第七章

果樹抗寒生理及凍害防御

第一節凍害機制

一、低溫冰凍對植物細胞的傷害

現在多數人的研究都集中在由于細胞間隙結冰而引起的凍害。但也有其它觀點，主要有以下幾種假說。(一)活體水釋放假說

Weiser(1970)等人認為：植物因凍致死的直接原因，是由于溫度降低到一定程度，全部可以釋放的水分都在細胞間隙結冰，只有活體水保留在原生質中。溫度繼續下降，則活體水被迫排出，導致細胞瞬間死亡。

(二)硫氮甚假說

Levitt(1962)提出植物在冷凍過程中，細胞內的水分不斷向細胞外釋放，結果使原生質膠體外的水膜減少，蛋白質的SH基暴露。相互靠近形成S-S健，而造成蛋白質凝聚、收縮、變性。(三)膜相變傷害假說

Lyons(1973)根據生物膜結構功能與抗寒性關系提出了膜相變傷害假說。（四）膜蛋白變性假說

J.P.Palta和P.H.Li(1977)提出植物在冷凍過程中，首先受害的是膜蛋白。(五)細胞內結冰假說

Tumanov等認為，植物因凍致死的直接原因，并非是由于細胞間隙的結冰，而是由于細胞內的結冰。二、化凍對植物細胞的傷害

機械應力假說

在發生細胞外結冰時，細胞本身被擠壓變形，原生質膜有可能在向內凹陷曲率最大處被撕破（N.S.Pushkar,1980)。當融化時，細胞壁迅速吸水回到原來位置，而原生質體吸水膨脹較慢，這種差別產生的壁與膜之間的應力也可能把原生質體撕裂。三、對于凍害機制各種假說的評價1、硫氫基假說與膜相變假說不矛盾，并可以相互補充；2、生物膜是對低溫最敏感的區域，首當其沖的是原生質膜；3、細胞內一旦結冰，細胞便死亡；4、總之，凍害機制的研究可以歸納為兩個方面：一方面是研究初始傷害部位和初始致傷事件；另一方面是研究冰凍過程中逆境的性質。第二節抗凍機制

一、避免組織內結冰

(一)增加細胞液濃度加強栽培管理，或者是細胞適度失水，可以提高細胞液濃度，導致冰點下降。(二)過冷水或水溶液冷卻到冰點以下仍不結冰，稱作過冷。過冷是植物抗凍的主要途徑之一。二、忍耐組織內結冰

1、細胞核的形態變化

隨著氣溫的降低，核仁逐漸縮小，亮區收縮、減弱，核活性降低。2、液泡的形態變化液泡在氣溫降低過程中，主要是小泡化，變成幾個小液泡，核在細胞質的中央。破裂的小囊泡膜在液泡內形成網狀結構，加固了液泡膜的強度，從而增強了承受脫水和細胞結冰的壓力。

3、細胞質的變化在氣溫降低的過程中，細胞質濃度增加，糖度升高，細胞質的流動性減小，粘度加大。4、葉綠體的形態變化在氣溫降低的情況下，葉綠體體積逐漸變短粗，相互聚集，然后相互出現嵌合，5、線粒體的形態變化線粒體在氣溫降低過程中，體積增大，體型由窄長棒狀變成短粗狀，內脊數目增加。6、內質網和高爾基體的形態變化

在氣溫降低過程中，內質網向外分泌微小泡。在細胞膜附近；高爾基體非常發達，內質網分泌的微小泡向著高爾基體移動，在高爾基體上經過修飾以后，再被高爾基體分泌出去，參與細胞膜的形成。因此這兩個細胞器在秋季氣溫逐漸降低時，對膜的穩定性起重要作用。7、生物膜的變化（1）膜的狀態變化

生物膜在常溫下是液晶態，介于液態和固態之間。當環境溫度低于它的相變溫度時，就會發生相變，由液晶態變成固態。(2)細胞內物質對膜活性的影響植物細胞內都存在著對膜有害和有利的物質。在低溫條件下，由于細胞內的含水量降低，以及蛋白質的不可逆降解，而使細胞內膜致毒物質的相對量和絕對量都明顯增加，對生物膜造成了嚴重的威脅。(3)膜成分的變化過程在秋季溫度逐漸降低，樹木適應冬季寒冷的氣候條件，細胞膜的成分發生變化，從而降低它的相變溫度，使其在冬季寒冷的氣候條件下，不致由液晶態變成固態，保證膜的結構、性質和功能不受破壞。8、低溫過程中細胞的生物學變化

