第二次雜交，得到與探針具有重復序列的陽性克隆稱為“二次克隆”，如此反復即可取到需要要得克隆，獲得目的基因。染色體步移克隆基因1E.coli表達體系優勢：

一種成熟的基因克隆表達的受體細胞繁殖迅速，培養代謝易于控制易于進行遺傳操作和高效表達不足之處：1）缺乏適當的轉錄后和翻譯后加工機制。2）缺乏表達蛋白質復性系統，表達蛋白無特異性空間結構。3）表達產物不穩定，易被細菌蛋白酶降解。2目的基因在E.coli中的高效表達三個因素：

強化蛋白質的生物合成抑制蛋白質的降解恢復蛋白質的空間構象3目的基因表達產物的檢測1）蛋白質的PAGE對照樣品Marker2）表達蛋白生物學功能檢測淀粉酶基因表達4目的蛋白的分離純化分子篩親和柱離子交換抗原抗體目的蛋白

目的基因基因載體重組體分切接轉篩表總體技術路線基因載體目的基因

質粒噬菌體病毒PCRcDNA人工合成基因文庫限制性內切酶有切口的載體有切口的目的基因DNA連接酶

重組體

轉化轉染體外包裝帶重組體的宿主細胞

表型篩選電泳法核酸雜交免疫學方法目的基因的表達5.1重組DNA技術回顧5.2DNA基本操作技術5.3RNA基本操作技術5.4SNP的理論與應用5.5基因克隆技術5.6蛋白質組與蛋白質組學技術5.6蛋白質組與蛋白質組學技術

蛋白質組學的發展既是技術所推動的也是受技術限制的。蛋白質組學研究成功與否，很大程度上取決于其技術方法水平的高低。蛋白質研究技術遠比基因技術復雜和困難。蛋白質組的研究實質上是在細胞水平上對蛋白質進行大規模的平行