第8章層析分離知識點：色層分離法的分類及其概念，柱層析技術，吸附層析技術，離交層析技術，生物親和層析技術，分配層析技術，凝膠過濾技術，電泳技術，薄板層析技術。重點：上述各技術的原理、操作方式、操作過程、所用裝置和材料的選擇、適用范圍，能夠靈活熟練地運用這些技術。難點：常用層析法的分類及其合理選用。目錄1層析法概述2柱層析3紙層析4薄層層析5吸附層析6分配層析7凝膠過濾8電泳法9毛細管電泳10高效液相色譜1層析法概述1.1引言1.2層析的發展史1.3層析的基本原理及基本概念1.4層析的分類1.5層析劑1.1引言層析原理色譜（層析）法應用范圍色譜技術的提出色譜分離圖示

1.2層析的發展史年代發明者發明的色譜方法或重要應用1906Tswett用碳酸鈣作吸附劑分離植物色素。最先提出色譜概念1931Kuhn,Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離a-、b-和g-胡蘿卜素。使色譜法開始為人們所重視。1938TaylorUray用離子交換色譜法分離了鋰和鉀的同位素。1941Martin,Synge提出色譜塔板理論；發明液-液分配色譜；預言了氣體可作為流動相（即氣相色譜）。1952Martin,James從理論和實踐方面完善了氣-液分配色譜法。1956VanDeemter提出色譜速率理論，并應用于氣相色譜。1957基于離子交換色譜的氨基酸分析專用儀器問世。1958Golay發明毛細管柱氣相色譜。1965Giddings發展了色譜理論，為色譜學的發展奠定了理論基礎。1975Small發明了以離子交換劑為固定相、強電解質為流動相，采用抑制型電導檢測的新型離子色譜法。1981Jorgenson創立了毛細管電泳法。1.3層析基本概念層析展開（development）洗脫液(eluate)

色譜(Chromatograph)。分配系數洗脫體積：外體積：內體積：正相層析：反相層析：1.4層析分類分類原則類型特征據溶質分子與固定相相互作用的機理不同吸附色譜離子交換色譜疏水作用層金屬螯合色譜共價作用色譜分配色譜凝膠過濾親和色譜吸附力不同各物質與固定相之間的離子交換能力的不同各物質與固定相之間的疏水作用的強弱不同各物質與固定相上的金屬離子的絡合能力的不同巰基化合物的巰基與固定相表面的二硫鍵作用力不同各物質在兩液相間的分配系數不同各物質的分子大小或形狀不同利用生物大分子與各種配基的生物識別能力不同據實驗技術

低壓色譜中壓色譜高壓色譜電泳操作壓力小于0.5MPa操作壓力在0.5～5MPa之間操作壓力在5～40MPa之間溶質分子在電場中的移動速度不同據固定相的形狀不同柱色譜紙色譜薄層色譜固定相裝在玻璃、不銹鋼或有機玻璃柱中固定相為以氫鍵與纖維素羥基結合的水固定相在玻璃平板上鋪成薄層據流動相的物態不同

氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜流動相為氣體流動相為液態流動相為液態按操作方式不同

迎頭法頂替法洗脫法將混合物溶液連續通過固定相，只有化學親和力最弱的組分以純粹狀態最先流出，但其它各組分都不能達到分離。利用一種化學親和力比各被結合組分都強的物質來洗脫，這種物質稱為頂替劑。此法處理量大，且各組分分層清楚，但層與層相連，故不能將組分分離完全。將混合液盡量濃縮，使體積縮小，引入固定相的一端，然后用溶劑洗脫，洗脫溶劑可以是原來溶解混合物的溶劑，也可選用另外的溶劑。吸附色譜與其它色譜法的異同點類型機理優點缺點適用范圍吸附色譜化學、物理吸附操作簡便易受離子干擾各種生物大分子的分離、脫色、和去熱源凝膠過濾分子篩的排阻效應分辨力高，不會引起變性各種凝膠介質昂貴，處理量有限制分子量有明顯差別的可溶性生物大分子分配色譜溶質在固定相和流動相中分配系數的差異分辨力高，重復性較好，能分離微量物質影響因子多，上樣量太小用于各種生物大分子的分析鑒定親和色譜親和色譜生物大分子與配體之間有特殊親和力分辨力很高一種配體只能用于一種生物大分子，局限性大各種生物大分子聚焦色譜等電點和離子交換作用分辨力高進口試制昂貴蛋白質和酶1.4層析的分類⑴根據溶質分子與固定相相互作用的機理不同的分類凝膠過濾法分配層析法離子交換色層分離法吸附層析法疏水作用色層分離法金屬螯合色層分離法共價作用色層分離法⑵根據實驗技術的分類低壓層析技術中壓層析技術高壓層析技術電泳法——操作壓力在0.5MPa-5MPa之間——操作壓力在5Mpa-40MPa之間——操作壓力小于0.5MPa——靠溶質分子在電場中的移動速度不同而分離⑶根據固定相的形狀不同的分類：

