菠菜actin基因片段的克隆植物基因組DNA提取DNA的PCR擴增及其產物回收DNA與載體的連接和轉化是基因工程中最基本的操作技術主要包括以下實驗技術：基因工程狹義：人工創(chuàng)造DNA分子新組合的技術（即重組DNA技術）廣義：重組DNA技術及其產業(yè)化設計和應用，包括上游技術和下游技術兩大部分。上游技術是指重組DNA技術；下游技術則涉及到基因工程菌或基因工程細胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因表達產物的分離和純化，動、植物轉基因等DNA重組微生物發(fā)酵分離、提純產品生物反應器狹義轉基因廣義+提取DNA篩選文庫/PCR連接載體細胞DNA載體重組載體宿主擴增（基因）酶切基因基因轉化+上游技術下游為基因測序和其它研究和應用準備高質量的基因片段。YourTextYourTextYourTextPCR及檢測連接轉化篩選實驗流程及原理YourText回收鑒定YourText測序DNA提取及檢測產物回收等引物…………….....……………………..……5’-3’--3’-5’

引物設計正向引物(Forward)→←反向引物(Reverse)正向引物：TCATTCTCTGATCCGTGCAG1.對引物的一般要求

(1)長度一般為18-27nt(2)GC含量為40-60%(3)引物在模板內沒有其它高度相似的序列

(4)引物間和引物內不形成二聚體及發(fā)夾結構

(5)引物之間的Tm值應基本相同（

Tm估計值與計算方法有關）

(6)3’端避免出現(xiàn)3個及以上連續(xù)的相同堿基反向引物：AGGCAAGCTTTTCCTTCACA3.引物設計工具（1）引物設計軟件

Oligo6.44

PrimerPremier

5.0

Dnastar（2）網上引物設計工具

Primer3

/primer3/input.htm2.

DNA序列的來源

（1）查詢序列數(shù)據(jù)庫（2）查閱科技文獻（3）測序TheNationalCenterforBiotechnologyInformation（http://www.ncbi.）例1：查詢Spinaciaoleraceaactingene序列2023/2/1/primer3/input.htm例2：利用Primer3設計引物①復制和粘貼DNA序列①②②③②勾選所需的引物③獲取引物

連接Taq酶能夠在PCR產物的3’末端加上一個非模板依賴的A；

T載體是一種帶有3’T突出端的載體；在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR產物直接插入到質粒載體的多克隆位點（MCS）中。

高效克隆PCR產物（TACloning）的專用載體

轉化細胞經過一些特殊方法如電擊法,化學試劑法（CaCl2)等的處理后,細胞膜的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態(tài)細胞。3、鑒定--

α-互補質粒載體帶有一個大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點（MCS），它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。宿主細胞存在可編碼β-半乳糖苷酶C端部分的序列。它們同時存在時，能恢復lacZ酶的活性，稱為α-互補。在誘導劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落，因而易于識別。當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。Yo