文獻研讀匯報匯報人：導師：時間：2014年12月12日IF:6.8152匯報內容研究背景材料方法實驗結果結果討論我的思考3研究背景TIR：Toll/Interleukin-1receptorNB：nucleotidebindingsiteLRR：leucine-richrepeatdomainsPCD：programmedcelldeath1.目前世界上的釀酒葡萄品種主要為歐洲種，而歐洲種為霜霉病和白粉病的易感品種。目前主要依賴農用化學品抗病，而依賴農用化學品抗病危害環境。通過轉基因的方法來獲取抗病基因并轉入感病植株是一種優良的辦法。2.圓葉葡萄具有抗霜霉病、抗白粉病、抗蟲害、高產和高品質的特點。可作為抗病基因來源。3.圓葉葡萄第12條染色體上有7個TIR-NBS-LRR類基因。有文獻指出植物（如擬南芥，萵筍）中這類基因為抗病基因。材料方法BAC：bacteriaartificialchromosome

1.圓葉葡萄和歐洲種葡萄的種間雜交植株部分可繁殖后代F1，F1經回交的后代BCs對霜霉病和白粉病具有抗性。2.以BC5:3294-R23為材料，構建BAC文庫，并從中篩選含有標記（CB314.315與CB292.294）的基因片段，在此基礎上進行后續功能驗證及其他研究。3.霜霉菌和白粉病病菌侵染植株后都會引起細胞程序性死亡（PCD），葉面產生壞死斑。實驗結果6RGAs物理定位圖RGAs抗白粉病功能驗證RGAs抗霜霉病功能驗證MrRUN1/MrRPV1核質分布5.MrRUN1和MrRPV1產生多個剪切片段RGA：resistancegeneanalog.抗病基因同源序列實驗結果1同源序列氨基酸一致性百分比(b)MrRGA的結構，包括TIR，NB，ARC和10-12個LRR，區別在于LRR的個數(c)預測的MrRGA蛋白的特征(d)同源序列氨基酸一致性百分比，均高于80％②TIR-NB-LRR類基因結構及同源性實驗結果1紅圈內的是編碼TIR-NB-LRR蛋白的基因,是候選基因

①MrRGAs遺傳圖和物理圖定位實驗結果2抗病葡萄ShirazCarignanTempranilloPortan①MrRGA基因抗白粉病的功能驗證轉RGA10葡萄農桿菌介導法將候選基因轉入易感葡萄Shiraz,Tempranillp,Portan,Maccabeu,Carignan中,以表皮細胞48hpostinoculation后PCD面積百分比為標準衡量？實驗結果2①MrRGA基因抗白粉病的功能驗證MrRGA10在其中四種易感葡萄相對高表達實驗結果2MrRUN1對白粉病病菌分離菌A的抗性MrRUN1對白粉病病菌分離菌B的抗性②MrRUN1對不同白粉病菌分離菌的抗性結論：MrRUN1對白粉病病菌分離菌A和B無抗性AB來源于紐約，分別為LNYM和NY137實驗結果2MrRUN1對白粉病病菌分離菌Musc4的抗性來源于Georgia②MrRUN1對不同白粉病病菌分離菌的抗性總結：對不同分離菌具有不同的抗性，研究中僅對白粉病病菌分離菌Musc4無抗性。結論：MrRUN1對白粉病病菌分離菌Musc4無抗性？實驗結果3①MrRGAs基因抗霜霉病的功能驗證用霜霉菌噴灑轉基因葡萄及抗病葡萄葉盤，用OIV（國際葡萄與葡萄酒組織）發病指數評價6dpi時的得病率，主要指標是孢子生成濃度和PCD面積。OIV得分5以上為抗霜霉病。抗病葡萄轉RGA8葡萄？