EnzymeEngineering

酶工程第一章酶學與酶工程

第一節酶工程概述第二節酶的分類、組成、結構特點和作用機制第三節酶作為催化劑的顯著特點第四節酶促反應動力學第五節酶的抑制作用第二節酶的分類、組成、結構特點和作用機制一．酶的分類：二．酶的組成和結構特點三．酶的作用機制（一）習慣命名法

1961年以前使用的酶的名稱都是習慣沿用的，稱為習慣名。主要依據以下原則：1.根據酶作用的底物命名，如纖維素酶。2.根據酶催化反應的性質及類型命名，如溶菌酶。3.根據酶的來源命名，如胰蛋白酶。有的酶結合上述原則來命名。習慣命名比較簡單，應用歷史較長，盡管缺乏系統性，但現在還被人們使用。一．酶的分類（二）國際系統命名法國際系統命名法原則是以酶的整體反應為基礎的，規定每種酶的名稱應當明確標明酶的底物及催化反應的性質。如果一種酶催化兩個底物起反應，應在它們系統名稱中包括兩個底物的名稱，并以“：”號將它們隔開。若底物之一是水時，可將水略去不寫。

ATP＋D-葡萄糖ADP＋D-葡萄糖-6-磷酸國際系統命名為：ATP：D-葡萄糖磷酸轉移酶（三）國際系統分類法及酶的編號

國際酶學委員會，根據各種酶所催化反應的類型，把酶分為6大類，即氧化還原酶類、轉移酶類、水解酶類、裂合酶類、異構酶類和連接酶類。分別用1、2、3、4、5、6來表示。再根據底物中被作用的基團或鍵的特點將每一大類分為若干個亞類，每一個亞類又按順序編成1、2、3、4……等數字。每一個亞類可再分為亞亞類，仍用1、2、3、4……編號。每一個酶的分類編號由4個數字組成，數字間由“·”隔開，編號之前冠以EC（EnzymeCommision)。1．氧化還原酶2．轉移酶3．水解酶4．裂合酶5．異構酶6．連接酶（合成酶）7．核酸酶（催化核酸）1．氧化還原酶(Oxidoreductase)包括脫氫酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、過氧化物酶、氧合酶、細胞色素氧化酶等2．轉移酶(Transferase)包括酮醛基轉移酶、酰基轉移酶、糖苷基轉移酶、含氮基轉移酶等3．水解酶(Hydrolase)脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需輔酶4．裂合酶(Lyase)這類酶可脫去底物上某一基團留下雙鍵，或可相反地在雙鍵處加入某一基團。5．異構酶(Isomerase)此類酶為生物代謝需要對某些物質進行分子異構化，分別進行外消旋、差向異構、順反異構等6．連接酶（合成酶）(LigaseorSynthetase)這類酶關系很多生命物質的合成，其特點是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作為結合能源，有的還需金屬離子輔助因子。分別形成C-O鍵（與蛋白質合成有關）、C-S鍵（與脂肪酸合成有關）、C-C鍵和磷酸酯鍵。

7.核酸酶（催化核酸）Ribozyme核酸酶是唯一的非蛋白酶。它是一類特殊的RNA，能夠催化RNA分子中的磷酸酯鍵的水解及其逆反應。酶用于生物催化的概況類別占總酶比例%利用率%水解酶hydrolases2665氧化還原酶oxidoreductases2725轉移酶transferases245裂合酶lyases12~5異構酶isomerases5~1連接酶ligases6~1二．酶的組成和結構特點（一）酶的組成酶單純酶結合酶（全酶）=酶蛋白+輔因子輔因子輔酶與酶蛋白結合得比較松的小分子有機物。輔基與膜蛋白結合得緊密的小分子有機物。金屬激活劑金屬離子作為輔助因子。酶的催化專一性主要決定于酶蛋白部分。輔因子通常是作為電子、原子或某些化學基團的載體。（二）單體酶、寡聚酶和多酶復合物1.單體酶（monomericenzyme)：一般由一條多肽鏈組成，但有的單體酶是由多條肽鏈組成，肽鏈間二硫鍵相連構成一整體。2.寡聚酶(oligomericenzyme)：由幾個或多個亞基組成，亞基牢固地聯在一起，單個亞基沒有催化活性。亞基之間以非共價鍵結合。3.多酶復合物(multienzymesystem)：是由幾種酶非共價鍵彼此嵌合而成。這些酶催化將底物轉化為產物的一系列順序反應。(三)

活性部位和必需基團必需基團：這些基團若經化學修飾使其改變，則酶的活性喪失。活性部位：酶分子中直接與底物結合，并和酶催化作用直接有關的部位。必需基團活性部位維持酶的空間結構結合基團催化基團專一性催化性質三．酶的作用機制1．酶的作用過程2．酶與底物的結合模型3．酶的催化作用1．酶的作用過程酶的活性部位：是它結合底物和將底物轉化為產物的區域，通常是整個酶分子相當小的部分，它是由在線性多肽中可能相隔很遠的氨基酸殘基形成的三維實體。2．酶與底物的結合模型a．鎖和鑰匙模型b．誘導鍥合模型a．鎖和鑰匙模型

