第十三章

基因工程和分子生物學常用技術GeneticEngineeringand

ThePopularTechnologyInMolecularBiology第1節基因工程與基因重組GeneticEngineeringandrecombination一、基因工程的概念基因工程是將各種來源（內、外）的原核、真核、天然或人工方法獲得目的基因，在體外與載體基因重組后，導入適當的宿主細胞，DNA重組體隨著細胞增殖而擴增，再通過基因表達得到大量目的基因片段（分子克隆，clone）的技術。基因工程技術是把不同來源的目的基因和載體DNA分子重新組合，故亦稱為重組DNA技術。基因工程四要素1.目的基因2.工具酶3.載體4.受體細胞重要的工具酶

（1）限制性核酸內切酶（Restrictionendonuclease）發現：

1968年，沃納·阿爾伯博士在研究噬菌體的遺傳現象時碰到一個奇怪的現象，當新的大腸菌感染了噬菌體時，有的噬菌體開始繁殖，有的卻根本不繁殖。他決定先研究這種“限制性噬菌體感染現象”，第一次從大腸桿菌中提取出了限制性內切酶，為此獲1978年諾貝爾生理學醫學獎。限制酶能在DNA上尋找特定的切點，將DNA分子的雙鏈交錯地切斷。因此限制性內切酶又稱為“分子剪刀”，可以完整地切下個別基因。目前人們已經分離提取了400多種“分子剪刀”，可以隨心所欲地進行DNA分子長鏈的切割。

沃納·阿爾伯博士1.限制性核酸內切酶概念、特點識別DNA的特異序列并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類核酸水解酶。是基因工程“分子刀”。特點：*切割DNA多聚核苷酸鏈中磷酸二酯鍵*具有回文結構特征5′???GAATTC???3′3′???CTTAAG???5′2.限制性核酸內切酶識別序列與切割產物限制性核酸內切酶識別序列及切割位點切割產物形成末端EcoRⅠ3’黏性末端PstⅠ5’黏性末端NruⅠ平末端5’…G↓AATTC…3’5’…GAATTC…3’3’…CTTAA↑G…5’3’…CTTAAG…5’5’…CTGCA↓G…3’5’…CTGGAG…3’3’…G↑ACGTC…5’3’…GACGTC…5’5’…AG↓CT…3’5’…AGCT…3’3’…TC↑GA…5’3’…TCGA…5’注：具有黏性末端的DNA分子更容易結合進載體DNA分子中。（2）DNA聚合酶（DNApolymerase）以DNA為模板，dNTP為原料，RNA作引物，從引物的3’-末端或切口3’-末端沿5’→3’方向延長核苷酸鏈。該酶具有3’→5’或5’→3’核酸外切酶活性。基因工程主要應用E.coliDNA聚合酶Ⅰ、T4DNA聚合酶和TaqDNA聚合酶等。（3）DNA連接酶（DNAligase）

1976年，科學家在5個實驗室里幾乎同時發現并提取出一種酶，這種酶可以將兩個DNA片段連接來，修復好DNA鏈的斷裂口。這種酶叫作DNA連接酶，是名符其實的“縫合”基因的“分子針線”。只要在用同一種“分子剪刀”剪切的兩種

DNA碎片中加上“分子針線”，就會把兩種DNA片段重新連接起來。慢病毒環繞雙鏈DNA的DNA連接酶（彩色部分）載體

能夠攜帶外源DNA片段進入受體細胞進行擴增和表達的運載工具。其化學本質是DNA。易進入宿主細胞，并能在體內繁殖。具有多克隆位點，易插入外源基因。有可供選擇的遺傳標記，能夠進行篩選。易從宿主細胞中分離純化。

常用載體：質粒、噬菌體、黏粒、病毒。理想載體的選擇標準1.質粒(plasmid)基因工程中最常見的載體。是細菌中獨立于染色質以外的、能自主復制的環狀雙鏈DNA。通常質粒的大小為2～300kb。一般只能容納10kb的外源DNA片斷。外源DNA片斷越長，越難插入和穩定。2.噬菌體(bacteriophage，phage)寄生于細菌體內，并能溶解細菌細胞。具有溶菌性和溶原性兩種不同的繁殖方式。λ噬菌體兩種生長途徑（示意圖）3.黏粒(cosmid)黏粒是將λ噬菌體的cos區與質粒組合的裝配型載體。黏粒本身約4～6kb，可克隆DNA大片段，可用作建立真核基因組文庫的載體。4.病毒病毒載體更多地用于真核表達系統，如腺病毒、痘病毒、反轉錄病毒和猴空泡病毒。重組DNA技術的原理和工程DNA重組包括下列五個過程。1.制備目的基因2.目的基因與載體的連接3.將外源DNA或重組體導入受體細胞。4.目的基因的篩選和鑒定。5.克隆基因的表達。 1.目的基因的制備1）制備基因組DNA文庫