（1）可溶性糖的變化

低溫下，可溶性糖增加；對果樹的抗寒性提高有很重要的作用：一是單糖和寡聚糖可以提高細胞液濃度，增加持水力，降低冰點。二是可溶性糖可以維持膜活性，防止致毒物質對膜的危害。另外，糖的積累可以為蛋白質的合成提供底物和能量（2）蛋白質的變化許多報道指出，秋季氣溫下降，植物體內蛋白質增加,與抗寒性的形成有密切關系。

(3)膜脂肪酸的變化

我們把低溫下不飽和脂肪酸的增加與提高抗寒性的關系歸納如下：

直接影響膜的狀態表現為低溫下穩定性加強不飽和脂肪酸增加(不飽和指數增大)

間接影響酶的活性一些生理過程在低溫下正常進行

(4)類脂的變化

類脂和蛋白質是構成生物膜的主要成分。類脂和蛋白質的多樣性，反映了膜機能的多樣性，特別是膜類脂。它反映了膜的狀態特性，與低溫下膜的許多機能緊密關聯。(5)核酸的變化

秋季蛋白質增加，RNA也增加?？墒?，DNA卻幾乎沒有什么變化。植物為了適應低溫能調節特征蛋白質的合成。9、低溫條件下酶和代謝途徑的變化（1）酶的變化植物的抗寒性與酶的調節有關，而酶的調節包括酶的形成和酶的活性兩個方面?？购参飳Φ蜏赜休^強的抗性，是植物在長期進化過程中適應低溫而形成的。它對低溫的抗性主要受速度的控制。至于低溫鍛煉和季節的抗寒性差別，很可能是在轉錄和翻譯水平上的生物化學變化所決定的。(2)代謝途徑的變化木本植物越冬期間，HMP(磷酸戊糖)途徑比EMP(糖酵解)途徑活躍，而生長期，則EMP比HMP途徑活躍。三、低溫鍛煉

Weiser（1970）利用原產溫帶的木本植物為試材，進行低溫鍛煉試驗。全部鍛煉過程共分三個階段:

第一個階段是由短日照引起的；第二階段從第一次霜凍開始，被0℃以下低溫所促進；第三階段要求-30一-50℃的低溫。四、啟動抗寒基因合成新蛋白質誘發抗寒性

低溫鍛煉和ABA處理可以改變馬鈴薯莖培幼株中RNA和蛋白質的類型；低溫鍛煉和ABA處理共同誘導一些多肽和mRNA。從提高杭寒性和誘導一些共同的蛋白質來看，ABA的作用與低溫鍛煉完全相似，也可以說在自然條件下，ABA對啟動抗寒基因表達起著關鍵的作用。五、植物休眠與抗寒性的關系

植物休眠可分為自然休眠和被迫休眠。休眠期間，由于代謝作用的強度降低，呼吸作用減弱，養分消耗減少，因而對不良環境條件的反應不敏感。自然休眠結束之后，隨著氣溫上升，耐寒力迅速下降，再遇低溫，耐寒力雖然還可以上升，但是上升的速度遠遠不及下降的速度。已經脫鍛煉的植體，遇到回寒便遭凍害。第三節低溫冷害一、低溫冷害的概念

低溫冷害是受低溫逆境的脅迫而發生的傷害。低溫逆境只是低于適溫，但在未結冰的條件下，低溫冷害常使植物生育受阻滯，甚至發生生理障礙，導致減產或絕產。二、低溫冷害的類型

(一)延遲型冷害

在營養生長期由于積溫不足造成生育期延遲。(二)障礙型冷害

植物在生殖生長期，生殖器官正在分化、形成和開花，此時遭受短時間的異常低溫，常使生殖器官的生殖機制受到破壞，造成不育或部分不育而減產(三)混合型冷害

障礙型冷害和延遲型冷害在同年發生時稱混合型冷害。這種冷害比單一冷害的危害性更大。三、低溫冷害的生理機制

(一)低溫對光合作用的影響1、低溫影響光合器官的結構(1)低溫對葉綠體、類囊體膜的影響葉綠體膜、類囊體膜在低溫和光照的條件下，葉綠體內自由基的產生與清除的平衡遭到破壞，促進了膜脂過氧化作用，引起膜系統結構和功能的損傷，使光合速率下降。(2)低溫對葉綠素的影響低溫和自然光照下，引起葉綠素含量降低。葉綠素a/b的比值增大。