認為整個酶分子的天然構象是具有剛性結構的，酶表面具有特定的形狀。酶與底物的結合如同一把鑰匙對一把鎖一樣b．誘導鍥合模型

該學說認為酶表面并沒有一種與底物互補的固定形狀，而只是由于底物的誘導才形成了互補形狀.3．酶的催化作用（1）研究方法（2）影響酶的催化作用（1）研究方法a.從非酶系統模式獲得催化作用規律b.從酶的結構與功能研究中得到催化作用機理的證據。（2）影響酶的催化作用a.廣義的酸堿催化b.共價催化c.鄰近效應及定向效應d.變形或張力e.酶的活性中心為疏水區域a.廣義的酸堿催化能供給質子的物質即為酸，能接受質子的物質即為堿例HA=A-+H+HA為酸，A-為堿例HA（酸）+X=AXH（酸催化）AXH+B-（堿）=Y+BH+A-（堿催化）b.共價催化底物與酶以共價方式形成中間物。這種中間物可以很快轉變為活化能大為降低的轉變態，從而提高催化反應速度b.共價催化親電試劑：一種試劑具有強烈親和電子的原子中心。親核試劑：就是一種試劑具有強烈供給電子的原子中心。c.鄰近效應及定向效應所謂鄰近效應就是底物的反應基團與酶的催化基團越靠近，其反應速度越快。d.變形或張力e.酶的活性中心為疏水區域酶的活性中心為酶分子的凹穴此處常為非極性或疏水性的氨基酸殘基第三節酶作為催化劑的顯著特點一．催化能力二．專一性三.調節性一．催化能力催化常數kcat

（或轉換數，TN）：每個酶分子每分鐘催化底物轉化的分子數。一般為103min-1，碳酸酐酶最高為3.6*107min-1有酶加入比無酶參加反應速度一般要高107-1013二．專一性1．絕對專一：只催化一種底物進行快速反應，甚至是立體專一性2相對專一性：基團專一和鍵專一三.調節性1.酶濃度的調節2激素調節3.共價修飾調節4.限制性蛋白水解作用與酶活力調控5.抑制劑的調節6.反饋調節7.金屬離子和其他小分子化合物的調節第四節酶促反應動力學

酶促反應動力學（kineticsofenzyme-catalyzedreactions）是研究酶促反應的速度以及影響此速度的各種因素的科學。酶促反應動力學的研究既有重要的理論意義，又具有一定的實踐意義。一、底物濃度對酶反應速度的影響（一）中間絡合物學說

1903年Henri用蔗糖酶水解做實驗，研究底物濃度與反應速率的關系。當酶濃度不變時，可以測出一系列不同底物濃度下的反應速度，以反應速度對底物濃度作圖，可得一雙曲線。從該曲線可以看出，當底物濃度較低時，反應速率對底物濃度的關系呈正比關系，表現為一級反應。隨著底物濃度的增加，反應速率不再按正比升高，反應表現為混合級反應。當底物濃度達到相當高時，底物濃度對反應速率影響變小幾乎無關，反應達最大速率，為零級反應。

根據上述實驗結果，Henri和Wurtz提出酶底物中間絡合學說。（二）酶促反應的動力學方程式1.米氏公式的推導

1913年Michaelis和Menten在前人工作的基礎上，根據酶反應的中間復合物學說，推導出底物濃度與酶反應速率之間的定量關系，稱之為米氏方程：Vmax[S]Ks+[S]V0=

1925年Briggs和Haldane提出了穩態學說，對米氏方程作了修正，認為酶促反應分為兩步進行：（1）酶與底物作用形成酶-底物復合物（ES）；（2）ES復合物分解形成產物，釋放出游離酶。他們認為，許多酶催化反應的k2很高，k2不僅不特小于k－1，而且遠比k－1大，即ES分解成E和P的速度比解離成E和S的速度快。該學說認為，在反應進行了一段很短的時間后，[ES]由0增加到一定數值，然后保持不變，即達到穩態水平，這時生成ES的速度與ES分解和解離的速度相等。Theterm(k2+k-1)/k1isdefinedastheMichaelis-Mentenconstant,Km.