使用相同載體的一組基因的克隆。所有被克隆的DNA分子能表示整個生物的基因組。

有質粒文庫、黏粒文庫、噬菌體文庫、酵母人造染色體文庫。2）制備cDNA文庫（3）聚合酶鏈反應(PCR)在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等條件下，體外經94℃變性、54℃退火及72℃延伸3個步驟的反復多次循環（2530次），擴增目的基因。（4）化學合成基因2、目的基因與載體的連接——基因工程的核心（主要有以下4種連接方式）1)粘性末端連接2）平頭末端連接3）人工接頭法4）同源多聚尾連接法3、重組DNA導入宿主細胞轉化：以質粒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程；感染：以病毒作載體構建的重組體導入受體細胞的過程4.重組DNA的篩選與鑒定：遺傳學、免疫學、分子雜交等5.克隆基因的表達基因工程的最終目的是通過載體將外源基因導入合適的宿主細胞中高效表達，產生有重要價值的蛋白質產品。基因工程的主要步驟二、基因診斷和基因治療（一）基因診斷（DNAdiagnosis）基因診斷是采用分子生物學的技術方法直接檢測與分析基因的結構（DNA）及其表達水平（RNA）是否正常，從而對疾病做出診斷的方法。

1.基因診斷特點：特異性強靈敏度高（選用特定基因序列作為探針，單拷貝基因采用高度擴增PCR技術）診斷范圍廣（可檢測正在生長的病原體或潛在病原體）。能對疾病早期進行診斷直接對表型疾病作出診斷，還可能發現潛在的致病因素，如:確定有遺傳病家族史的人攜帶致病基因。2.基因診斷的應用1）病原微生物的侵入：病原體：病毒、支原體、細菌、寄生蟲。當無抗體時，基因診斷成為唯一手段。2）先天性遺傳疾病：遺傳性疾病。發病原因為特定基因突變。3）惡性腫瘤研究：個別細胞基因突變而引起的細胞無限增殖.（包括抑癌基因和癌基因）3.基因診斷的基本原理與方法

基因診斷的原理：用已知的核苷酸序列測定未知的核苷酸序列。基因診斷主要方法：核酸分子雜交、PCR技術、DNA序列測定、幾種技術手段聯合應用等α-地中海型貧血癥（病例）

一對夫妻第一胎生一男孩，經診斷為重型α-地中海型貧血癥，即HbHart’s胎兒水腫綜合癥。為常染色體隱性遺傳病。妻子又懷孕，夫妻想知道胎兒是否正常發育，欲做產前診斷。專家運用限制性內切酶BamHI和BglⅡ分別酶切孕婦的外周血和胎兒絨毛組織DNA，經瓊脂糖凝膠電泳分離后，進行Southern印跡轉移后，再用32P標記的α-珠蛋白基因探針進行雜交。分析所得酶譜，檢測結果該胎兒為α-地中海貧血。（二）基因治療（genetherapuy)狹義的基因治療是指用完整的基因進行基因替代治療，是對缺陷的基因進行修復、矯正，或以正常功能的基因置換或增補缺陷基因的方法。治療途徑屬于體外（exvivo）基因治療。廣義的基因治療是指利用基因藥物的治療，是一種基于導入遺傳物質以改變患者細胞的基因表達，從而達到治療或預防疾病的新措施。治病途徑屬于體內（invivo）基因治療。

基因治療總策略1.直接補替缺陷基因；2.抑制非正常基因產物表達；3.間接調節機體本身免疫系統的抗病能力；4.利用外源基因對病變細胞造成特異性殺傷。

基因治療方法：①基因矯正（genecorrection）：即對缺陷基因的異常序列進行精確原位修復。②基因置換（genereplacement）：以正常功能基因原位置換異常基因，不涉及基因組的任何改變。③基因增補（geneaugmentation）：不去除異常基因，而是通過外源基因的導入，使其表達正常產物，從而補償缺陷基因的功能。④基因失活（geneinactivation）：有些基因異常過度表達，如癌基因或病毒基因可導致疾病，可用反義核酸技術、核酶或誘餌轉錄因子來封閉或消除這些有害基因的活性表達。基因療法最重要的問題：理想載體的選擇

安全無毒害；不引起免疫反應；高濃度或高滴度；能高效轉移外源基因；持續有效表達外源基因；可靶向特定組織細胞；可調控；容納外源基因可大可小；可供體內注射（包括全身性靜脈注射）；便于規模生產供臨床應用。

基因工程技術在分子醫學上的應用：①發現疾病基因。確定克隆基因在分子遺傳病中的作用。②發展生物制藥。利用重組DNA技術生產有藥用價值的蛋白質、多肽產品。己經或正投入市場的基因工程產品有胰島素、生長素、促紅細胞生成素等。③基因診斷。④基因治療。⑤遺傳病的防治。利用基因工程技術可進行產前診斷、攜帶者測試、癥候前診斷、遺傳病易感性診斷等。第2節分子生物學常用技術