柱層析法紙層析法薄層層析法⑷根據流動相的物態不同的分類

汽相層析法液相層析法液相層析法⑸操作方式不同的分類迎頭法頂替法洗脫分析法1.5層析劑種類⑴氧化鋁⑵硅膠⑶活性炭⑷瓊脂糖⑸纖維素2柱層析法柱色譜法對色譜介質材料的要求常用柱色譜介質的分類柱層析系統的組成柱色譜洗脫方法常用柱色譜介質的分類無機物色譜介質包括：氧化鋁、硅膠、活性炭、膨潤土、磷酸鈣(凝膠型和晶型)、氧化鈦和氫氧化鋅凝膠等。聚合物色譜介質有：瓊脂糖、葡聚糖、纖維素和聚丙烯酰胺等。

柱色譜洗脫方法

洗脫一般有三種方法：①恒定洗脫法：②逐次洗脫法：③梯度洗脫法：梯度洗脫法是目前最常用的洗脫法。濃度梯度制造器柱色譜系統的組成

色譜介質有各種各樣，但柱式色譜系統的組成基本相似，一般由蠕動泵、色譜柱、檢測器、記錄儀以及部分收集器等幾個部分構成(圖2)。

柱式層析系統的組成基本相似。由以下幾個部分構成：A蠕動泵B層析柱C裝柱D加試樣E洗脫F檢測器G部分收集器柱層析系統的組成柱層析裝置圖

緩沖液管柱梯度制造器監視器記錄器分劃收集器(1)(2)泵(3)(4)(5)adaptorreservoir膠體裝填膠體A

3紙層析法3.1基本原理3.2操作方法3.3操作步驟小實驗當濾紙接觸到溶劑時，溶液將上升。濾紙上的小圓點是4種不同的氨基酸的混合物。看看接下來會發生什么事情…可以看出1號氨基酸上升的最高，在濾紙上跑得最快。而4號氨基酸與濾紙的結合最緊，因此跑的速度比其他的氨基酸慢。1234這就是紙層析法。對照上圖，可知道1-4號的各代表什么氨基酸。紙層析法是分離鑒定蛋白質的氨基酸組成的重要工具。

1234甘氨酸半胱氨酸組氨酸纈氨酸紙層析小實驗動畫演示濾紙的選用型號標重(g/m2)厚度(mm)吸水性灰分(%)性能1900.17150-1200.08快速2900.16120-910.08中速3900.1590-600.08慢速41800.34151-1210.08快速51800.32120-910.08中速61800.3090-600.08慢速4薄層層析法4.1薄層層析原理4.2吸附劑及展開劑4.3特殊薄層4.4薄層層析操作要點4.5定性分析4.6定量分析4.7薄層層析應用4.4薄層層析操作要點鋪板點樣點樣量展開顯色注：本部分以操作要點注意事項為主，具體過程參見咖啡因的分離分析（動畫演示）Doyouunderstand?薄層層析應用示例

咖啡因的分離分析（動畫演示）圖1芍藥甙薄層層析掃描圖圖2丹皮酚薄層層析掃描圖5吸附層析法5.1吸附層析定義及原理5.2吸附色層與其他色層分離法的異同點5.3吸附層析的分類5.4無機吸附色層分離法5.5疏水作用層析（HIC）5.6金屬螯合層析5.7共價作用層析法5.8離子交換層析法5.9卡那霉素A、B組分分離純化典型實例吸附色層與其他色層分離法的異同點吸附層析化學、物理吸附操作簡便易受離子干擾各種生物大分子的分離、脫色、和去熱源凝膠層析分子篩的排阻效應分辨力高，不會引起變性各種凝膠介質昂貴，處理量有限制分子量有明顯差別的可溶性生物大分子分配層析溶質在固定相和流動相中分配系數的差異分辨力高，重復性較好，能分離微量物質影響因子多，上樣量太小用于各種生物大分子的分析鑒定親和層析親和層析生物大分子與配體之間有特殊親和力分辨力很高一種配體只能用于一種生物大分子，局限性大各種生物大分子聚焦層析等電點和離子交換作用分辨力高進口試制昂貴蛋白質和酶吸附層析的分類

無機材料的吸附色層分離法離子交換色層分離法疏水作用色層分離法共價作用色層分離法金屬螯合作用色層分離法等作業名詞解釋：梯度洗脫法、共價作用層析、免疫親和層析、層析劑的排阻效應、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾：2.填空：1)

凝膠過濾主要應用于＿＿＿＿＿＿＿，＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿。凝膠過濾時＿＿＿＿＿＿先自柱中流出，凝膠電泳中＿＿＿＿＿運動速度更快，凝膠電泳是基于＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿雙重機理，常用的凝膠劑有＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿。2)

共價作用層析主要依靠＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的原理，吸附層析是基于＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿的機理，蛋白質和離子交換劑的結合是通過＿＿＿＿＿＿＿＿＿而結合，離子交換層析劑有＿＿＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿sephadexG-15表示＿＿＿＿＿＿，硅