制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用一、核酸的分離、提純和定量測定第1頁/共39頁真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/LNaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/LNaCl去除蛋白質：水飽和酚，氯仿異戊醇。DNA沉淀：0.3MNaAC-70%乙醇（一）DNA分離純化第2頁/共39頁制備RNA時，最重要的是使RNase滅活：①所有容器都要經過高溫處理，不能高溫高壓的用0.1％焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。②加入強變性劑（如胍鹽）使RNase失活；③在RNA的反應體系內加入RNase的抑制劑（如RNasin)（二）RNA的分離第3頁/共39頁（三）核酸含量的測定第4頁/共39頁2、定糖法

RNA：核糖→糠醛→→綠色物質（670-680nm）

DNA：脫氧核糖+二苯胺→蘭色物質（595-620nm）苔黑酚/地衣酚濃HCl濃硫酸1、紫外吸收法1個A～50μg/ml

雙鏈DNA

～40μg/mlRNA或單鏈DNA第5頁/共39頁3、定磷法核酸含磷量為9.5%1g磷相當于10.5g核酸4、瓊脂糖凝膠電泳溴乙錠能插入DNA分子的堿基對間形成復合物在紫外線照射下溴乙錠發橘紅色熒光熒光強度與DNA含量成正比第6頁/共39頁純DNA比值1.8，＜1.8Pr、苯酚污染純RNA比值2.0，<2.0DNA、Pr、苯酚污染（四）、核酸純度的測定OD260／OD280第7頁/共39頁二、核酸的沉降特性與超速離心

不同構象的核酸（線形、環形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用密度梯度離心可以將不同構象DNA、RNA與蛋白質區分開來第8頁/共39頁8MCsCl，45000rpm，16h密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml平衡時：浮力密度=CsCl密度=離心力ρ=ρ0+4.2ω2（r2-r02）×10-10ρ：浮力密度ω：角速度（弧度/秒）r：樣品到轉軸的距離（一）核酸密度的測定第9頁/共39頁G-C含量與DNA的浮力密度之間呈正比關系ρ=0.1xG-C+1.658xG-C=（ρ-1.658）×10

（二）測定DNA的G-C含量第10頁/共39頁RNA＞DNA變性DNA＞雙鏈DNA＞蛋白質，變性程度越大，浮力密度越大（三）研究核酸的構象第11頁/共39頁（四）用于核酸的制備超螺旋DNA或第12頁/共39頁用于大片段DNA的分離，精度低，但分離范圍廣。三、核酸的凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳第13頁/共39頁第14頁/共39頁用于小片段DNA的分析相對分子質量小于1000bp的DNA片斷和RNA的電泳。PAGE中一般不含RNase，用于RNA分析時不會分解樣品。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）第15頁/共39頁（一）DNA的酶法測定四、核酸的核苷酸序列測定第16頁/共39頁英國Sanger1955確定牛胰島素結構，1958獲諾貝爾化學獎1975設計出DNA測序法，1980獲諾貝爾化學獎合成一段與待測DNA序列互補的DNA片段群。

第17頁/共39頁第18頁/共39頁末端終止法——Sanger2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑。第19頁/共39頁第20頁/共39頁第21頁/共39頁MOV:MCB4.0\DideoxysequencingofDNA第22頁/共39頁DNA序列分析儀：四色熒光基團標記的dNTP第23頁/共39頁（二）DNA的化學法測序：由Maxam和Gilbert所發明。其基本原理是用特異的化學試劑作用于DNA分子中的不同堿基，然后用哌啶切斷反應堿基的多核苷酸鏈。用4組不同的特異反應，可使末端標記的DNA分子切成不同長度的片斷，其末端都是該特異的堿基。經變性膠電泳和放射自顯影得到測序圖譜

第24頁/共39頁4組特異的反應如下：（1）G反應：用硫酸二甲酯DMS使鳥嘌呤上的N7原子甲基化，加熱引起鳥嘌呤脫落，多核苷酸鏈可在此處斷裂（2）G+A反應：用甲酸使A和G嘌呤環上的N原子質子化，從而使其糖苷鍵變得不穩定，再用哌啶使鍵斷裂（3）T+C反應：用肼使T和C的嘧啶環斷裂，再用哌啶除去堿基（4）C反應：當有鹽存在時，只有C與肼反應，并被哌啶除去。嘧啶使修飾堿基脫落，并使去掉堿基的磷酸二酯鍵斷裂第25頁/共39頁

32P-GCTACGTA：在A處：32P-GCT和32P-GCTACGT在G處：32p，32p-GCTAC在C處：32P-G和

32P-GCTA在T處：32P-GC和32P-GCTACG第26頁/共39頁硫酸二甲酯（G）：*ACTTCG*ACTTCGACAG甲酸（G+A）：*A*ACTTCG*ACTTCGA*ACTTCGACA*ACTTCGACAG肼/Nacl（C）：*AC*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG

肼（C+T）：*AC*ACT*ACTT*ACTTC*ACTTCGAC*ACTTCGACAG從下往上讀：CTACGTA，末端G不能讀出。32P*ACTTCGACAG第27頁/共39頁（三）RNA的測序

RNA的測序方法有3個：（1）用酶特異切斷RNA鏈：（2）用化學試劑裂解RNA（3）逆轉錄成cDNA第28頁/共39頁1995年K.Mullis發明。基本步驟為：1.設計一對引物以便有效擴增所需要的DNA序列，并盡量減少可能產生的非特異產物2.優化反應體系：包括適量模板、引物、4種dNTP、TaqDNA聚合酶和適量Mg2+五、DNA聚合酶鏈式反應（PCR）第29頁/共39頁3.選擇3個溫度進行熱循環：變性94℃，45－60s；退火，根據引物的Tm，1min；延伸，72℃，1min。循環4.擴增完成后取出一定量的反應產物，檢測擴增結果：先進行凝膠電泳，用溴化乙啶染色，紫外光下檢測結果第30頁/共39頁y=產物；x=擴增效率；n＝循環次數第31頁/共39頁(c)(b)引物25’3’3’3’5’5’(d)新引物5’3’靶DNA的擴增(a)5’3’引物13’5’3’5’引物2互補鏈引物1互補鏈單位長度的鏈不同長度的鏈5’3’3’5’引物1互補鏈引物2互補鏈目的片段（不同長度的鏈未示出）聚合酶鏈式反應示意圖(e)(f)(g)第32頁/共39頁溫度（℃）時間（min）94726094℃變性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循環1循環2循環3PCR反應的溫度循環周期如此周而復始，重復進行，直至擴增產物的數量滿足實驗需求為止。第33頁/共39頁①模板DNA（單鏈）②引物③DNA聚合酶（Taq）④dNTP⑤Mg2+MOV:MCB4.0\POLYMERASECHAINREACTION第34頁/共39頁六、DNA