利用光反應產生的同化力(NADPH和ATP)把二氧化碳還原成碳水化合物的暗反應是一系列的酶促反應，因此低溫影響酶的活性也就影響光合作用的暗反應速度。低溫能使酶的活性降低，原因可能是低溫減弱了疏水鍵而直接影響蛋白質，或直接影響氫鍵，或在低溫下靜電互相作用加強，看來疏水鍵在保持酶結構上有重要作用，疏水鍵的變化會影響到酶的動力學參數。

2、低溫對光合作用暗反應的影響

3、低溫對光反應的影響植物光合作用中光反應是由光推動的，主要作用是形成同化力(NADPH和ATP)，因此光反應的溫度系數比同化二氧化碳的暗反應要小得多，光反應受溫度的影響較小。在光反應中PSI和PSII兩個光系統對低溫的反應也不相同，一般認為PSII對低溫更敏感。4、低溫對光合作用的間接影響（1）低溫引起光合產物運輸受阻

有人認為，低溫使光合產物運輸受阻而導致光合產物的積累，從而對光合速率產生反饋抑制；另外也有人認為，低溫下光合產物的積累對光合速率不存在反饋抑制。(2)低溫引起植物體內水分虧缺

Sachs發現和MoIish（1896）證實在低溫下次生的水分逆境，后者明確指出，冷傷害發生的部位是根。在冷害溫度下，還可能發生次生的缺氧逆境，危害植物。

(二)低溫對呼吸作用的影響

1、低溫對呼吸強度的影響

隨著溫度的降低，呼吸強度隨之下降，但當溫度到一定程度以后，呼吸強度產生一躍變，以后再繼續明顯下降。低溫所引起的呼吸強度增加是傷害的開始。2、低溫對底物氧化途徑的影響

在植物中，底物氧化途徑主要有EMP和HMP途徑，隨著溫度的變化，其代謝途徑也有變化。(三)低溫對礦質營養吸收的影響

根系吸收礦質營養所需的能量來自呼吸作用，某些元素的吸收與呼吸作用的關系更為密切。因低溫使根的呼吸作用降低，也使植物對礦質營養的吸收減弱。

（四)低溫對生殖生長的影響1、小孢子形成期及減數分裂期受害的生理機制小孢子形成期及減數分裂期受低溫危害的主要原因是雄蕊受害，花粉不能正常成熟，造成部分不育或全部不育。小孢子形成期受到低溫的影響，造成花藥里氈絨層細胞畸形，開花期花藥不能正常開裂。2、開花期低溫的危害

在開花期遇到低溫主要影響授粉受精的正常進行。(五)低溫冷害對生物膜的影響當冷害發生，膜脂由液晶態變為凝膠態時，首先發生像ATP酶等一系列膜結合酶的失活，從而導致代謝紊亂。四、抗冷鍛煉與藥劑處理

利用2,4-D或KCl+NH4NO3+硼酸噴灑黃瓜(Solomonovskii等，1967)，用吡啶羧酸或Decsom（呼吸抑制劑)施用于棉花(Amin，1969)，用細胞分裂素噴灑豌豆（Kuraishi等，1966），在黃瓜上噴灑ABA(Rikin等，I976)等都可提高抗冷性。第四節

鑒定果樹抗寒性的方法

一、根據起源地和分布區的生態環境加以判斷

植物抗寒力的高低，與其起源地和分布區的生態環境密切相關。起源地和分布區是寒冷的，這種植物必定是抗寒的，相反就不一定是抗寒的。二、根據生長發育規律和形態特征進行判斷

(一)生長發育特征一般落葉果樹在一年中都有萌芽展葉開花期、新梢生長期、花芽分化、果實成熟期和落葉休眠期。這四個時期節奏明顯的，一般是抗性較強的。在溫帶和寒溫帶生產實踐以及大量的研究表明，新梢生長迅速，及時結束生長，營養生長期短的樹種或品種抗寒，(二)形態特征抗寒的樹種或品種葉片小、茸毛少、薄、秋季花青素產生早、含量高、落葉早；枝條較細、分枝多、針狀枝多、新梢停止生長早、越冬前枝條成熟好、木質化程度高，芽較瘦??；樹皮薄、光滑，樹勢中庸強健；在一年中生長發育較早，進入休眠也早。三、根據組織細胞結構特性進行鑒定