AnimportantnumericalrelationshipemergesfromtheMichaelisMentenequationinthespecialcasewhenV0isexactlyone-halfVmax。If[S]<<Km,2.動力學參數的意義（1）米氏常數的意義①Km是酶的一個特征常數，Km的大小只與酶的性質有關，而與酶濃度無關。但必須固定在某一反應條件下（pH、溫度、離子強度等）才能保持不變。若一個酶可以催化多種底物反應，則對不同底物有不同的Km值。②Km值可以判斷酶的專一性和天然底物，1/Km可近似地表示酶對底物親和力的大小。③Km與Ks：Km=k-1+k2/k1，Ks=k-1/k1④若已知某酶的Km值，就可以計算在某一底物濃度時，其反應速率相當于Vmax的百分率。⑤Km值可以幫助推斷某一代謝反應的方向和途徑。（2）Vmax和k2（kcat）的意義在一定酶濃度下，酶對特定底物的Vmax也是一常數。Vmax與Km相似，同一種酶對不同底物的Vmax也不同，pH、溫度和離子強度等因素也影響Vmax的數值。（3）kcat/Km的意義

亦稱為表觀二級常數，酶的專一性常數

Kcat/Km值的大小，可以比較不同酶或同一種酶催化不同底物的催化效率。比較競爭底物的專一性，根據kcat/Km值而不是Km值。對于一個酶促反應而言，當kcat/Km值達到108

～109S-1M-1

時，限速步驟在于酶與底物結合中的分子擴散，達到了極限。3.米氏常數的測定（1）Lineweaver-Burk雙倒數作圖法（TheDouhle-ReciprocalPlot）橫軸截距為-1/Km，縱軸截距為1/Vmax。（2）Eadie-Hofstee作圖法

v=Vmax-Km·v/[S]以v~v/[S]作圖得一直線，其縱軸截距為Vmax，斜率為-Km。（3）Hanes-Woolf作圖法

[S]/v=[S]/Vmax+Km/Vmax以[S]/v~[S]作圖得一直線，橫軸截距為-Km，斜率為1/Vmax。

第五節酶的抑制作用

酶是蛋白質，凡可使蛋白質變性而引起酶活力喪失的作用為失活作用（inactivation)。由于酶的必需基團化學性質的改變，但酶未變性，而引起酶活力的降低或喪失稱為抑制作用（inhibition）。引起抑制作用的物質稱為抑制劑（inhibitor）。變性劑對酶的變性無選擇性，而一種抑制劑只能使一種酶或一類酶產生抑制作用，即抑制劑對酶的抑制作用是具有選擇性的。一、抑制作用的類型根據抑制劑與酶的作用方式及抑制作用是否可逆，可把抑制作用分為兩大類：1.不可逆的抑制作用（irreversibleinhibition）抑制劑與酶的必需基團以共價鍵結合而引起酶活性喪失，不能用透析，超濾或凝膠過濾等物理方法去除抑制劑而使酶復活者，稱為不可逆抑制作用。2.可逆的抑制作用（reversibleinhibition）抑制劑與酶以非共價鍵結合而引起酶活性的降低或喪失，能用物理的方法除去抑制劑而使酶復活者稱為可逆抑制作用。

根據可逆抑制劑與底物的關系，可逆抑制作用分為以下類型：（1）競爭性抑制（competitiveinhibition）（2）非競爭性抑制（noncompetitiveinhibition）（3）反競爭性抑制（uncompetitiveinhibition）（4）其他可逆抑制二、可逆抑制作用動力學（一）競爭性抑制抑制劑（I）和底物（S）競爭酶的結合部位，從而影響了底物與酶的正常結合。竟爭性抑制（二）非競爭性抑制底物與抑制劑同時和酶結合，兩者沒有競爭作用。非競爭性抑制（三）反競爭性抑制酶只有與底物結合后，才能與抑制劑結合，即ES+IESI，ESIPNoncompetitiveinhibitiona=1+[I]/KIcompetitive

inhibitionUncompetitiveinhibitiona’=1+[I]/K’I,K’I=[ES][I]/[ESI]noncompetitive

inhibition（四）其他可逆抑制

1．底物抑制2．產物抑制1．底物抑制

底物抑制：當底物過量時，反而可能減慢反應速度。其作用機制可能是：當兩個底物分子同時向一酶分子攻擊時，為了使自己能更接近活性中心，他們只能各自以一端與酶分子結合，這樣反而阻礙了他們中的任一個與酶的正確結合。2．產物抑制

產物抑制：產物對酶反應的抑制作用在生物體中較為常見，在細胞內，酶反應的產物雖然不斷被另外的酶作用，但S和P總是同時存在的，因此，考慮產物對反應速度的影響，可能具有一定的意義。三、一些重要的抑制劑1.不可逆抑制劑按照不可逆抑制作用的選擇性，可將其分為兩類：（1）非專一性不可逆抑制劑主要有以下幾種：①有機磷化合物常見的有DIFP、農藥敵敵畏、敵百蟲、對硫磷等。②有機汞、有機砷化合物這類化合物與酶分子中半胱氨酸殘基的硫基作用，抑制含硫基的酶。③重金屬鹽含Ag+、Cu2+、

Hg2+、

Pb2+

、

Fe3+重金屬鹽在高濃度時，能使酶蛋白變性失活。