實驗結果3①MrRGAs基因抗霜霉病的功能驗證通過孢子囊的生成情況進一步驗證MrRGA8的抗霜霉病性能，由圖中可以看出轉RGA8葡萄顯示出較強抗性結論：MrRGA8對霜霉病具有抗性實驗結果3①MrRGAs基因抗霜霉病的功能驗證結論：MrRGA8基因使得葡萄對霜霉病具有抗性，命名為MrRPV1hyp：hyphal菌絲生成實驗結果3②MrRPV1對不同霜霉菌分離菌的抗性MrRPV1對霜霉菌A抗性結論：MrRPV1基因使得葡萄對霜霉菌A具有抗性霜霉菌A來自于法國5實驗結果3②MrRPV1對不同霜霉菌分離菌的抗性MrRPV1對霜霉菌B抗性結論：MrRPV1基因使得葡萄對霜霉菌B有抗性霜霉菌B來源于北美實驗結果3②MrRPV1對不同霜霉菌分離菌的抗性MrRPV1對霜霉菌SL抗性結論：MrRPV1基因使得葡萄對霜霉菌SL有抗性總結：MrRPV1基因使得葡萄對不同分離菌都有抗性實驗結果4MrRUN1和MrRPV1在細胞中的分布由于NSL的存在，推測MrRUN1和MrRPV1蛋白分布在核中，用GFP結合MrRUN1蛋白和MrRPV1蛋白判斷其分布。可發現MrRUN1：GFP主要位于核中（圖b）；而MrRPV1：GFP在核質中均有分布（圖d）。但MrRUN1和MrRPV1中把保守結構域NLS從RKRRR變為RTSRR，分布就主要為質分布（圖c和e）。因此NSL可能是起作用的那部分。，實驗結果5通過克隆和測序證明基因由于不同的剪切機制轉錄成4種不同的轉錄本，每一種都有可能一種產物MrRUN1和MrRPV1產生多個剪切片段討論1盡管是對兩種不同的菌——霉菌和卵菌有抗性，MrRUN1/MrRPV1高度同源（86%氨基酸一致），區別僅僅在于LRR的個數不同。這并不是特例。有文獻指出，番茄中Rx/Gpa2類R基因（88%氨基酸一致）分別對病毒和線蟲有抗性。此外，不能排除其他五條全長度的MrRGAs可能單獨或是與其他基因如MrRUN1/MrRPV1一起具有抗病功能。MrRGAs遺傳圖和物理圖定位MrRGA基因抗白粉病的功能驗證抗病葡萄感病葡萄Portan，轉RGV10基因Portan感病葡萄Tempranillp，轉RGV10基因Tempranillp感病葡萄Shiraz，轉RGV10基因Shiraz討論：轉基因葡萄株系抗病性均不如抗病株系。這很可能是因為其他RGAs的存在使得BC5:3292-R23具有更強的抗白粉病性。討論2討論3MrRGA基因抗霜霉病的功能驗證問題：與抗白粉病相反，MrRPV1轉基因植株比BC5：3294-R23有更強的抗霜霉病性。why?查閱文獻進行后續研究。討論4MrRUN1/MrRPV1基因編碼的不同蛋白質在抗病或是在PCD信號傳導過程中起到不同的作用，主要是由于這些蛋白質在細胞中的分布不同，一部分在細胞核內，一部分在細胞質中。分布在細胞質中的蛋白質可能在cytoplasmiccelldeath過程中起作用。MrRUN1和MrRPV1在細胞中的分布討論5TIR-NB-LRR類基因需要全長的和截短的ORF（開放閱讀框）。煙草中的N基因和擬南芥中的RPS4基因在沒有截短的轉錄轉錄本的情況下就無法表現出完全的抗性。MrRUN1/MrRPV1基因轉錄編碼全長的蛋白質和3種推斷的截短的蛋白質，現在正在研究MrRUN1/MrRPV1基因轉錄成全長的cDNA的過程，并研究3種推斷的被截短蛋白質在抗病過程中的作用。MrRUN1和MrRPV1產生多個剪切片段我的思考文章亮點葡萄中第一個被驗證的抗病基因可以補充的地方1實驗中提到MrRU