(一)細胞體積

葉肉細胞和柵欄細胞體積小的抗寒性強。(二)柵欄細胞和海綿細胞特征

柵欄細胞細而長，即其長、短徑比值大，或柵欄細胞層次為兩層的，或柵欄細胞內葉綠體數目多的都是抗寒的標志，四、根據生理生化指標進行鑒定(一)休眠特征外觀上看起來相似的休眠狀態，在內部實質上并不完全相同，因此休眠可分為兩類：一類是完全休眠，另一類是部分休眠。在冬季除了最冷的一段時間外，在休眠期內還能緩慢地進行著細胞分裂，只不過細胞不能進行延長生長。上述兩種休眠狀態，顯然完全休眠態的抗寒能力強于部分休眠態的。(二)細胞質壁分離特征蘋果進入休眠時，枝條皮層細胞和芽內細胞出現帽狀(凸形)質壁分離，深休眠時，抗寒性強的較早全部質壁分離，解除休眠時，抗寒性強的復原較早且快。(三)生化指標1、電導法

凍害的原初部位是生物膜受到損傷之后，細胞內的物質滲漏到細胞之外，滲漏的多少與凍害程度有關，凍害程度越大，細胞內的物質外滲越多，尤其是電解質物質K+的外滲特別明顯，其次是Ca2+。根據凍害能破壞細胞膜系統而造成細胞內電解質外滲的原理，便可以采用電導法來測定凍害程度。2、氯化三苯基四氮唑法（TTC法)具有生命力的植物組織，其脫氫酶系統的輔酶NAD和NADP具有活性，作為H+的遞體而存在，它們可以使無色的氯化三苯基四氮唑還原成紅色的三苯甲鐟，根據紅色的深淺來確定凍害程度，紅色越深凍害越輕，紅色越淺凍害越重。

3、膜脂組分分析法

生物膜是由膜脂和膜蛋白組成的，膜脂和膜蛋白的含量和組分變化，必然影響生物膜的結構和功能。膜脂包括有膜磷脂和膜糖脂等，其中前者普遍認為與抗寒有關。4、測定可溶性糖秋季植物進入低溫鍛煉以后，糖含量的增加是一個普遍現象。糖的積累是對低溫的一種適應性反應。在秋季條件下通過測定果樹等木本植物可溶性糖含量，對了解其抗寒力具有重要意義。

5、測定自由水和束縛水

在柑桔抗寒性的生理生化指標研究中束縛水/自由水的比例與抗寒性強弱有著明顯的關系，比值大的抗寒力強。6、測定可溶性蛋白質

低溫鍛煉期間植物體內發生蛋白質的變化，經低溫鍛煉后，它們的可溶性蛋白質都增加。五、生長法和組織褐變法

生長法和組織褐變法都是檢查果樹凍害或抗寒力最早的方法，目前生產和科研中仍然普遍應用。生長法和組織褐變法在材料處理上都是取自然受凍的枝條，或事先通過一組低溫冷凍的枝條，經緩慢化凍后，再分別進行操作。六、控制低溫冷凍法被測樣品放在低溫冰箱中，冰箱內溫度由人工控制。在人工降溫時，要注意使樣品內的水與冰保持平衡狀態，通常把降溫速度控制在每小時1—2℃。當降溫達到預定程度后，取出樣品時也要緩緩升溫化凍，然后用砂培或水培，觀察其恢復生長能力。把造成50%的枝、芽或葉面積死亡的溫度稱作半致死溫度(LT50)，用以代表樣品的耐寒力。同樣的情況，LT30表示30%的致死溫度；LT90表示90%的致死溫度。第五節

凍害的類型及防御途徑

一、凍害與環境的關系

(一)光照

1、樹冠結構合理，樹冠內、外層光照充足，光合產物積累多，枝芽充實飽滿，保護組織發達，有利于果樹的抗寒。2、陽光直射在果樹枝干上，使枝干組織內的溫度升高，夜間溫度下降，劇烈的溫度變化，常引起日燒。3、在生長前期，延長日照，能促進生長，生長后期縮短日照，可促使枝條及時停止生長，為低溫鍛煉創造條件，可增強耐寒力。