（一）概念用已知堿基的核酸序列作探針，檢測待測樣品中是否存在與探針互補的同源核苷酸序列的方法。

一、核酸分子雜交技術（nucleicacidhybridization）分子雜交的雙方：1、特異標記的探針。2、待測的核苷酸序列。核酸探針的概念：是指用放射性核素、生物素等活性物質標記的，能與特定核酸序列發生特異性互補的已知DNA或RNA片段。理想探針的選擇方案①必須為單鏈結構；②高度特異性，只與靶核苷酸序列雜交；③高度靈敏性；④標記物與探針結合后，決不能影響其堿基配對，及探針分子的理化性質；⑤一般探針越長，雜交作用越強，專一性越強。但小片段探針雜交速率快。⑥環境污染小，價格低。探針種類：基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、及人工合成的寡核苷酸探針等。（二）核酸分子雜交方法DNA印跡雜交（Southernblot）RNA印跡雜交（Northernblot）斑點及狹縫印跡雜交（Dot-blot）原位雜交(situhybridization)1.Souhern印跡雜交將電泳分離的待測DNA片段轉印并結合到一定的固相支持物上，再用標記的DNA探針檢測待測DNA的方法。主要檢測經凝膠電泳分離并轉移到膜上的DNA分子。Southern印跡雜交的基本過程：①待測核酸樣品的制備；②待測DNA樣品的電泳分離；③凝膠中核酸的變性（堿變性)；④Southern印跡Southern印跡法可用于克隆基因的酶切圖譜分析，檢測特異的DNA序列片斷、基因定位、分子量測定等，在分子克隆、遺傳病診斷、腫瘤研究、器官移植等方面發揮作用。

1975年,Southern印跡雜交（Southernblot）由英國人埃德溫·邁勒·薩瑟（EdwinMellorSouthern）創建。

Southern印跡雜交顯色圖片2.Northern印跡雜交

原理

Northern印記雜交亦稱為Northernblot，用于鑒別RNA的雜交。雜交的受體是RNA，探針可用DNA或RNA片段。其基本原理是將待測的RNA從瓊脂糖凝膠中轉印到硝酸纖維素膜上，再與標記的探針進行固-液相雜交。3.斑點及狹縫印跡雜交

斑點雜交直接將變性的DNA或RNA樣品點樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上使之成為斑點，再與探針進行雜交。斑點印跡為圓形，狹縫印跡為線狀。4.原位雜交（insituhybridization）

核酸保持在細胞或組織切片中，經適當方法處理細胞或組織后，將標記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交的方法。二、聚合酶鏈反應（PCR)（一）概念聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction，PCR），又稱無細胞克隆技術(freebacteriacloningtechnique)，是一種對特定的DNA片段在體外進行快速擴增的技術。通過PCR技術，可以簡便快速地從微量生物材料中，以體外擴增的方式獲得大量特定的核酸序列。（二）PCR的工作原理

PCR是體外酶促反應，依據DNA復制為理論基礎。PCR反應體系：1.耐熱DNA聚合酶

（taqDNA聚合酶）常用從嗜熱水生菌分離出來的taqDNA聚合酶，在95℃高溫下依然有活性，最適溫度為70℃～80℃，不會在熱變性中失活，具有5’→3’聚合酶活性，5’→3’外切酶活性。2.DNA模板

微量待擴增的DNA片段，由組織細胞提取、mRNA反轉錄及人工合成。3.寡聚核苷酸引物根據被擴增的DNA兩側序列而人工合成，通常為20個堿基對左右。4.dNTP原料。即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，PCR操作時，4種dNTP必須以等摩爾配制，以降低出錯機率。5.含Mg2+的緩沖液

Mg2+是DNA聚合酶活性所必須的激活劑。PCR的基本步驟：1.高溫變性

高溫95℃，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板。變性時間30s。2.低溫退火

將反應液溫度迅速降至低溫（37～55℃），兩條人工合成的寡核苷酸引物與單鏈DNA模板鏈互補結合，形成部分雙鏈。退火時間30s。3.適溫延伸在最適溫度（72℃）下，TaqDNA聚合酶以引物3’-OH末端為合成的起點，催化4種dNTP沿模板5’→3’方向合成DNA新鏈。延伸時間約1.5min。所合成的DNA片段又可作為下一輪熱變性的模板。經過25～30個循環后，理論上可使基因擴增109倍以上。聚合酶鏈反應的基本步驟PCR技術具有簡單快捷、高度靈敏性和特異性，在病原體檢測與治療、遺傳及優生優育、腫瘤基因檢測、免疫檢測、司法鑒定等領域有重要應用。三、DNA芯片技術

DNA芯片（DNAchip）技術隸屬于生物芯片技術。DNA芯片通過微加工技術，將數以百萬計特定序列的DNA片段（基因探針）有規律地排列，固定于2cm2的硅片、玻片等固相支