(二)溫度1、秋季氣溫激變

秋季降溫過早，幅度過大，而果樹尚未進入休眠，往往會發生比較嚴重的凍害。2、冬季低溫和低溫持續時間過長冬季的極端最低溫度，對果樹凍害固然有影響，但是根據歷史氣象資料記載，果樹凍害的發生，并非完全與極端低溫有關。長時間的連續低溫造成果樹嚴重凍害。

3、冬季氣溫激變冬季里，如果氣溫變化劇烈，如日較差太大，往往會導致樹體枝干受凍，木質部變褐，或發生干裂與干基凍害。冬季里，如果連續出現高溫(0℃以上)天氣，可使果樹發生脫鍛煉，抗寒力迅速下降，再遇低溫，便遭受凍害。4、春季氣溫的回寒春季隨著氣溫的上升，果樹發生脫鍛煉，抗寒力下降，如果遇到回寒，便會發生凍害。

(三)水分我國北方，在干旱年代，由于供水不足，果樹生長勢弱，越冬容易發生凍害。如果夏秋季多雨，供水太多，引起徒長，也可以降低果樹的抗寒力。在越冬前，如果土壤過分干燥，也常常引起凍害。(四)通風風與低溫相伴隨，更可加重凍害的程度，在同樣低溫條件下，無風之地凍害輕，有風之地，風速愈大，凍害愈重。北方早春和冬季的大風，常常造成蘋果幼樹抽條死亡，加重果樹的冷旱傷害。(五)立地條件1、果樹的垂直分布愈高，氣溫愈低，愈容易發生凍害。2、谷地果樹比坡地更容易遭受輻射霜凍。3、山坡上向陽面如果白天的氣溫過高，反而不如背陰面安全。4、生長在海邊或湖泊附近的果樹，根系更容易遭受凍害。5、生長在沙礫土和砂土的果樹，冬季氣溫比較高，春季氣溫變化比較和緩，可以減少果樹受凍的機率和程度。二、耐寒力與果樹生長發育的關系

1、蘋果木質部和皮部的耐寒力與其生長發育的生理階段有關，不完全與一時的外界溫度有關。耐寒力的形成和消弱具有明顯的階段性和傾向性。如第二階段發育的總趨勢是接受鍛煉，提高耐寒力。第三階段發育的總趨勢是脫鍛煉，降低耐寒力。這是果樹植物長期適應季節氣候的結果。

2、一周年中，果樹生長發育的四個生理階段有明顯的節奏性，如果每個階段的生長發育正常，互相銜接合宜，便可以提高越冬性，達到安全越冬。如果某一個階段不能順利通過，便會影響下一個階段，依此類推，最終體現為越冬性下降。3、加強栽培管理技術，滿足果樹在各個階段的要求，對于提高果樹的耐寒力和安全越冬是有所作為的，也是必不可少的。三、凍害的類型及其表現

(一)嫩枝凍害發育不充實的嫩枝，或枝條先端的幼嫩部分，常遭受凍害。(二)大枝凍害粗大枝干的凍害常發生在深冬季節。最常見的一種枝干凍害稱作黑心。它的發展過程是每年在木質部的外圍(次生木質部)受凍，變褐色。如此年復一年，受凍組織逐漸擴大，顏色逐漸加深，而形成層可以繼續形成新木質部，把受凍部分包在里面，便形成黑心。(三)椏杈凍害受凍處皮層下陷或開裂，內部變黑色，組織死亡，嚴重時大枝死亡。椏杈凍害發生的原因，主要與其進入休眠晚，受低溫鍛煉程度差和抗寒力較低有關。(四)干裂干裂常發生在大樹的主干上，一般是沿主干縱向開裂，由于冬季晝夜溫差太大，主干組織內外漲力不均而致。干裂多發生在北方落葉果樹上，特別是寒地的蘋果和梨樹更為常見。

(五)根頸凍害與干基凍害根頸處皮部組織受凍變黑色，輕則局部變黑，重則形成黑環包圍干周，全樹死亡。在東北與西北干旱地區，幼樹常因根頸受凍成片死亡。根頸凍害的主要原因與其進入休眠較晚，而解除休眠較早有關。另外在接近地表